1、生物发酵过程控制与优化杨建新2014.10.8细菌群体的生长周期 停滞期 对数或指数生长期 静止期（产生次级代谢产物）发酵条件的影响极其控制常规发酵条件：常规发酵条件：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体、通氨速率和补水等。表征过程性质的状态参数：表征过程性质的状态参数：pH、DO、溶解二氧化碳、氧化还原电位、尾气中的氧气和二氧化碳含量、基质（如葡萄糖）浓度、产物浓度、代谢中间体或前体浓度、菌浓等通过直接参数求得的间接参数：通过直接参数求得的间接参数：比增长速率、摄氧率（OUR）、二氧化碳释放速率（CER）、呼吸商（RQ）、氧得率系数、氧体积传质速率、基质消耗速
2、率、产物合成速率等碳源葡萄糖、乙醇、甘油、乳糖，构建细胞形成产物 培养基中碳源浓度超过5%,细菌生长因细胞脱水而开始下降；并且在某一浓度下，碳源会阻遏负责产物合成的酶，出现碳分解代谢物阻遏；因此要控制碳源浓度；控制方法：使补入碳源速率等于其消耗速率氮源 氨、硝酸盐，合成氨基酸等 铵离子或某些氮源的积累会阻遏次级代谢产物的合成；因此要控制氮的水平矿物盐磷酸盐、镁盐、锰盐、铁盐、钾盐和氯化物 阻遏几种次级代谢物的生物合成；因此要控制浓度温度对发酵的影响 保证酶活性的重要条件 微生物生长 产物合成最适温度控制 变温培养发酵中前期：稍高温度促进生长；生产期：稍低温度维持较长生产期；后期：升温，促进微生
3、物分泌。pH的影响 酶活 基质利用速率 细胞结构pH选择和控制 生长期和生产期可选不同pH。pH上升超过最适值，意味着细菌处在饥饿状态，可加糖调节；糖过量又会使pH下降，可加碱或氨水调节。注：用pH控制加糖速率的缺点，是发酵中后期pH的变化不敏感，容易造成补料系统错乱。氧对发酵的影响 临界氧：不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。溶氧单位：空气饱和度（%）；在培养过程中，溶氧不是越高越好，过高的溶氧对生长可能不利；溶氧作为发酵异常的指标操作故障或事故引起的异常：未及时开搅拌、搅拌发生故障时，溶氧比平时低很多；一次加油过量，使溶氧显著降低；出现发酸现象：底物浓度过大，溶氧较低时产生乙醇，并与有机酸反应
4、形成有酒香味的脂类污染杂菌：污染好气菌，溶氧跌到0；污染不太好氧的杂菌，使生产菌受到抑制时，溶氧升高；溶氧作为控制代谢方向的指标：如：发酵中前期好气培养，后期转为厌气培养。又如：当补料速度较慢和供氧充足时，糖完全转化为酵母，二氧化碳和水；若补料速度过高，溶氧降到临界值以下，便会出现糖的不完全氧化，生成乙醇，结果酵母产量减少。溶氧控制 发酵液中溶氧的任何变化都是氧的供需不平衡的结果；发酵罐的供氧能力无论提得多高，若工艺条件不配合，还会出现溶氧供不应求的现象。若有效利用现有的设备条件便能适当控制菌的摄氧率。控制摄氧率的方法：控制加糖或补料速度、改变发酵温度、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂，能
5、改善溶氧状况和维持合适的溶氧水平。增加氧在水中的饱和度：在通气中掺入纯氧、提高罐压、改变通气速率（在速率较大时，对溶氧提高不明显，反而会增加泡沫）提高设备的供氧能力：改善搅拌更有效。溶氧控制 例1：限制养分的供给以降低菌的生长速率，可达到限制菌对氧的大量消耗，从而提高溶氧水平；例2：降低发酵温度可得到较高的溶氧值。前提是对产物合成没有副作用。溶氧控制措施的比较措施措施作用参数作用参数投资投资运行成本运行成本效果效果对生产的作用对生产的作用备注备注搅拌转速氧的体积传质系数高低高好要避免过分剪切挡板氧的体积传质系数中低高好空气流量氧在水中的饱和浓度、比界面面积低低低可能引起泡沫罐压氧在水中的饱和浓
6、度中低中好溶解二氧化碳问题养分浓度需求中低高不肯定响应慢表面活性剂氧的传质系数低低变化不肯定需实验确定温度需求、氧在水中的饱和浓度低低变化不肯定不是常有用用流加糖控制溶氧 当溶氧高于控制点时，糖阀加大，糖的利用需要消耗更多的氧，导致溶氧下跌；反之，当溶氧下降到控制点以下时，糖阀关小，甚至关闭，摄氧速率也会随后降低，引起溶氧上升；补料策略补糖速率的最佳点与设备供氧能力有关：设备供氧能力大的，补糖速率也需相应加大，生产水平也相应提高；设备供氧能力差的，补糖速率也需相应减小，生产水平也相应降低；流加方法 一次大量 多次少量（大多数采纳）连续流加（快速、恒速、指数和变速）补料时机的判断 有用菌的形态
7、发酵液中糖浓度 DO浓度 尾气中的氧和二氧化碳 摄氧率或呼吸商的变化根据摄氧率控制补料速率 摄氧率与基质消耗速率之间存在线性关系；根据尾气中的氧浓度，可求得摄氧率；调节补料速率使菌处于半饥饿状态，以使发酵液有足够的氧，从而获得高生产速率。控制加糖速率来维持DO和pH例青霉素发酵：在快速生长期加入过量葡萄糖会导致酸的积累和氧的需求大于发酵的供氧能力，加糖不足又会使发酵液中的有机氮当做碳源利用，导致pH上升和菌量失调；在生长期控制加糖速率来维持DO和pH 在生产期以DO为控制因素根据尾气二氧化碳含量控制加糖速率例如青霉素发酵：加糖会引起尾气二氧化碳增加和pH下降，这是因为糖被利用产生有机酸和二氧化
8、碳，并溶于水中，而使pH下降；糖、二氧化碳和pH相关；二氧化碳对糖浓度比pH敏感，故而根据尾气二氧化碳释放率控制加糖速率。根据乙醇释放速率来调整补料速率 乙醇释放速率受氧的供应和葡萄糖的影响；故可用乙醇释放速率控制糖流加比生长速率的影响与控制 需要将残糖保持在最适合的浓度；测葡萄糖浓度或乙醇浓度和呼吸商。泡沫对发酵的影响及控制发酵过程中因通气搅拌，发酵产生的二氧化碳以及发酵液中糖、蛋白质和代谢物等稳定泡沫物质的存在，使发酵液含有一定数量的泡沫。发酵过程中泡沫的多寡与通气搅拌的剧烈程度和培养基的成分有关。有利作用：泡沫的存在可以可以增加气液接触表面，有利于氧的传递；不利作用：降低发酵罐的装填系数
9、增加了菌群的非均一性增加了染菌的机会引起逃液，招致产物损失消泡方式机械消泡：罐内法：消沫桨 罐外法：喷嘴消泡剂：天然油脂 泡敌发酵终点判断发酵终点的判断标准:原材料与发酵成本占生产成本的主要部分的发酵品种：提高产率（kg/立方米/h）,得率（转化率：kg产物/kg基质），发酵系数(kg产物/立方米容积)/h发酵周期 下游提炼成本占生产成本的主要部分的发酵品种：提高产率、发酵系数、产物浓度注：体积产率：g产物/L发酵液/h发酵罐循环周期。发酵单位：g产物/L发酵液发酵罐循环周期 洗罐 配料 灭菌 接种 发酵 放罐补料分批培养中生产经济上的优化 生物过程优化大多是要解决多目标问题，如产率、得率与产
10、品质量；普通办法是直接优化经济效益，包括如下工序：发酵、过滤、提取和产物的终处理（如结晶）发酵过程的监测 设定参数：罐温、罐压、通气量、搅拌转速、液位等；状态参数：pH、DO、溶解二氧化碳、尾气氧含量、尾气二氧化碳含量、粘度、菌浓等；间接参数：摄氧率、二氧化碳释放率、比生产速率、体积氧传质速率、呼吸商等生物过程控制特征 生物反应器在很大程度上能自我调节：微生物有适应环境的能力，故突然消失的反应在生物过程中是不存在的，如遇条件不适，过程反应会自然衰减。有相当长的时间常数，相对来说易于控制；常采用基于事态（如启动补料的条件）的（有反馈的意味）开环和前馈控制策略；控制策略来自积累的经验，有高度的特异
11、性，需保密。对生物过程控制规范化的要求 GMP用于控制的生物过程建模为了进行生物过程控制生物过程控制需要建立关联所有重要的过程输入（菌种、培养基、补料、环境条件）和过程输出（生物量、产物、pH、温度、DO、尾气成分等）的模型。生理模型 结构模型 非结构模型 黑箱或输入输出模型 传统过程模型 线性黑箱模型 非线性黑箱模型用于控制的生物过程建模发酵过程估算技术现有生物反应器的传感器难以测量发酵状态和进程的生物量、基质和次级代谢物浓度，但可以利用相关可测次级变量（如气中的氧和二氧化碳）来估算和推断难以测量的生物量、产物等初级变量。传统的基于模型的估算 基于线性黑箱模型的估算 基于非线性黑箱模型的估算
12、估算方法主要用于两种不同目的 估算事先定义的模型结构参数；估算真实过程变量控制系统设计 先决条件是建立准确描述生物过程的动态模型，模型的准确性决定控制的有效性；模型需要保密 自控系统的3大任务：生物过程控制、过程数据存储和过程数据分析。先进的优化控制还未成熟，但可用于改进提供给操作人员的信息质量，提高自动监督水平。发酵过程的控制策略 发酵过程的PID控制 发酵过程的推理控制 发酵过程的适应性（预估）控制 发酵过程的非线性控制 发酵的优化和优化控制 用于发酵监督与控制的知识系统 工业规模的发酵故障分析系统发酵过程的PID控制 反馈控制能很好的维持发酵条件，但不能保证发酵在最佳条件下运行；发酵过程
13、随时间变化的性质使PID参数难以最佳化；对付这种过程性质非线性和随时间变化的一种办法是采用一种自动调整PID控制策略。发酵过程的推理控制PI 控制器过程神经网络例如：控制青霉素生长速率按既定程序进行的PI控制器。PI控制器利用神经网络估算器估算的生长速率估算值与预设值之间的误差来调节碳源补入速率。发酵过程的适应性（预估）控制 闭环发酵控制中的主要问题是控制参数的调整；需要鉴别和在线改变随发酵过程变化的参数；因此需要自适应控制器；发酵过程的非线性控制 发酵过程的基本性质是非线性和参数非确定性；建立非线性控制器可改善控制性能；非线性控制器技术还不成熟发酵的优化和优化控制 优化：产率、成本、发酵周期
14、；目前发酵优化主要凭经验；成功的关键：建立准确描述过程的模型，和适当的优化程序。用于发酵监督与控制的知识库系统 运用人工智能技术（专家系统、模糊控制等）应付不确定的事物，结合定量与定性或符号表达式，来再现老练的过程操作人员的操作；可用作过程操作人员和管理人员的智能在线助手；将实时数据与期望数据进行比较，给出问题发生的可能原因以及纠正故障的办法。工业规模的发酵故障分析系统 目的：减少操作人员监督控制系统指示器的时间 操作工需要不间断的监督发酵过程，以判断其运行是否正常；操作人员通过直接检测过程数据（如：pH、DO、尾气二氧化碳和氧等）的变化来执行监察任务；可采用基于模糊推理的故障检测系统技术减少
15、操作人员的监督时间；多元统计过程控制技术是基于数据库的监督发酵过程的方法，主要用于故障检测和诊断。用于发酵诊断和控制的数据分析 生物过程输入-输出表示法 发酵测量与估算变量分类 代谢速率计算 不能直接测量的生物过程参数计算（观察器与滤波器）积分与平均数量计算 生理状态变量的计算生物反应器的输入输出表示法下位控制器（DCS）发酵罐（BR）基质氧热量基质DO温度机制流速氧传质速率热传递速率操纵参数操纵参数环境参数环境参数生物过程的高级输入输出表示下位控制器（DCS）发酵罐（BR）产物基质氧热量基质(浓度)DO温度基制流速氧传质速率热传递速率操纵变量操纵变量（MV）环境变量环境变量（EV）生物量（B
16、M）生理变量生理变量（PV）基质消耗速率摄氧率热释放率产物生成速率BM：生物量PV：生理变量PSV：生理状态变量IFB（内反馈）：生物量影响环境变量的反馈回路产物浓度实例 利用二氧化碳释放速率、耗氧速率和化学计量关系法计算基质消耗速率、细胞生长速率、酶生产速率；通过改变基质添加速率可直接控制摄氧率，从而控制微生物的生长；利用DO变化与OUR的指示，控制青霉素发酵的补料；在新生霉素发酵中，利用热的释放，通过补料速率来调节比生长速率。生物过程的高级输入输出图示内容生物过程可用两个互相连接的部分表示：生物反应器（BR）和生物量（BM）生物过程存在三种变量：操纵变量（MV）、环境变量（EV）和生理变量
17、（PV）；常规控制系统由生物反应器（BR）、环境变量（EV）和操纵变量（MR）构成控制回路；高级控制系统除包含常规控制系统外，还考虑由生物量（BM）、环境变量（EV）和生理变量（PV）构成的抽象内反馈（IFB）回路。EV是BM的输入，PV是BM的输出。环境变量（EV）影响和控制生物量（BM）的输出-生理变量（PV），内反馈表示生物量（BM）的输出（生理变量PV）影响环境变量（EV）的过程；对生物量（BM）与环境变量（EV）因果关系的了解，将会显著提高控制性能。生物量、生理变量和生理状态变量 BM：生物量 PV：生理变量(代谢速率)PSV：生理状态变量PV是BM的输出，可能是表示生物量的信息，也
18、可能是生理状态信息。PSV是表示生理状态的PV。例：低的基质吸收率是BM输出PV，它可能与生理状态有关，也可能与生物量有关。用于表征生物过程的变量可测量的变量可测量的变量流速（操纵变量）流速（操纵变量）基质流速、氧传质速率浓度和物理变量（环境变量）浓度和物理变量（环境变量）基质浓度、溶氧、温度、菌体浓度，产物浓度其它其它氧化还原电位、荧光计算变量计算变量代谢速率（生理变量）代谢速率（生理变量）基质消耗速率、摄氧率二氧化碳释放速率、生长速率浓度（环境变量）浓度（环境变量）基质浓度、菌体浓度、产物浓度比速率比速率比基质消耗速率、呼吸强度；比二氧化碳释放速度、比生长速度速率比速率比消耗与消耗之比 生
19、产与生产之比 生产与消耗之比潜在消耗速率潜在消耗速率潜在基质消耗速率潜在摄氧率限制程度限制程度基质比消耗速率/潜在的基质比消耗速率；氧比消耗速率/潜在的氧比消耗速率PSV（生理状态变量）（生理状态变量）生理和环境变量其它其它积分值积分值总氧气、总二氧化碳平均值平均值平均得率、平均产率生理状态变量（PSV）比速率：消耗或生产速率与菌浓之比；速率比：速率与速率之比 潜在消耗速率（PiUR）：使物质i（比如基质）浓度超过饱和浓度时，物质i的比消耗速率会达到其最大值，此值即为物质i的潜在消耗速率；限制程度：DiL=化合物i的比消耗速率/化合物i的潜在消耗速率？比速率比消耗速率：SiUR=化合物消耗速率
20、/菌浓比葡萄糖消耗速率：SGUR=葡萄糖消耗速率/菌浓比氧耗速率（又称呼吸强度）：SOUR=OUR/菌浓比生产速率：SiPR=化合物生产速率/菌浓比二氧化碳释放速率：SCER=CER/菌浓比生长速率：SGR=生长速率（GR）/菌浓比生产速率：速率比消耗与消耗之比：氧消耗速率/葡萄糖消耗速率氨消耗速率/葡萄糖消耗速率生产与生产之比：细胞生长速率/二氧化碳释放速率乙醇生产速率/二氧化碳释放速率生产与消耗之比：细胞生长速率/葡萄糖消耗速率呼吸商：RQ=二氧化碳释放速率/氧消耗速率细胞生长速率/氨消耗速率产物得率=潜在消耗速率(PiUR)使物质i（比如基质）浓度超过饱和浓度时，物质i的比消耗速率会达到
21、其最大值，此值即为物质i的潜在消耗速率。限制程度DiL=化合物i的比消耗速率/化合物i的潜在消耗速率 DSL=基质比消耗速率/潜在基质比消耗速率 DOS=氧比消耗速率/潜在氧比消耗速率不能直接测量的生物过程参数计算对于一些关键生理变量（如代谢物生产速率）和环境变量（如菌浓），缺少快速、可靠和准确的在线测量装置，但能从可测变量（如DO或CER）,藉过程的数学模型来建立计算这类变量的方法。通常称这些方法为在线状态估算器在线状态估算器或软传软传感器。感器。在线状态估算器估算方法在线状态估算器估算方法 元素平衡 经验化学计算模型 人工神经网络基于状态估算的观察器 只要有适当的模型与输入是已知的，观察器
22、便可从一套变量预测过程未来的性质生理状态控制回路结构 直接PS(生理状态)控制 级联PS(生理状态)控制 管理PS(生理状态)控制直接生理状态控制回路结构PSV控制器现场控制器PSV的计算(软传感器)O-BRBMMVsEVsPVsPSVs例如：补葡萄糖速率IFB例如：比生长速率、呼吸商直接生理状态控制级联生理状态控制回路结构次级控制器PSV控制器PSV的计算(软传感器)MVPSVBRBMEVPV次级控制回路PSV设定点+-+-初级控制回路监督性生理状态控制回路结构用于PS鉴别和监督的知识库系统现场控制器PSV的计算(软传感器)O-BRBMMVsEVsPVsPSVs例如：补葡萄糖速率IFB例如：
23、比生长速率、呼吸商下位机常规控制上位机基于知识的控制控制策略改变控制参数改变模式识别方法与数据分析 趋势分析：有经验的操作工和工程师根据趋势曲线的特征来判断过程的动向和特性。例如，操作工可能注意摄氧高峰的出现以便启动补料，而工程师可能从DO变化情况来判断优化情况。他们以随时间的量变曲线或其中一部分来诊断、分析、比较和区分不同发酵过程或改变操作策略对过程的影响。模式识别步骤 趋势检测 特征提取：用方便的方法描述检测到的趋势。例如每一批的特征用一串字符描述，这些字符表示一系列的具有不同特征的节。主成分分析对趋势曲线的滤波在提取特征前，要从趋势曲线中去除信号噪声和测量噪声。小波分析 多项式拟合用提取的特征比较不同的批 用判定树鉴别具有最大判断能力的特征；用具有最大判断能力的特征比较不同的批，进行工艺优化，获得最佳操作策略（曲线）；杨建新2014.10.08
