1、RNARNA干扰技术基本原理与应用干扰技术基本原理与应用什么是什么是RNARNA干扰干扰 RNARNA干扰干扰(RNA(RNA interferenceinterference，RNAi),RNAi),又称转录后基因沉默又称转录后基因沉默(post-(post-transcriptional gene silencingtranscriptional gene silencing，PTGSPTGS)，是指将特异性同源双链是指将特异性同源双链RNA(RNA(dsRNAdsRNA)导入到细导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降.20012001、200
2、22002年连续被年连续被ScienceScience评为年度十大成就评为年度十大成就!目前应用的基因干扰技术目前应用的基因干扰技术lDNADNA水平的基因干扰技术水平的基因干扰技术F基因敲除技术基因敲除技术F寡核苷酸与双链寡核苷酸与双链DNA DNA 杂交杂交F采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子目前应用的基因干扰技术目前应用的基因干扰技术lmRNAmRNA水平的基因干扰技术水平的基因干扰技术F用反义用反义RNA RNA 技术阻遏翻译过程技术阻遏翻译过程,破坏内源性破坏内源性mRNAmRNAF设计寡核苷酸来破坏与设计寡核苷酸来破坏与mRNA mRNA
3、结合的蛋白质结合的蛋白质,使使mRNA mRNA 不稳定不稳定F双链双链RNA RNA 干扰技术（干扰技术（RNAiRNAi）RNAiRNAi的发现和发展历程的发现和发展历程l1984 1984 年年,Jonathan,Jonathan 研究小鼠研究小鼠L L 细胞时发现反义细胞时发现反义mRNA mRNA 会干扰同源基因的表达，机制不清会干扰同源基因的表达，机制不清l19901990年年 Jorgensen Jorgensen等等 矮牵牛颜色加深实验矮牵牛颜色加深实验 “共抑制共抑制(co-suppresion)”(co-suppresion)”RNAiRNAi的发现和发展历程的发现和发展历
4、程l19951995年年 Su Guo Su Guo 和和Ken Emphues Ken Emphues 反义反义RNARNA阻断秀丽小杆线虫阻断秀丽小杆线虫par-1par-1基因的表达基因的表达 实验实验 首次发现首次发现 RNARNA干扰现象干扰现象l19981998年年 Andrew FireAndrew Fire和和Craig Mello Craig Mello 发现单链发现单链RNARNA抑制作用较弱，而纯化的抑制作用较弱，而纯化的dsRNAdsRNA可高可高效、特异地抑制基因的表达效、特异地抑制基因的表达 Nature1998Nature1998；391:806-11 391:8
5、06-11 正式提出正式提出RNARNA干扰的概念干扰的概念RNAiRNAi的发现和发展历程的发现和发展历程l19991999年年 TuschlTuschl等等 报道在哺乳动物中也存在报道在哺乳动物中也存在RNAiRNAil20012001 年年 Berstein Berstein 等等 提出只有提出只有22 22 核苷酸核苷酸dsRNAdsRNA才有特异性的阻断效才有特异性的阻断效应，并发现体内分解应，并发现体内分解dsRNA dsRNA 为为siRNAssiRNAs (short/small interfering RNA)(short/small interfering RNA)的的DI
6、CER DICER 酶酶RNAiRNAi的发现和发展历程的发现和发展历程l20022002 年年 Novina Novina 等等 用用RNAi RNAi 技术实现了对技术实现了对HIV-1 HIV-1 病毒的阻抑病毒的阻抑l20042004年年 Morris Morris 等等 用用RNAiRNAi技术实现了对人细胞基因的抑制技术实现了对人细胞基因的抑制 Science 2004(August 27)Science 2004(August 27)；305305：1289-12921289-1292RNAiRNAi的主要特点和优势的主要特点和优势l诱导转录后水平的基因沉默诱导转录后水平的基因沉
7、默l具有高度的特异性具有高度的特异性l抑制基因表达的效率非常高抑制基因表达的效率非常高l可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去 “基因沉默系统化基因沉默系统化”siRNA siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶l共同点共同点F 特异性特异性F 靶向性靶向性siRNA siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶l不同点不同点F独特的双链结构独特的双链结构F需要需要DicerDicer、RdRp RdRp、解旋酶、激酶等协同因子、解旋酶、激酶等协同因子FsiRNA siRNA 本身无催化活性本身无催化
8、活性F在细胞内可能具有相对的稳定性在细胞内可能具有相对的稳定性F具有一定的可遗传性具有一定的可遗传性RNAiRNAi的主要过程的主要过程l启动阶段启动阶段 dsRNA(500ntdsRNA(500nt左右最佳左右最佳)被被Dicer Dicer 酶酶特异性特异性识别，以一种识别，以一种ATPATP依赖的方式逐步切割成依赖的方式逐步切割成siRNAsiRNA 长度：长度：21-25nt21-25nt 结构：结构：3 3端悬垂两个未配对的碱基端悬垂两个未配对的碱基UUUU细胞中内源性细胞中内源性dsRNAdsRNA的形成的形成l基因组中基因组中DNA DNA 反向重复序列的转录产物反向重复序列的转
9、录产物l同时转录反义和正义同时转录反义和正义RNA RNA l病毒病毒RNA RNA 复制中间体复制中间体l以单链以单链RNA RNA 为模板由细胞或病毒的为模板由细胞或病毒的RNA RNA 依赖依赖RNA RNA 聚合酶聚合酶(RdRpRdRp)催化合成催化合成dsRNAdsRNADicerDicer酶酶lRNAase IIIRNAase III超家族成员。结构中包括一个螺旋超家族成员。结构中包括一个螺旋酶结构域，两个酶结构域，两个RNARNA酶酶结构域，一个双链结构域，一个双链RNARNA结合位点结合位点l对单链对单链RNARNA没有活性没有活性l对对200500nt200500nt的的d
10、sRNAdsRNA作用效果最好，能降解成作用效果最好，能降解成25nt25nt左右的左右的siRNAsiRNAl广泛存在广泛存在RdRpRdRp（RNA dependent RNA polymeraseRNA dependent RNA polymerase）l使异常的使异常的RNARNA转变为转变为dsRNAdsRNAl参与细胞内参与细胞内dsRNAdsRNA和和siRNAsiRNA的扩增的扩增lsiRNAsiRNA与靶与靶mRNA mRNA 的结合可激活的结合可激活RdRpRdRp，形成大量，形成大量的的dsRNAdsRNARNAiRNAi的主要过程的主要过程l效应阶段效应阶段FRNARN
11、A诱导沉默复合体（诱导沉默复合体（RNA-induced silencing RNA-induced silencing complexcomplex，RISCRISC）的形成的形成 siRNAsiRNA、核酸内切酶、外切酶和解旋酶、核酸内切酶、外切酶和解旋酶FRISCRISC的激活：的激活：ATPATP依赖的解双链过程依赖的解双链过程F在在siRNAsiRNA反义链的指导下，反义链的指导下，RISCRISC特异性切特异性切 割、降割、降解靶解靶mRNAmRNA，导致基因表达失活，导致基因表达失活 RNAiRNAi技术的实验方法技术的实验方法lsiRNAsiRNA的设计原则的设计原则F序列大小
12、序列大小 19-21nt 19-21nt，最好以，最好以A A或或G G开始开始F从从mRNAmRNA的的AUGAUG开始，寻找开始，寻找AAAA二连序列，作为二连序列，作为潜在的潜在的RNAiRNAi靶位点靶位点F不要针对不要针对55和和33端非编码区端非编码区（untranslated regionsuntranslated regions，UTRs)UTRs)RNAiRNAi技术的实验方法技术的实验方法lsiRNAsiRNA的设计原则的设计原则F设计设计2424个序列个序列,BLAST,BLAST 比对基因序列以确比对基因序列以确保序列设计的特异性保序列设计的特异性F优先选择优先选择 G
13、C GC 含量含量30-50%30-50%的序列的序列F设计适当的阴性对照序列设计适当的阴性对照序列阴性对照序列的设计阴性对照序列的设计l特异性特异性siRNAsiRNA中的碱基进行随机排列，且行中的碱基进行随机排列，且行BLASTBLAST基因比对基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCGATTCGTGCTCAATGCAATCGl在特异性在特异性siRNAsiRNA引入引入1212个错配碱基个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAG A
14、GCCTTAGT TTTAATTAAA ATCCTAGTCCTAG目标序列筛选的相关网站目标序列筛选的相关网站http:/www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp:/www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp:/sfold.wadsworth.org/sirna.plhttp:/sfold.wadsworth.org/sirna.plhttp:/ http:/katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/rnai.html 查找已经证实的查找已经证实的siRNAsiRNA的网站的网站lht
15、tp:/ BrowseCatalog.jsp?Category=Published siRNAsiRNA的制备方法的制备方法l体外制备方法体外制备方法F化学合成化学合成siRNAsiRNAF体外转录获取体外转录获取siRNAsiRNAF利用利用DicerDicer或或 RNaseRNase消化长的消化长的dsRNAdsRNA成成siRNAsiRNA化学合成法制备化学合成法制备siRNAsiRNAl优点：优点：纯度高纯度高 合成量不受限合成量不受限 能被标记能被标记l缺点：缺点：价格昂贵、合成周期长价格昂贵、合成周期长l用途：用途：已经找到最有效的已经找到最有效的siRNAsiRNA的情况下，的
16、情况下，需要大量需要大量siRNAsiRNA进行研究进行研究 体外转录法制备体外转录法制备siRNAsiRNAl优点：优点：简单简单 成本低成本低 速度快速度快 毒性小毒性小 稳定性好稳定性好 l缺点：缺点：反应规模和量始终有一定的限制反应规模和量始终有一定的限制l用途：用途：筛选筛选siRNAssiRNAs，特别是需要制备多种，特别是需要制备多种 siRNAssiRNAs 消化法（消化法（“siRNAs siRNAs 鸡尾酒鸡尾酒”）l优点：优点：无需检测或筛选多个无需检测或筛选多个siRNAsiRNA序列序列 产生多种产生多种 siRNAs siRNAs 混合体，保证混合体，保证有效的有效
17、的 目的基因沉默目的基因沉默l缺点：缺点：有可能引发非特异的基因沉默有可能引发非特异的基因沉默 l用途：用途：快速而经济地研究某个基因功能缺失快速而经济地研究某个基因功能缺失 的表型的表型 siRNAsiRNA的制备方法的制备方法l细胞内制备方法细胞内制备方法F依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNAsiRNAF通过通过PCRPCR介导的介导的siRNAsiRNA表达试剂盒获取表达试剂盒获取siRNAsiRNAsiRNAsiRNA载体载体l依赖依赖RNARNA聚合酶聚合酶III III 启动子启动子(pol III)(pol III)，操纵，操纵一段小的发
18、夹一段小的发夹siRNAsiRNA在哺乳动物细胞中的表达。在哺乳动物细胞中的表达。人源人源U6U6启动子启动子 鼠源的鼠源的U6U6启动子启动子 人人H1H1启动子启动子lpol IIIpol III可在细胞中表达许多的小分子可在细胞中表达许多的小分子RNARNA，通，通过添加一串（过添加一串（3636个）个）U U来终止转录的来终止转录的l需要订购需要订购2 2段编码短发夹段编码短发夹RNARNA序列的序列的DNADNA单链再单链再克隆到载体中克隆到载体中 表达载体法制备表达载体法制备siRNAsiRNAl优点：优点：可以进行较长期研究。载体可以在细胞中可以进行较长期研究。载体可以在细胞中
19、持续抑制靶基因达数星期或更久持续抑制靶基因达数星期或更久l缺点：缺点：需要进行克隆，周期长需要进行克隆，周期长 质粒载体表达效率较低质粒载体表达效率较低l用途：用途：唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法基于基于PCRPCR的的siRNAsiRNA表达框架表达框架(SECsSECs)l组成：组成：RNA pol IIIRNA pol III启动子启动子 发夹结构发夹结构siRNAsiRNA RNA pol III RNA pol III终止位点终止位点l制备：制备：PCR PCR，无需克隆和测序，无需克隆和测序用用SECsSECs制备制备siRNAsiRNAl优点
20、优点：F可直接由可直接由PCRPCR得到，方法简便，时间短得到，方法简便，时间短F在在PCRPCR片段两端添加酶切位点，筛选出片段两端添加酶切位点，筛选出 最有效最有效的的siRNAsiRNA可用于构建表达载体可用于构建表达载体F可以用来筛选特定研究体系中启动子和可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNAsiRNA的的最适搭配最适搭配 用表达框架制备用表达框架制备siRNAsiRNAl缺点缺点：FPCRPCR产物很难转染到细胞中产物很难转染到细胞中F不能进行序列测定，不能进行序列测定，PCRPCR和和DNADNA合成时可能产合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想生的误读不能被发现导致结
21、果不理想 l用途用途：F筛选筛选siRNAsiRNA序列序列F在将在将siRNAsiRNA克隆到载体前筛选最佳启动子克隆到载体前筛选最佳启动子 shRNA(short hairpin RNA)shRNA(short hairpin RNA)文库文库l NatureNature 2004 2004；428428：427-431(25 March427-431(25 March)针对：针对：9,610 human genes9,610 human genes 5,563 mouse genes 5,563 mouse genes 构建成：构建成：28,00028,000个个shRNAshRNA表达
22、盒表达盒(cassettes)(cassettes)l商品化试剂盒：商品化试剂盒：Expression ArrestExpression Arrest(美国冷泉港实验室美国冷泉港实验室 Open BiosystemsOpen Biosystems公司公司)网上数据库中选择特定的网上数据库中选择特定的shRNAshRNA克隆，无需再耗时克隆，无需再耗时耗力进行耗力进行siRNAsiRNA的设计、合成和验证过程的设计、合成和验证过程CAMCAM:氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 hrhr：同源重组位点：同源重组位点BarcodeBarcode：每个每个shRNAshRNA独特的识别序列独特的识别序列
23、MSCVMSCV：病毒载体骨架：病毒载体骨架 PKG-PuroPKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择KanKan、oriToriT、RK6RK6：逆转录病毒信号序列：逆转录病毒信号序列siRNAshRNA使用代价使用代价高高相对较低相对较低持久性持久性最多最多2周周可选择获得稳定整合的细胞可选择获得稳定整合的细胞宿主类型宿主类型细胞系细胞系原代细胞，胚胎干细胞、细原代细胞，胚胎干细胞、细胞系胞系设计设计复杂的设计方法复杂的设计方法完成完成获取获取需要合成需要合成完成完成应用应用瞬时转染瞬时转染瞬时转染、稳定转染、病毒瞬时转染、稳定转染、病毒侵染侵染检测
24、方法检测方法Western杂交、表型分杂交、表型分析析RT-PCR、芯片检测、芯片检测Western杂交、表型分析、杂交、表型分析、RT-PCR、芯片检测、芯片检测研究领域研究领域细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养&体内研究体内研究siRNAsiRNA转染细胞转染细胞 l.磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀 l电穿孔法电穿孔法 lDEAE-DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene polybrene l机械法机械法 ：显微注射和基因枪：显微注射和基因枪 l阳离子脂质体试剂阳离子脂质体试剂 提高转染效率的方法提高转染效率的方法l纯化的纯化的siRNAsiRNAl避免使用抗生素避免使用抗生素l避免避免RN
25、ARNA酶污染酶污染 l较低传代数的细胞较低传代数的细胞 l合适的转染试剂合适的转染试剂 l合适的阳性对照合适的阳性对照l荧光标记的荧光标记的siRNA siRNA RNAiRNAi技术的应用技术的应用l基因组功能研究的新方法基因组功能研究的新方法l研究信号传导通路的新途径研究信号传导通路的新途径 l开展基因治疗的新策略开展基因治疗的新策略 （抗病毒、（抗病毒、抗肿瘤等抗肿瘤等）l筛选药物靶点的新工具筛选药物靶点的新工具RNAiRNAi技术抗病毒技术抗病毒l作用作用F阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录F自然界中普遍存在自然界中普遍存在l在医学上的应用在医学上的
26、应用FRNARNA病毒：如病毒：如HIVHIV、HCVHCV、脊髓灰质炎病毒、脊髓灰质炎病毒FDNADNA病毒：如病毒：如HBVHBVRNAiRNAi技术阻止技术阻止HIVHIV的入侵的入侵lNovinaNovina将针对将针对CD4CD4的的dsRNAdsRNA导入导入 能表达能表达CD4CD4、CCR CCR 5 5、CXCR4CXCR4的的M agi2CCR 5 M agi2CCR 5 细胞系），细胞系），能使细胞表能使细胞表面面CD4CD4 表达减少表达减少75%75%；转染后；转染后60 60 小时后小时后,再用再用H H IV IV 感染感染,结果发现结果发现CD4-siRNA C
27、D4-siRNA 转染的细胞很少转染的细胞很少有包涵体出现有包涵体出现l其它试验的受体：其它试验的受体：CCR 5CCR 5、CXCR4CXCR4RNAiRNAi技术抑制技术抑制HIVHIV的复制的复制l将将HIV-1HIV-1编码编码revrev的基因和同源的的基因和同源的dsRNAdsRNA共转染共转染到到293293细胞中，细胞中，revrev基因的表达被显著抑制基因的表达被显著抑制lsiRNAsiRNA抑制抑制HIV rev-EGFPHIV rev-EGFP的表达，其抑制率可的表达，其抑制率可达到达到9090；而反义；而反义RNARNA，核酶组与对照组无显，核酶组与对照组无显著差异著差
28、异NS5B-6133siRNANS3-1948siRNAGAPDHsiRNA+HCV表达质粒表达质粒Huh-7 细胞细胞共转染共转染HCV RNA 21倍倍HCV RNA 23倍倍HCV RNA 无变化无变化RNAiRNAi技术抑制技术抑制HCVHCV的复制的复制RNAiRNAi技术抑制技术抑制HBVHBV的复制的复制lHBVHBV是是DNADNA病毒，但是其复制过程需经过逆转录病毒，但是其复制过程需经过逆转录的过程。的过程。l针对针对HBVHBV的的S S，C C，X X，P P基因序列及基因序列及DR1DR1，DR2DR2等等调控元件序列，设计的调控元件序列，设计的siRNAsiRNA可显著抑制可显著抑制HBVHBV的的复制和蛋白表达复制和蛋白表达
