1、基因工程第一讲基因工程第一讲科目：高三生物科目：高三生物 讲课：讲课：1 1概念概念2 2分析分析基因工程的概念基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境原理原理基本过程基本过程优势优势目的目的DNADNA重组技术或重组技术或基因拼接技术基因拼接技术生物体外生物体外基因重组基因重组人类需要的生物类型和生物产品人类需要的生物类型和生物产品定向改造性状、打破物种界限定向改造性状、打破物种界限剪切剪切拼接拼接导入导入检测表达检测表达“分子手术刀分子手术刀”-“分子缝合针分子缝合针”-“分子运输车分子运输车”-限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶载体载体考点考点1
2、1 DNADNA重组技术重组技术的基本工具的基本工具黏性末端黏性末端平末端平末端可用于目的基因和载体的切割可用于目的基因和载体的切割一、一、限制酶限制酶“分子手术刀分子手术刀”A T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几两条单链的切口，带有几个个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之他们之间正好互补配对，这样的间正好互补配对，这样的切口叫切口叫黏性末端黏性末端。平末端平末端平末端平末端SmaISmaI限制酶的切限制酶的切割割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开
3、当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的的DNADNA两条单链的两条单链的切口，是平整的切口，是平整的，这样的切，这样的切口叫口叫平末端平末端。种类种类E Ecolicoli DNA DNA连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶来源来源_T T4 4噬菌体噬菌体特点特点缝合黏性末端缝合黏性末端缝合缝合_末端和末端和_末端末端作用作用缝合双链缝合双链DNADNA片段，恢复两个核苷酸之间的片段，恢复两个核苷酸之间的_大肠杆菌大肠杆菌黏性黏性平平磷酸二酯键磷酸二酯键二、二、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”1、作用？2、类型1 1、种类：、种类：2 2、作用部位：、作用部
4、位：E Ecolicoli DNA DNA连接酶连接酶T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键 二、二、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”（黏性末端）（黏性末端）（黏性末端和平末端）（黏性末端和平末端）两两DNADNA片段要具有片段要具有互补互补的黏性末端的黏性末端才能拼起来才能拼起来DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？A A T T GA A T T GC CA AA AT TT TA AA AT TT TDN
5、A聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的作用聚合酶的作用DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象 作用结果作用结果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重组组DNA分子分子形成形成DNA的一条的一条链链基因工程基因工程DNA复制复制DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较在两个两个DNADNA片片段之间段之间形成磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸加将单个脱氧核苷酸加到已存在的核酸片
6、段到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯键上，形成磷酸二酯键三、三、载体载体“分子运输车分子运输车”1 1、载体的作用、载体的作用将将 转移到受体细胞中去。转移到受体细胞中去。目的基因目的基因2 2、常用的载体、常用的载体 质粒、质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒噬菌体的衍生物、动植物病毒3 3、作为载体必须具备的条件、作为载体必须具备的条件 能在宿主细胞内能在宿主细胞内稳定保存稳定保存并大量并大量复制复制；有有一个至多个限制酶的切割位点一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源以便于与外源 基因连接；基因连接；有特殊的遗传有特殊的遗传标记基因标记基因,供重组供重组DNADNA的检测和鉴定的检测和鉴定
7、有标记基因的存有标记基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别。素的培养基鉴别。有切割位点有切割位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核拟核DNADNA之外之外，并具有并具有自我复制能力自我复制能力的很小的双链环状的很小的双链环状DNADNA分子。分子。最常用运载体最常用运载体质粒质粒1确定切割某种目的基因的限制酶的种类根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为避免
8、目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。2载体上标记基因的作用载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4
9、4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定考点考点2 基因工程的基本操作程序（分四个步骤）基因工程的基本操作程序（分四个步骤）1 1、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因2 2、获取目的基因的常用方法：、获取目的基因的常用方法：（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成一、目的基因的获取一、目的基因的获取 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断片断，导入到，导入到中，中，各个受体菌分别含有这种生物的不同各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因，
10、称为基因文库基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（cDNA文库文库）提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库1 1.基因文库的构建方法基因文库的构建方法（1 1）直接分离法）直接分离法(鸟枪法鸟枪法)某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转
11、录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶（2 2）反转录法）反转录法2.2.基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。前提条件：前提条件：_；原料：原料：_、_ _、_、_。原理：原理：_聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核
12、苷酸DNADNA引物引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶模板模板DNADNA过程：过程：a a、变性、变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、复性、复性（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：变性：
13、加热至加热至90909595双链双链DNADNA解链成解链成为单链为单链DNADNA退火：退火：冷却至冷却至55556060部分引物与模部分引物与模板的单链板的单链DNADNA的特定的特定互补部位相配对和互补部位相配对和结合结合延伸：延伸：加热至加热至70707575以目的基因为以目的基因为模板，合成互补的模板，合成互补的新新DNADNA链链变性变性退火退火延伸延伸根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成已知
14、核苷酸序列已知核苷酸序列的较小基因可以的较小基因可以化学合成，不需化学合成，不需要模板。要模板。质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同一种同一种1 1.基因表达载体的构建基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心限制酶切割位点的选择必须保证限制酶切割位点的选择必须保证目的基因，目的基因，标记基因的完整性标记基因的完整性，以便于检测和表达。，以便于检测和表达。2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？b、
15、目的基因、目的基因a、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,RNA聚合酶的结合位聚合酶的结合位点点位于基因的末端位于基因的末端,终终止转录止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞载体载体与与表达载体表达载体的区别：的区别：与载体相比较与载体相比较,表表达载体在载体基础上增加了达载体在载体基础上增加了目的基因、启动目的基因、启动子、子、终止子终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作
16、用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子启动子(DNA(DNA片段片段)起始密码子起始密码子(RNA);(RNA);终止子终止子(DNA(DNA片段片段)终止密码子终止密码子(RNA)(RNA)提醒：提醒：三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞法感受态细胞法目的基因进入目的基因进入_内，并且在
17、内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点：易感染易感染双子叶植物双子叶植物和裸子植和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感物，对大多数单子叶植物没有感染能力染能力原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。转化过程转化过程:TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌
18、菌（2 2）基因枪法）基因枪法 P P1212 （3 3）花粉管通道法）花粉管通道法 P P1313（）原核生物原核生物特点：特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达表达载体与感受态细胞混合载体与感受态细胞混合 感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA分子分子思考：为什么要用思考：为什么要用CaCa2+2+处理受体细胞？处理受体细胞？用用Ca2Ca2处理，增加细菌细胞壁的通透性处理，增加细菌细胞壁的通透性DNADNA分子分子抗原抗原抗体抗体分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定DNADNA分子杂交分子杂交 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；将含将含目的基因的目的基因的DNADNA片段片段用放射性同位素等用放射性同位素等作标记作标记,以此做以此做探针探针；使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示若显示出出杂交带杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNADNA中。中。
