1、生物技术教研室：郑 鸣 诊断主要通过引物介导特异性扩增目的基因以检测内源性或外源性目的基因的存在与否，进而对疾病的预防、诊断、和治疗提供信息和决策依据。一 诊断技术原理相关实验开展相关实验开展一 诊断技术原理二 技术基本知识回顾p 技术简史 p 的原理技术简史的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长技术简史的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCG
2、ACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物技术简史的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3聚合酶聚合酶技术简史的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可
3、克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了技术简史的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 年美国杂志列 为十余项重大科学发明之首,比喻年
4、为爆炸年荣获年度诺贝尔化学奖。只是一个简单的不起眼玩艺。凯利穆利斯（)我不认为能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。它的发明并没有改变基因操作的本质。有了，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受。它只不过是一种新工具。凯利穆利斯（)生物样品生物样品片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究基因组获取特定片段扩增特定片段聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶引物引物的构思聚合酶聚合酶特定DNA片段变性退火延伸 聚合酶（)酶活性()温度()循环的基本原理反应条件过程的特点标准的标准的PCRPCR反
5、应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（）的基本原理反应条件过程的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复步轮目的片段扩增万倍以上双螺旋单链与引物复性变性形成条单链子链延伸加倍反应条件过程的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板95反应条件过程的特点50引物引物D
6、NA引物反应条件过程的特点72引物引物DNA引物酶酶反应条件过程的特点第轮结束95第轮开始反应条件过程的特点955072反应条件过程的特点72第轮结束反应条件过程的特点模板第轮扩增第轮扩增第轮扩增第轮扩增第轮扩增的基本原理反应条件过程的特点灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌特异性高 引物的特异性。引物延伸时，碱基配对的正确性。Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域，扩增产物的特异性程度就更高。的基本原
7、理反应条件过程的特点简便、快速 整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成，过程也只是简单的温度变化，耐高温的Taq DNA聚合酶的应用，避免了DNA聚合酶的反复加入。一次性加好反应液，24 小时完成扩增对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA引物设计引物设计分离核酸分离核酸三 反应体系基本组份目前有两种 聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的 反应约需酶量（指总反应体积为 时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少酶（）（）的质量与浓度和 扩增效率有密切关系呈颗粒状，保存不当易变性失活溶液呈酸性，使用时应配成高
8、浓度后，以 或 的缓冲液将其调节到，小量分装，冰冻保存。多次冻融会使降解在反应中，应为，尤其是注意种的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低产物的产量 能与结合，使游离的浓度降低 是聚合酶的激活剂。反应体系。浓度过低会使酶活性丧失、产量下降；过高影响反应特异性。可与负离子结合，所以反应体系中、等的浓度影响反应中游离的浓度。引物（）引物是特异性反应的关键；产物的特异性取决于引物与模板互补的程度；理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用就可将模板在体外大量扩增。引物设计是 技术中至关重要的一环，使用
9、不合适的 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带，不出带或出带很弱，等等。现在 引物设计大都通过计算机软件进行。引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体（）或发夹结构（）引物不能在模板的非目的位点引发 聚合反应(即错配)。引物（）引物长度（）产物长度（）序列 值()引物与模板形成双链的内部稳定性(,用 值反映)形成引物二聚体()及发夹结构（）的能值 在错配位点（）的引发效率，引物及产物的 含量（）引物（）u引物的长度：一般为，常用的是，但不应大于，因为过长会导致其延伸温度大于，即 酶的最适温度。u引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于是必要的（不容
10、易引起错配）。u 例如：一个长度为的引物在人类基因组上存在个潜在的退火位点().而一个长度为的引物在人基因组上存在的退火位点只有个.u较长的引物（)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点。引物（）引物设计的一般原则引物（）引物设计的一般原则u引物的值u 引物的值一般控制在度,尽可能保证上下游引物的值一致,一般不超过度.如果引物中的含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.u 经验公式：()()（）u :最近邻位（）引物（）引物设计的一般原则u 引物序列的含量u 一般为，以为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的 含量偏低或偏高，导致引物的含量不能
11、在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的 含量以及 值保持接近（上下游引物的含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果比例超出，则在引物的端增加或；而如果比例过高，则同样在端增加或。u 引物端的序列要比端重要u 引物端的碱基一般不用（端碱基序列最好是、），因为在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致反应失败。端序列对 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。引物（）引物设计的一般原则u引物序列在模板内应当没有相似性较高、尤其是端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物端出现 个以上的连续碱基，如 或，也会使错误引发机率增加。u引物的特异性：u 引
12、物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物（）引物设计的一般原则u 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高。u 错误引发的引发率一般不要高过，如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为 以上，而在错误位点的引发效率为，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。引物（）引物设计的一般原则u值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。u 一般情况下，引物的值最好呈正弦曲线形状，即端和中间值较高，而端值相
13、对较低，且不要超过（值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引物的端的 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 聚合反应。（能值越高越容易结合）引物（）引物设计的一般原则u 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致 正常反应不能进行。u 与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，端的连续 或 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其为 的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了
14、参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在末端对反应就没有多大的影响了。u引物（）引物设计的一般原则 （引物评价）*（自动搜索）*（在线服务）*引物（）引物设计的常用软件主要功能:引物设计限制性内切酶位点分析 基元()查找同源性分析根据氨基酸序列来设计引物引物 提供了种生物遗传密码使用的偏好选择、纤毛虫大核（）、无脊椎动物线粒体（）、支原体（）、植物线粒体（）、原生动物线粒体（）、一般标准（）、脊椎动物线粒体（）、酵母线粒体（）启动界面 种密码子偏好 引物类型搜索模式引物位置范围引物位置范围产物大小范围引物长度对引物引物分值分为满分每对引物的信息双击选中一对引物回到主窗口引物及产物信息是否出现
15、 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏都，:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，形成二聚体的能值，引物端有无配对碱基(最好没有)。:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过。:如果模板不是基因组，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其端）是否与特定模板的其他位点结合。：总结性的显示引物位置，产物大小，值等参数，你可以横向比较一下，主要功能：专门的引物设计和分析软件 为邻近至个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。值曲线
16、以选取到的下降形状有利于引物引发聚合反应。曲线宜选用端 值相对较低的片段。值在端和中间值比较高，而在端相对低。上游引物下游引物只是示意图首先检查引物二聚体尤其是端二聚体形成的可能性。二项检查是发夹结构（）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。第三项检查为 含量，以为宜。第四 检查 :这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，主要是看引物端有无配对碱基(最好没有)。形成的二聚体要看能值，能值越低越好，最好不要超过:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过。如果引物中加入酶切位点，可能会有发夹结构且能值不会太低，这就需要灵活控
17、制退火温度了。:分析上下游引物的碱基组成，比和值，原则我就不多说了。:如果模板不是基因组，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其端）是否与特定模板的其他位点结合。一般错配的引发效率以不超过为好，但并不绝对，如果正确结合位点的引发效率为以上，而有一个错配的引发效率是左右的，这个引物也是可以接受地！：总结性的显示引物位置，产物大小，值等参数，你可以横向比较一下，尤其是给了一个 还是可以参照一下地。也给了简单的评价供参考。每条引物的浓度 或，以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。引物（）引物浓度核酸核酸 单、双链
18、均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、聚合酶抑制剂、结合蛋白类。浓度一般为，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于扩增。模板核酸的量与纯化程度，是成败与否的关键环节之一。n 分离核酸的基本步骤和原则尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。制备细胞及破碎细胞 消化蛋白质,去除生物大分子 去除不需要的核酸分子 沉淀核酸,去除杂质基本步骤：基本原则：蛋白酶法的基本原理是一种阴离子去垢剂，在高温（）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白酶降解核蛋白，释放出核酸；提
19、高盐(或)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的用酚氯仿反复抽提除去蛋白质用无水乙醇沉淀水相中的。组组 份份（）（）（）蛋白酶蛋白酶终浓度终浓度 蛋白酶法提取缓冲液n 动物性材料的分离提纯n 蛋白酶法动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液 蛋白酶法基本流程蛋白酶法基本流程n 动物性材料的分离提纯n 蛋白酶法n 动物性材料的分离提纯n 蛋白酶法 蛋白酶法主要试剂蛋白酶法主要试剂组织匀浆缓冲液：组织匀浆缓冲液：消化缓冲液：消化缓冲液：缓冲液：缓冲液：其他试剂：其他试剂
20、：平衡酚平衡酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇 氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇 蛋白酶储存液：蛋白酶储存液：储存液：储存液：()()：无水乙醇无水乙醇n 动物性材料的分离提纯n 蛋白酶法 蛋白酶法实验步骤蛋白酶法实验步骤 样品处理：样品处理：取相应组织，剪碎，加入组织匀浆缓冲液，置于组织研磨器中进行研磨，取相应组织，剪碎，加入组织匀浆缓冲液，置于组织研磨器中进行研磨，形成匀浆液；形成匀浆液；取匀浆液转入离心管，离心，弃上清；取匀浆液转入离心管，离心，弃上清；向沉淀中加入组织匀浆缓冲液，迅速重悬后，离心，弃上清；向沉淀中加入组织匀浆缓冲液，迅速重悬后，离心，弃上清；向沉淀中加入无菌水，迅速重悬后，再加入消化缓
21、冲液，混匀后进行下一步向沉淀中加入无菌水，迅速重悬后，再加入消化缓冲液，混匀后进行下一步操作。操作。n 动物性材料的分离提纯n 蛋白酶法 蛋白酶法实验步骤蛋白酶法实验步骤 提取提取向上述悬液中加向上述悬液中加 ，蛋白酶（），蛋白酶（）,温和地上下颠倒混匀次，于温和地上下颠倒混匀次，于水浴水浴消化或消化过夜，其间应不时温和地上下颠倒混匀液体；消化或消化过夜，其间应不时温和地上下颠倒混匀液体；加入酶（），加入酶（），水浴消化；水浴消化；向消化液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，温和地上下颠倒混匀次，向消化液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，温和地上下颠倒混匀次，室温放置；室温放置；室温离心（若分层效果
22、不好可适当延长时间）；室温离心（若分层效果不好可适当延长时间）；用宽口吸头小心移取上清，注意不要取中间白色层；用宽口吸头小心移取上清，注意不要取中间白色层；加入等体积的氯仿：异戊醇，温和地上下颠倒混匀次，室温放置；加入等体积的氯仿：异戊醇，温和地上下颠倒混匀次，室温放置；室温离心（若分层效果不好可适当延长时间）；室温离心（若分层效果不好可适当延长时间）；提取提取用宽口吸头小心移取上清，注意不要取中间白色层（若上清仍混浊，可再重用宽口吸头小心移取上清，注意不要取中间白色层（若上清仍混浊，可再重复抽提次）；复抽提次）；向上清中加入体积的，温和地充分混匀，再向溶液中加入倍体积的无水乙醇，向上清中加入
23、体积的，温和地充分混匀，再向溶液中加入倍体积的无水乙醇，室温放置或室温放置或放置以上；放置以上；室温离心，弃上清；室温离心，弃上清；向沉淀中加入的乙醇，温和地上下颠倒混匀次；向沉淀中加入的乙醇，温和地上下颠倒混匀次；室温离心，弃上清；室温离心，弃上清；将离心管轻轻在滤纸上磕几下，以除去残留的液体，短暂离心后用吸头小心取将离心管轻轻在滤纸上磕几下，以除去残留的液体，短暂离心后用吸头小心取出残留液体出残留液体,之后将离心管敞口室温放置左右或在之后将离心管敞口室温放置左右或在放置左右至无明显的乙放置左右至无明显的乙醇气味即可；醇气味即可；向沉淀中加入的无菌水或溶液溶解样品。向沉淀中加入的无菌水或溶液
24、溶解样品。n 动物性材料的分离提纯n 蛋白酶法 蛋白酶法实验步骤蛋白酶法实验步骤法原理（，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：溶液在低于 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于。n 植物性材料的分离提纯n 法 组份组份 （）（）（）（）巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 ()（）使用前（）使用前加入加入（）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；螯合或离子，抑制活性；提供一个高盐环境，使充分溶解，存在于液相
25、中；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 提取缓冲液的经典配方n 植物性材料的分离提纯n 法 组份组份 （）（）（）（）巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 ()()（）使用前（）使用前加入加入（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。提取缓冲液的改进配方n 植物性材料的分离提纯n 法植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液法基本流程n 植物性材料的分离提纯n 法法主要试剂n 植物性材料的分离提纯n 法抽提液：
26、抽提液：（)()()巯基乙醇巯基乙醇(用前加入用前加入)()()(可以不用可以不用)缓冲液：缓冲液：其他试剂：其他试剂：平衡酚平衡酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇 氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇 储存液：储存液：()()：无水乙醇无水乙醇 样品处理：样品处理：取植物叶片，剪碎，加入取植物叶片，剪碎，加入 预热的抽提液，置于组织研磨器中进行研磨，预热的抽提液，置于组织研磨器中进行研磨，形成匀浆液，分装离心管，每管，置形成匀浆液，分装离心管，每管，置水浴锅中水浴裂解；水浴锅中水浴裂解；或者或者取植物叶片，剪碎，置于液氮预冷的研钵中，加入适量液氮，轻轻研磨至取植物叶片，剪碎，置于液氮预冷的研钵中，加入适量液氮，
27、轻轻研磨至粉末（注意不要使粉末解冻，其间可反复添加液氮），将粉末转入离心管，粉末（注意不要使粉末解冻，其间可反复添加液氮），将粉末转入离心管，加入加入 预热的抽提液，置预热的抽提液，置水浴锅中水浴裂解；水浴锅中水浴裂解；注意：水浴期间应不时上下颠倒混匀，动作要轻柔，以免断裂。注意：水浴期间应不时上下颠倒混匀，动作要轻柔，以免断裂。法实验步骤n 植物性材料的分离提纯n 法 提取提取向消化中加入酶（），向消化中加入酶（），水浴消化；水浴消化；向消化液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，温和地上下颠倒混匀次，向消化液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，温和地上下颠倒混匀次，室温放置；室温放置；室温离心（若分
28、层效果不好可适当延长时间）；室温离心（若分层效果不好可适当延长时间）；用宽口吸头小心移取上清，注意不要取中间白色层；用宽口吸头小心移取上清，注意不要取中间白色层；加入等体积的氯仿：异戊醇，温和地上下颠倒混匀次，室温放置；加入等体积的氯仿：异戊醇，温和地上下颠倒混匀次，室温放置；室温离心（若分层效果不好可适当延长时间）；室温离心（若分层效果不好可适当延长时间）；法主要试剂n 植物性材料的分离提纯n 法 提取提取用宽口吸头小心移取上清，注意不要取中间白色层（若上清仍混浊，可再重用宽口吸头小心移取上清，注意不要取中间白色层（若上清仍混浊，可再重复抽提次）；复抽提次）；向上清中加入体积的，温和地充分混
29、匀，再向溶液中加入倍体积的无水乙醇，向上清中加入体积的，温和地充分混匀，再向溶液中加入倍体积的无水乙醇，室温放置或室温放置或放置以上；放置以上；室温离心，弃上清；室温离心，弃上清；向的乙醇，温和地上下颠倒混匀次；向的乙醇，温和地上下颠倒混匀次；室温沉淀中加入离心，弃上清；室温沉淀中加入离心，弃上清；将离心管轻轻在滤纸上磕几下，以除去残留的液体，短暂离心后用吸头小心取将离心管轻轻在滤纸上磕几下，以除去残留的液体，短暂离心后用吸头小心取出残留液体出残留液体,之后将离心管敞口室温放置左右或在之后将离心管敞口室温放置左右或在放置左右至无明显的乙放置左右至无明显的乙醇气味即可；醇气味即可；向沉淀中加入的
30、无菌水或溶液溶解样品。向沉淀中加入的无菌水或溶液溶解样品。法主要试剂n 植物性材料的分离提纯n 法I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中n 基因组的提取注意事项基因组的提取注意事项基本步骤：基本步骤：最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融冻融提取血液基因组时，要选择有核细胞（白细胞）提取血液基因组时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成降解组培细胞培养时间不能过长，否则会造成降解含病毒的液体材料含量较少，提取前先富集含病毒的液体
31、材料含量较少，提取前先富集材料应适量，过多会影响裂解，导致量少，纯度低材料应适量，过多会影响裂解，导致量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡.破碎细胞或包膜破碎细胞或包膜采用吸附材料吸附的方式分离时，应提供相应的缓采用吸附材料吸附的方式分离时，应提供相应的缓冲体系冲体系采用有机（酚氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要采用有机（酚氯仿
32、）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法杂质的方法.核酸分离、纯化核酸分离、纯化蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚氯仿抽提酚氯仿抽提使用变性剂变性（、异硫氰酸胍等）使用变性剂变性（、异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理.核酸分离、纯化核酸分离、纯化多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入体积的入体积的 ，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖
33、降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(体积体积)，氯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用代替乙醇沉淀：在用代替乙醇沉淀：在 液中加入液中加入 (含含 )，冰浴。，冰浴。.核酸分离、纯化核酸分离、纯化多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：巯基巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如、加入易与酚类结合的试剂：如、(聚乙二醇聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与的它们与酚类有
34、较强的亲和力，可防止酚类与的结合结合盐离子的去除：盐离子的去除：的乙醇洗涤的乙醇洗涤.核酸分离、纯化核酸分离、纯化当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分淀会更充分沉淀时加入体积的（，），有利于充分沉淀沉淀时加入体积的（，），有利于充分沉淀沉淀后应用的乙醇洗涤，以除去盐离子等沉淀后应用的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）晾干，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用缓冲液溶解若长期储存建议使用缓冲液溶解中的能螯和或离子，抑制中的能螯和或离子，抑制值为，可防止发生酸解值为，可防止发生酸解.核酸的沉淀、
35、溶解核酸的沉淀、溶解中含有蛋白、多糖、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质；多酚类杂质；在溶解前，有酒精在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后残留，酒精抑制后续酶解反应；续酶解反应；中残留有金属离子。中残留有金属离子。重新纯化，去除蛋白、重新纯化，去除蛋白、多糖、多酚等杂质多糖、多酚等杂质（具体方法见前）（具体方法见前）重新沉淀，让酒精充重新沉淀，让酒精充分挥发分挥发增加乙醇洗涤的次增加乙醇洗涤的次数（次）数（次）l问题一：样品不纯，抑制后续酶解和反应。问题一：样品不纯，抑制后续酶解和反应。原原 因因对对策策n 基因组的常见问题基因组的常见问题材料不新鲜或反复冻融；材料不新鲜或反复冻融；未很好抑制内源核酸酶
36、未很好抑制内源核酸酶的活性；的活性；提取过程操作过于剧烈，提取过程操作过于剧烈，被机械打断；被机械打断；外源核酸酶污染；外源核酸酶污染；反复冻融。反复冻融。尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；免反复冻融；液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液；前加入裂解缓冲液；在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的时，可增加裂解液中螯合剂的含的时，可增加裂解液中螯合剂的含量；量；细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔；细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔；所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌；温灭
37、菌；将分装保存于缓冲液中，避免反复将分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。冻融。l 问题二：降解。问题二：降解。对对策策 原因原因n 基因组的常见问题基因组的常见问题实验材料不佳或量少；实验材料不佳或量少；破壁或裂解不充分；破壁或裂解不充分；沉淀不完全；沉淀不完全；洗涤时丢失。洗涤时丢失。尽量选用新鲜（幼嫩）的材料；尽量选用新鲜（幼嫩）的材料；动植物要匀浆研磨充分；菌、动植物要匀浆研磨充分；菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁；式破壁；高温裂解时，时间适当延长（对高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加的用于动物细胞、细菌可增加的用量）；量）；低温沉淀，延长
38、沉淀时间；低温沉淀，延长沉淀时间；加辅助物，促进沉淀；加辅助物，促进沉淀；洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。出，勿倾倒。l 问题三：提取量少。问题三：提取量少。对策 原因n 基因组的常见问题基因组的常见问题细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的和由于在特定下因溶解度的不同而分别位于释放出来的和由于在特定下因溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净。有机溶
39、剂抽提，沉淀，得到纯净。n 的分离提纯的分离提纯n 异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法的基本原理n 的分离提纯的分离提纯n 异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法的基本流程动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤异丙醇沉淀异丙醇沉淀RNA溶液溶液植物材料液氮研磨n 的分离提纯的分离提纯n 异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法主要试剂细胞裂解液：细胞裂解液：异硫氰酸胍异硫氰酸胍 柠檬酸钠柠檬酸钠 十二烷基肌氨酸钠十二烷基肌氨酸钠 巯基乙醇巯基乙醇(用前加入用前加入)其他试剂：其他试剂：水平衡酚水平
40、衡酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇 ()()：乙醇乙醇 异丙醇异丙醇 水水 法提取法提取试剂：试剂：购买不同厂家的购买不同厂家的试剂试剂其他试剂：其他试剂：氯仿氯仿 乙醇乙醇 异丙醇异丙醇 水水 n 的分离提纯的分离提纯n 异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法实验步骤 样品处理：样品处理：取新鲜组织，剪碎，置于组织匀浆器中，加入加入预冷的细胞裂解液，取新鲜组织，剪碎，置于组织匀浆器中，加入加入预冷的细胞裂解液，充分研磨形成匀浆液，室温放置后分装不同的离心管，每管；充分研磨形成匀浆液，室温放置后分装不同的离心管，每管；的抽提的抽提加入醋酸钠（）加入醋酸钠（），充分混匀。，充分混匀。加入酚：
41、氯仿：异戊醇，充分混匀摇振，冰浴加入酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振，冰浴，离心；，离心；移取上层水相至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置，沉淀；移取上层水相至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置，沉淀；n 的分离提纯的分离提纯n 异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法异硫氰酸胍苯酚法实验步骤 的抽提的抽提，离心，离心.弃上清液，加入乙醇，洗涤沉淀物；弃上清液，加入乙醇，洗涤沉淀物；，离心。，离心。弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则难以溶解弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则难以溶解加入加入水重悬，或加无水乙醇和体积水重悬，或加无水乙醇和体积 醋酸钠（），醋酸钠（）
42、，保存。保存。I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中n 的提取注意事项的提取注意事项基本步骤：基本步骤：新鲜，切忌使用反复冻融的材料；新鲜，切忌使用反复冻融的材料；如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在或样品贮存液中，于以先将材料贮存在或样品贮存液中，于或或保存；保存；如要多次提取，请分成多份保存；如要多次提取，请分成多份保存；液氮长期保存，液氮长期保存，短期保存。短期保存。.破碎细胞或包膜破碎细胞或包膜根据不同材料选择不同的处理方法：
43、根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酵母和细菌：一般可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解；样品量适当，保证充分裂解；为减少污染，可适当加大裂解液的用量。为减少污染，可适当加大裂解液的用量。.核酸分离、纯化核酸分离、纯化在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作在使用氯仿抽提纯化时，
44、一定要充分混匀，且动作快速；快速；经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 沉淀等，虽然经济，但操作沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成时间长，易造成 降解；降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分；淀会更充分；沉淀后应用的乙醇洗涤，以除去盐离子等；沉淀后应用的乙醇洗涤，以除去盐离子等；晾干，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）；晾干，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）；
45、若长期储存，建议在无水乙醇和体积若长期储存，建议在无水乙醇和体积 醋酸钠（）溶液醋酸钠（）溶液中，中，保存。保存。.核酸的沉淀、溶解核酸的沉淀、溶解样品不新鲜；样品不新鲜；裂解不充分；裂解不充分；外源污染。外源污染。取新鲜细胞或组织，尽量取新鲜细胞或组织，尽量避免样品反复冻融，尽量避免样品反复冻融，尽量在低温条件下处理样品；在低温条件下处理样品；检查裂解液的质量是否合检查裂解液的质量是否合格，适当增加裂解液用量，格，适当增加裂解液用量，延长裂解时间；延长裂解时间；严格处理实验中所需的各严格处理实验中所需的各种耗材和试剂。种耗材和试剂。l问题一：问题一：的降解的降解 。原原 因因对对策策n 分离
46、的常见问题分离的常见问题蛋白质污染；蛋白质污染；酚类污染；酚类污染；抽提试剂残留。抽提试剂残留。不要吸入中间层及有机相，加不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够；分层的离心力和时间要足够；减少起始样品量，确保裂解完减少起始样品量，确保裂解完全、彻底；全、彻底；重新抽提一次，再沉淀，溶解；重新抽提一次，再沉淀，溶解；确保洗涤时要彻底悬浮确保洗涤时要彻底悬浮 ，并且，并且彻底去掉彻底去掉 乙醇。乙醇。l问题二：问题二：比值偏低。比值偏低。原原 因因对对策策n 分离的常见问题分离的常见问题降解；降解；抽提试剂残留；抽提试剂残留；污染。污
47、染。操作时注意防止降解；操作时注意防止降解；确保洗涤时要彻底悬浮确保洗涤时要彻底悬浮 ，并，并且彻底去掉且彻底去掉 乙醇；乙醇；使用使用 的的 消化抽提的消化抽提的 。l问题三：下游实验效果不佳。问题三：下游实验效果不佳。原原 因因对对策策n 分离的常见问题分离的常见问题四 反应条件设置 温度温度 时间时间 循环次数循环次数 温度与时间的设置温度与时间的设置 设置变性退火延伸三个温度点。设置变性退火延伸三个温度点。标准反应中采用三温度点法，双链在标准反应中采用三温度点法，双链在变性，再变性，再迅速冷却至迅速冷却至 ，引物退火并结合到靶序列上，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至然后快速升温
48、至，在，在 聚合酶的作用下，使引聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为时）可采用二温度点法，对于较短靶基因（长度为时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用将退火与延伸温度合二为一，一般采用变性，变性，左右退火与延伸。左右退火与延伸。温度与时间的设置温度与时间的设置变性温度与时间变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致失败的最主要原因变性温度低，解链不完全是导致失败的最主要原因 一般一般足以使模板变性足以使模板变性 若低于若低于则需延长时间则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影
49、响。此步若不能使靶基因模板或产物完全变性，就会导致此步若不能使靶基因模板或产物完全变性，就会导致失败。失败。温度与时间的设置温度与时间的设置退火温度与时间退火温度与时间 退火温度是影响特异性的较重要因素退火温度是影响特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至，可使引物和模板，可使引物和模板发生结合。由于模板发生结合。由于模板 比引物复杂得多，引物和模比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的
50、长度及其浓度，还有靶基序列的长度 对于个核苷酸，含量约的引物，对于个核苷酸，含量约的引物，为选择最适退为选择最适退火温度的起点较为理想火温度的起点较为理想 温度与时间的设置温度与时间的设置退火温度与时间退火温度与时间经验公式：值（解链温度）（）（）经验公式：值（解链温度）（）（）复性温度值（复性温度值（）在值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少在值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高反应的特异性引物和模板间的非特异性结合，提高反应的特异性复性时间一般为，足以使引物与模板之间完全结复性时间一般为，足以使引物与模板之间完全结合合延伸温度：一般选择在延伸温度：
