1、Add Your Company Slogan实时荧光定量实时荧光定量PCR技术技术RealTime QuantitativePCR南开大学医学院南开大学医学院 lfnn lfnnLogoLogo RT-qPCR 原理原理Contents1 RT-qPCR 步骤步骤2 SYBR 实验步骤实验步骤3LogoLogoRT-qPCR 原理原理1定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过通过Ct值和标准曲线的分析对和标准曲线的分析对起始模板进行行定量分析定量分析的方法。1.荧光原理：SYBR Green2.定量
2、原理：（1）介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值 （2 2）定量原理：）定量原理：绝对定量（标准曲线）、相对定量（绝对定量（标准曲线）、相对定量（2 2-Ct-Ct）（3 3）融解曲线）融解曲线非特异性荧光标记：非特异性荧光标记：1 1、SYBR Green SYBR Green 结合于双链结合于双链DNADNA小沟之间，小沟之间，只有和双链只有和双链DNADNA结结合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及延伸过程中发出荧光）延伸过程中发出荧光）RT-qPCR 原理原理-荧光原理荧光原理特异性荧光标记：特异性荧光标记：1 1、TaqMan T
3、aqMan 水解型杂交探针。水解型杂交探针。55端标记有报告端标记有报告基团基团R R，33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 Q Q。探针完整。探针完整，R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被QQ基团吸收，无荧光。基团吸收，无荧光。TaqTaq酶有酶有 53 53外切核酸酶活性，可水解探针外切核酸酶活性，可水解探针R R与与QQ分开，发出荧光。分开，发出荧光。2 2、Molecular Beacon Molecular Beacon 分子信标。分子信标。标记荧光的发夹标记荧光的发夹探针，环与目标序列互补，茎由互补配对序列组探针，环与目标序列互补，茎由互补配对序列组成。变性过程：产生
4、非特异性荧光；延伸过程：成。变性过程：产生非特异性荧光；延伸过程：不产生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测不产生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号。荧光信号。3 3、Amplisensor Amplisensor 双链信号引物，进行半巢式扩增双链信号引物，进行半巢式扩增；随着；随着PCRPCR循环的重复进行，信号引物的双链结构循环的重复进行，信号引物的双链结构被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消失，消失，产物量与荧光成反比产物量与荧光成反比。Q QQ QR RLogoLogoRT-qPCR 原理原理-定量原理定量原理1扩增曲线图：扩
5、增曲线图：横坐标：扩增循环数（横坐标：扩增循环数（CycleCycle）纵坐标：荧光强度纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的每个循环进行一次荧光信号的收集收集CtCt值的定义：值的定义：PCRPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增过的扩增循环次数。循环次数。CtCt值极具重现性。分析定量时多取值极具重现性。分析定量时多取15-3515-35较好。较好。荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold）：）：前前1515个循环信号作为荧光本底信号（个循环信号作为荧光本底信号（baselinebas
6、eline），即样本的荧光背景值和阴），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。性对照的荧光值。荧光域值荧光域值的缺省设置是的缺省设置是3 31515个循环的荧光信号的标准偏个循环的荧光信号的标准偏差的差的1010倍。倍。LogoLogoRT-qPCR 原理原理-定量原理定量原理1理想的理想的PCRPCR反应：反应：X=XX=X0 0*2 2n n非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：X=X0(1+Ex)nX=X0(1+Ex)n n n：扩增反应的循环次数扩增反应的循环次数 X X：第第n n次循环后的产物量次循环后的产物量 X X0 0：初始模板量：初始模板量 Ex Ex：扩增效率：扩增效率
7、 log log X X0 0=-log(1+Ex)=-log(1+Ex)*CtCt+log+log X X Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即CtCt值值就可计算出样品中所含的模板量.1.1.绝对定量绝对定量LogoLogoRT-qPCR 原理原理-绝对定量绝对定量1q 模板模板DNADNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即量越多，荧光达到域值的循环数越少，即CtCt值越小值越小q LogLog浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品准曲线，根据样品CtCt值，就可以计算出
8、样品中所含的模板量值，就可以计算出样品中所含的模板量1.1.绝对定量绝对定量LogoLogoRT-qPCR 原理原理-绝对定量绝对定量1R R2 2为相关系数为相关系数：R R2 20.990.99时，认为时，认为两数值之间相关性好。两数值之间相关性好。E E为扩增效率为扩增效率：一般认为在：一般认为在90%-90%-110%110%之间数据可用。之间数据可用。LogoLogoRT-qPCR 原理原理-相对定量相对定量12.2.相对相对定量定量病人内参病人内参基因基因病人目的病人目的基因基因对照内参对照内参基因基因对照目的对照目的基因基因Ctabcd结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因
9、表达的多少倍。结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。RT-qPCR 原理原理-融解曲线融解曲线温度荧光强度Tm融融解曲线为单一峰，解曲线为单一峰，无非特异性荧光，定无非特异性荧光，定量准确。量准确。溶解峰反映反应中扩溶解峰反映反应中扩增到的产物的量。增到的产物的量。前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀。前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀。RT-qPCR 步骤步骤-SYBR Green法法1.1.准备物品：检测样本、内参、引物、荧光染料、八连管、移液枪、准备物品：检测样本、内参、引物、荧光染料、八连管、移液枪、RealplexRealplex软件软件2.2.将样本等稍许离心将样
10、本等稍许离心3.3.加样（可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中）加样（可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中）反应体系：反应体系：ddH2O 10L ddH2O 10L 染料染料 8L 8L 引物上下游各引物上下游各0.5L0.5L 样本样本 1L 1L4.4.将八连管标记后离心至无壁挂液体将八连管标记后离心至无壁挂液体5.5.将其置入将其置入RealplexRealplex仪中，仪中，设置程序：设置程序：95 15s 95 15s 95 15s 95 15s 57 30s 57 30s 74 30s 74 30s 45 45循环，循环，ENDEND后右键设置后右键设
11、置“insert-melting curve”“insert-melting curve”，后绿色运行，后绿色运行6 6、反应结束后将数据导出，分析数据。、反应结束后将数据导出，分析数据。反应体系的建立及优化反应体系的建立及优化:1.1.SYBR Green SYBR Green 使用浓度使用浓度:太高抑制太高抑制TaqTaq酶活性，太低，荧光信号太弱，不酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测易检测2.2.PrimerPrimer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.3.MgClMgCl2 2（多聚酶的激活剂）浓度（多聚酶的激活剂）浓度:可以降低
12、到可以降低到1.5mM,1.5mM,以减少非特异性产以减少非特异性产物物4.4.反应反应BufferBuffer体系的优化体系的优化5.5.反应温度和时间参数反应温度和时间参数:由酶和引物决定由酶和引物决定6.6.其他与常规其他与常规PCRPCR相同相同RT-qPCR 步骤步骤-SYBR Green法法q 对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性 -适用于任何适用于任何DNADNAq 使用方便使用方便 -不必设计复杂探针不必设计复杂探针q 非常灵敏非常灵敏q 便宜便宜优优 点点q 容易与非特异性双链容易与非特异性双链DNADNA结合，产结合，产生假阳性，生假阳性，但可以通过但可以通过融解曲线的分融解曲线的分析析，优化反应条件，优化反应条件q 对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高缺缺 点点Add Your Company SloganThank you
