1、2NH4Cl+AgCNONH4CNO+AgClNH4CNO（热）（NH2）2CO In vitroin vitro protein synthesis systemProkaryotic Expression SystemE.coli,B.subtilisyeastEukaryotic Expression System insect cellsmammalian cells.Prokaryotic Expression Systemn Escherichia.coli,because of the wealth of knowledge regarding its biochemistry
2、and genetics can be considered a good first choice for the preparation of proteins.n However,E.coli might not yield protein suitable for analysis,then other systems must be examined1.基因表达在原核生物与真核生物中的差别？基因表达在原核生物与真核生物中的差别？n原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。n在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子
3、的调节基在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同，与此同时，时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之转译也完成，随之mRNA也被水解掉。也被水解掉。n在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5和和3末端后才形成末端后才形成
4、mRNA。而。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。糖化、形成高级结构。2.真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法origin of replicationselection markerMCS promoterterminatorribosome binding site Prokaryotic Expression SystemP tac=3 P trp=11 P lac启动子-35 区序列-10 区序列 P lacT T T A C A T A
5、 T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T 启动子 转录调控机理 具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子 CAP 负调节因子 lac I IPTG诱导启动子-LacLac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录cAMPCAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平转录Lac 表达系统
6、 正调节因子 CAP cAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合 后，能促进 RNA 聚合酶与 35、10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5 cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPLac 表达系统 lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。Lac 表达系统 负调节
7、因子 lac I 在无诱导物情形下，lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平转录 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNA 转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有 效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中 往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达IAA诱导
8、启动子-TrpTrp 表达系统 以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 Trp 表达系统 Ptrp OtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNA Ptrp Otrp去除色氨酸高效转录mRNA Ptrp Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶Tac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的杂 合启动子。调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac=3 P trp=11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 la
9、cUV5 启动子更优越。启动子-35 区序列-10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T 杂合启动子-TacPL 和 PR 表达系统 以 l 噬菌体早期转录启动子 PL、PR 为核心构建的表达系统 在野生型 l 噬菌体中，PL、PR 启动子转录与否决定了 l 噬菌体进入 裂解循环还是溶源循环。温度诱导启动子-PL 和 PR PL 和 PR 表达系统 转录调控的机理 由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL、PR 启动子转录的 阻遏物。
10、cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。因此 PL、PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts)的基因产物 来调控 PL、PR 启动子的转录。在较低温度（30）时以活性形式存在 在较高温度（42）时失活脱落 T7 表达系统 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。最常用启动子-T7 T7 表达系统 T7 噬菌体编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。T7 RNA
11、 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆 菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录体系，最终受 T7噬 菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。T7 表达系统 转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。T7 RNA 聚合酶T7 启动子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因？启动子 T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型
12、噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。T7 RNA 聚合酶基因 lac 启动子E.Coli（DE3）T7 启动子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG诱导 T7 表达系统 转录调控的机理 温度诱导型 PL 启动子控制 T7 RNA 聚合 酶基因，通过热诱导方式激发 T7 噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到 很低的水平，尤其适用于表达 对大肠杆菌宿主有毒性的重组 蛋白质
13、。T7 RNA 聚合酶基因 PL 启动子E.Coli（CE6）T7 启动子 目的基因T7 RNA 聚合酶热诱导cI857 T7 表达系统 转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一个质粒带有 T7 启 动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标记 不能相同 调控方式为控制 T7 RNA 聚合 酶的启动子调控类型T7 RNA 聚合酶热诱导T7 启动子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 PL 启动子 cI857 p15A ori KanRColE1 ori AmpR3.2 The Terminatorn Stops RNA synthesis at specific
14、 points along the DNA templaten The enzyme stops polymerising nucleotides into RNA,releases the RNA chain and leaves the DNA to eventually reinitiate at another promoter.n Features:-A dyad symmetry in the DNA,centered 15 to 20 nucleotides before the end of the RNA this leads to a transcript that can
15、 form an hairpin loop-Run of about six As in the DNA template which are transcribed into Us at the end of the RNAHow could these two structuralfeatures cause termination?强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA
16、聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源基 因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其 它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外 源基因编码产物的翻译效率终止子强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。对于一些
17、终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特 殊结构，以增强其转录终止作用终止子核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）3.3核糖体结合位点核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的 68 个核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3 即Shine-Dalgarno（SD）序列，
18、它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3 端区域 3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合 将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5 端若干密码子的碱基序列核糖体结合位点 polymerase成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。Eukaryotic Expression Systemn1.Yeast Expression Syst
19、emsn2.Baculovirus Expression Systemsn3.Animal cells Expression Systems2.杆状病毒表达系统杆状病毒表达系统n杆状病毒只来源于无脊椎动物。n基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。n用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒毒n多角体基因缺失后，并不影响后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。n表达需要转录后修饰的基因n研究蛋白的生物合成和体内细胞间的转运机制n表达大肠杆菌和酵母不能表达的
20、含有内含子的基因序列哺乳动物细胞是最理想的表达人类基因的系统，哺乳动物细胞是最理想的表达人类基因的系统，应为首选。应为首选。体外翻译系统体外翻译系统（In vitro translation system）又称之为体外蛋白）又称之为体外蛋白质合成系统质合成系统(in vitro protein synthesis system)，是一种细胞裂解，是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质和，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDSPAGE后可检测出翻后可检测出翻译活性。译活性。常用翻译系统有以
21、下几种：常用翻译系统有以下几种：1.兔网织细胞裂解物兔网织细胞裂解物(reticylocyte lysate system)2.小麦胚抽提物小麦胚抽提物(wheat germ extract)3.两栖动物卵母细胞两栖动物卵母细胞 4.原核体外翻译系统原核体外翻译系统 体外翻译系统体外翻译系统 Commonly confronted questionsnShould the protein(s)be expressed in bacteria,in yeast,in insect cells or in human cells?nWhich expression vector should be
22、 used?n If bacterial expression is used,which strain(s)should be chosen?n Should one express the fulllength protein or a fragment thereof?nShould the protein be tagged,and which affinity tag is the best?nWhat is a good purification strategy,and what are the common pitfalls?nUnfortunately,because eve
23、ry protein is different,there can be no right answer to any of these questions a priori.How to choose protein expression system-There is no one expression system that does everything well,Each system has its strengths and weaknessesnThe expression of each cDNA or gene presents its own peculiar set of problems.The synthesis of foreign protein is still largely empirical.polymerase
