1、实验二实验二 DNA浓浓度与纯度与纯度度的测定的测定 一、实验目的一、实验目的1.掌握分光光度法检测掌握分光光度法检测DNA的纯的纯/浓度浓度2.学习凝胶电泳法学习凝胶电泳法检测检测DNA的质量的质量1.紫外检测原理紫外检测原理 苯环结构苯环结构 Abs or T%光谱扫描光谱扫描 定量测定定量测定二、实验原理二、实验原理DNA浓度的估算浓度的估算 dsDNA(g/ml)=50(OD260)倍数倍数 ssDNA(g/ml)=33(OD260)倍数倍数 dsDNA(1 g/ml):OD2600.02OD260150 g/ml RNA(g/ml)=40(OD260)倍数倍数RNA浓度的估算浓度的估
2、算 DNA:A260/A280=1.8,1.8 RNA:A260/A280=2.0 残留酚残留酚(270nm)、蛋白蛋白核酸纯度的判断核酸纯度的判断2.琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法 电荷效应电荷效应 分子筛分子筛凝胶浓度凝胶浓度低电压低电压影响影响DNA迁移率的因素迁移率的因素 DNA分子大小与构型分子大小与构型 琼脂糖的浓度与质量琼脂糖的浓度与质量 电压大小电压大小(5V/cm)缓冲液缓冲液pHEB检测原理检测原理 结合量与结合量与DNA大小和含量大小和含量三、实验材料三、实验材料、设备及耗材设备及耗材 E.c DNA提取液提取液 50 TAE:2 mol/L Tris碱碱,1 mol/
3、L乙酸乙酸,50 mmol/L EDTA(pH8.0)EB:母液母液(1mg/ml),工作液工作液(1 g/ml)6 上样缓冲液上样缓冲液 Marker:DNA Hind (50ng/l)实验用具及耗材实验用具及耗材 TU-1901、石英比色杯石英比色杯、旋涡振荡器旋涡振荡器 凝胶电泳系统凝胶电泳系统、凝胶成像系统凝胶成像系统 移液器移液器(10、20、200 l)、吸头及吸头及EP管管四、实验步骤四、实验步骤 TE buffer稀释稀释:100、200 旋涡振荡旋涡振荡,混匀混匀,离心离心 预热预热15 min CK:400 l TE,校零校零 样品测试样品测试,A260、A2801.紫外检测紫外检测2.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 配胶配胶(0.8%)溶解溶解灌胶灌胶 1 TAE电泳缓冲液电泳缓冲液 DNA样品样品+1 l上样液上样液 3 l Marker+1 l上样液上样液 100V,20 EB染色染色(1 g/ml),20 凝胶成像系统观察凝胶成像系统观察注意事项注意事项 仪器操作仪器操作 比色杯使用比色杯使用 琼脂糖彻底溶解琼脂糖彻底溶解 防止凝胶穿刺防止凝胶穿刺 减小减小EB污染污染五、作业五、作业P81思考题思考题:2、4；P132思考题思考题:2提取提取DNA纯度是否合乎要求？浓度多少？纯度是否合乎要求？浓度多少？
