1、Map of the evolution of MD incidence.Colors represent the current existence of MD outbreaks as followed:red=current MD outbreaks;yellow=no current MD outbreaks;grey=data not available.The existence of MD outbreaks during 1990s is indicated by vertical stripes秘鲁俄罗斯尼日利亚摩洛哥葡萄牙中国1鸡马立克氏病导致脏器肿瘤及神经肿瘤2马立克氏病
2、引起免疫器官萎缩胸腺法氏囊 对照 vv vv+3IntroductionpMDV属于疱疹病毒科、马立克氏病病毒属。MDV粒子由核芯、核衣壳、被膜和囊膜组成，在感染细胞内可见直径为85-160 nm的六边形裸露颗粒即核衣壳。偶尔也能见到150-160 nm的有囊膜的病毒粒子；基因组为双股线性DNA长度约为166-180Kb。4病毒病毒血清型血清型致病性致病性MDV1vv+（1990s）1vv（1980s）1v（1970s）1m（1970s）MDV2非致病性（1980）HVT3非致病性（1970）MDV分类5Introduction早期溶细胞感染潜伏感染第二次溶细胞感染肿瘤增生-产生成熟病毒粒子6
3、早期溶细胞感染7（gI）马立克氏病病原-MDV（中国分离毒株-11株，国外毒株-14株）Four generations of MD Vaccines:测定序列-63株（2006-2013）腺胃肿瘤化为特征的病例IntroductionThe existence of MD outbreaks during 1990s is indicated by vertical stripes图4，5分别为大庆地区病料（瘤化的卵巢和肿大的肝脏）反转录病毒REV在疱疹病毒MDV基因组中的插入MDV098MDV和ALV都在成纤维细胞中复制，ALV胸腺，法氏囊中复制；REV，淋巴细胞或网状内皮细胞，成纤维细胞
4、中复制MDV meq序列-88株，共同的宿主-淋巴细胞和相同的微环境，MDV在羽毛囊上皮细胞中的复制8溶细胞感染淋巴细胞增生01003-6 天天3-4 周周时间感染9新特点 宿主范围扩大火鸡感染发病 混合感染REV、ALV（鸡病毒重组-LTR的插入）；NDV；细菌；霉菌 毒力增强突破不同MD疫苗的保护作用 急性发病症状3-4周龄即开始出现肿瘤，8-9周龄时已很严重，并能在3周龄引起特别严重的短暂麻痹，从而导致很高的死亡率 不同日龄鸡感染性Rosenberg等，注射和同居接触19、34 和49日龄的SPF鸡，出现临床发病和肿瘤病变 10IntroductionMDV毒力越来越强：m温和型、v强毒
5、力型、vv 超强毒力型、vv+超超强毒力型 临床症状由主要是慢性多发性神经炎转变为多发性神经炎和内脏淋巴瘤、内脏淋巴瘤、神经症状、严重的脑水肿和急性死亡11国内MD发病情况-黑龙江病例（多发性肿瘤）图1，2，3分别为牡丹江地区病料（瘤化的卵巢、肠系膜和脾脏）。图4，5分别为大庆地区病料（瘤化的卵巢和肿大的肝脏）13245青脚黄鸡3/3MD+，1/3只AL+270日龄，900只 海兰褐，病死近100只，12 吉林省病例（多发性肿瘤）图1为发病鸡，2和3为系膜瘤，4为肝脏瘤。1234长春，8/11 MD+，5000只，至110日龄，死100013辽宁省病例（混感）图1为肌肉瘤，2为瘤化的腺胃，3为
6、瘤化的肝脏。1234万套，海兰褐蛋种鸡，110日龄发病，A亚群ALV 9/11 AGP-2/11，MD+，PCR-3/8MD+公鸡40%A亚群14江苏病例（乌鸡和麻鸡）肾脏肿40和60日龄，10%15山东110日龄，10000只，发病20-30%，9/10 MD+腺胃肿瘤化为特征的病例16大连沈阳腺胃肿瘤化为特征的病例17哈尔滨牡丹江脾脏肿瘤18年度年度省份省份鸡场数鸡场数病料数病料数MD阳性鸡场数阳性鸡场数MD阳性病料数阳性病料数MD阳性率阳性率2013755159378767.3%201210512143915276.5%2011630149199563.3%合计 13652295334平
7、均69.1%2011-2013年MDV流行病学检测-我国MDV呈经常性、普遍性散发状态 省 鸡场 病料 阳性鸡场 阳性病料 阳性率19肿瘤细胞呈占位性，呈局灶性浸润。MDV098Introduction符合强、弱毒的分子特征共同的宿主-淋巴细胞和相同的微环境，IRs区插入的相对位置（MDV Md5）MDV与REV混感和分子重组Percentage MD EMSMDV粒子由核芯、核衣壳、被膜和囊膜组成，在感染细胞内可见直径为85-160 nm的六边形裸露颗粒即核衣壳。MDV毒力越来越强：m温和型、v强毒力型、vv 超强毒力型、vv+超超强毒力型MDV096我们测的63株中除了3株位于弱毒分支外，
8、其他的60株位于一个独立进化分支（不同于国外的毒株）。同时可见肿瘤细胞的坏死（核浓缩）混合感染现象-商业鸡群-多致瘤病毒共感染控制混感-重组、加重MD？年度年度MDVMDV+REVMDV+ALVMDV+CAVMDV+REV+CAVMDV+ALV+CAVMDV+REV+ALV+CAV201337403120201239135142201119141011合计95679273MDV与REV、ALV和CAV的混合感染（2011-2013）-混合感染是常见现象20序号序号病毒病毒名称名称分离分离时间时间病料采集病料采集地点地点发病发病鸡鸡日日龄龄代次代次132bp拷贝拷贝数数Meq(bp)致病性致病性
9、1SY062006.06辽宁NAF321020vvMDV2CGZ072007.09黑龙江NAF3多1197mMDV3MS072007.08四川NAF621020vvMDV4QQHE2007.12黑龙江NAF421020vvMDV5HuaY2008.09四川50F3210206HC1102008.05辽宁110F3多11207HC32008.12辽宁NAF2210208HC1352008.05辽宁135F921020vv+MDV9DH12008.05吉林NAF22102010HC1402008.05辽宁NAF42102011DH72009.04吉林NAF32102012LY112011.06辽宁
10、NAF421020vv MDV13MDJ112011.02黑龙江NAF22102014Hrb112011.03黑龙江NAF32102015ChangZou2011.03江苏NAF4多119716JLCC2011.10吉林114F421020vv+MDV17SDWC2011.11山东110F321020vv MDV18SDCY2011.11山东40F721020vv+MDV19JSYC2012.10江苏NAF321020vv MDV20HB122012.08河北60F221020vv MDV21MDJ20122012.12黑龙江100F42102022HLJWC122012.03黑龙江95F32
11、1020vv MDV23ZY122012.03江苏NAF421020vv MDV24JLSY2012.04吉林125F52102025SYTS72012.03辽宁80F42102026SY122012.09辽宁63F3多1197mMDV27TS62012.03辽宁NAF321020vv+MDV28JZ52012.04辽宁NAF32102029YH112012.04辽宁NAF32102030DH132013.07吉林112F32102031LY132013.09吉林140F22102032MDJ132013.05黑龙江NAF321020MDV分离毒株特性注：NA表示未知，“”表示未检测。MDV流
12、行毒株致病性多在vv（9）-vv+（4）符合强、弱毒的分子特征177bp21病毒病毒Virus鸡数鸡数Number of chickensMD早期死亡率（早期死亡率（%）Percentage MD EMSMD死亡率（死亡率（%）Percentage MD mortalityMD阳性率（阳性率（%）Percentage total MDSY1764.764.7100ZY17035.394.1YC15202080FY15040100QQHE152020100HB13038.5100WC122001095ZY12201020100JS1210251421.428.6100WC1114021.3100
13、GA17023.582.4PBS1500010株MDV分离毒株对SPF鸡的致病性MDV流行毒株对鸡具有高致病性22病毒病毒疫苗疫苗鸡数鸡数MD死亡鸡数死亡鸡数MD阳性率阳性率保护指数（保护指数（PI）HBCVI9881108/1127.3WC12CVI9881600/16100ZY12CVI9881703/1782.3JS121025CVI9881026/1040WC11CVI9881202/1283.3GACVI9881700/17100PBSCVI9881500/15-PBSPBS1500/15-5株MDV分离毒株对免疫鸡（CVI988疫苗）的致病性-MDV致病性增加；现有疫苗对某些毒株不
14、能提高完全保护。23MDV与REV混感和分子重组一个混感感染病例 2011年某鸡场商品蛋鸡，40日龄开始发病。症状-腺胃炎，腺胃肿；鸡瘦小；有死亡；无明显肿瘤。送检鸡-52日龄。检测结果MDV+、REV+24电镜负染切片MDVREV存在MDV和REV病毒粒子25组别组别疫苗疫苗发病率发病率肿瘤率肿瘤率死亡率死亡率保护指数保护指数 攻毒组15/15，100%15/15，100%14/15，93%CVI9889/14，64%7/14，50%0/14，0%36空白对照组0/15，0%0/15，0%0/15，0%-高发病率、高致死率、高肿瘤率；突破疫苗保护高发病率、高致死率、高肿瘤率；突破疫苗保护.致
15、病性26分离株攻毒 -腺胃MDV肿瘤特征肿瘤组织病理学观察组织上以多形态的淋巴细胞增生浸润为基础，包括小型、中型和大型淋巴细胞。即，细胞的大小不一，形态各异。细胞核淡明，核仁大而明显。浸润范围广泛，取代原来的正常组织（腺胃）。腺胃的肿瘤细胞可见多数的异常核分裂像。同时可见肿瘤细胞的坏死（核浓缩）27CVI988-分离株组-肾-肝-腺胃-肿瘤的差异REV肿瘤特征肿瘤细胞为成淋巴细胞。细胞大小均一，细胞核淡明，核仁1-数个。细胞浆淡染，细胞界限不明显。未见核分裂像。肿瘤细胞呈占位性，呈局灶性浸润。肿瘤组织病灶通常呈圆形或类圆形。未见肿瘤细胞凋亡和坏死。28背景：反转录病毒REV在疱疹病毒MDV基因
16、组中的插入重组基础混合感染混合感染现象-商业鸡群-多致瘤病毒共感染共同的宿主共同的宿主-淋巴细胞和相同的微环境，MDV-感染B和T淋巴细胞，转化T；ALV引起骨髓细胞转化MDV和ALV都在成纤维细胞中复制，ALV胸腺，法氏囊中复制；REV，淋巴细胞或网状内皮细胞，成纤维细胞中复制反转录病毒反转录病毒为了自身复制自身复制，可以整合到任何双链DNA中（宿主、MDV、HVT、禽痘病毒）细胞中相细胞中相同的复制同的复制位置位置29REV在MDV基因组中的插入验证Hot-Spot PCR（REV和MDV上下游交叉引物检测，病毒重组的验证）30MDV pBAC-C全基因组序列C 全长全长TRLULIRLI
17、RSUSTRSREV LTR大小大小(bp)1778111291311354212913129411035012346533（2）位置位置1-177811 964-1387613877-127418127419-140331141210-154150154151-164500164501-176846153096-152564165795-16526331组织上以多形态的淋巴细胞增生浸润为基础，包括小型、中型和大型淋巴细胞。ALV引起骨髓细胞转化测定序列-63株（2006-2013）MDV流行毒株致病性多在vv（9）-vv+（4）注：NA表示未知，“”表示未检测。MD疫苗“814”株-净化-混
18、合感染是常见现象REV，淋巴细胞或网状内皮细胞，成纤维细胞中复制控制污染源 -抗病力 -免疫REV在MDV基因组中的插入验证组织上以多形态的淋巴细胞增生浸润为基础，包括小型、中型和大型淋巴细胞。（gE）检测结果MDV+、REV+同时可见肿瘤细胞的坏死（核浓缩）MDV和ALV都在成纤维细胞中复制，ALV胸腺，法氏囊中复制；IRs区插入的相对位置（MDV Md5）LTR MDV086（细胞质蛋白）MDV085 （预测蛋白）MDV083（反义RNA蛋白）MDV084 （ICP4）MDV087（MDV1 S2）MDV088 （ICP22）MDV089 （Us10）IRs区32TRs区插入的相对位置（M
19、DV Md5）LTR MDV097（MDV1 S2）MDV096 （gE）MDV095 （gI）MDV098（细胞质蛋白）MDV099（预测蛋白）MDV101（反义RNA蛋白）MDV100 （ICP4）TRs区33插入重组的意义插入重组的意义：反转录病毒是混乱宿主和疱疹病毒遗传物质的元件之一。这种重组可能改变MDV的组织趋向性、传播方式、致病性、疫苗保护性-MDV的进化？34MDV meq序列-88株，测定序列-63株（2006-2013）参考序列-25株（中国分离毒株-11株，国外毒株-14株）我们测的63株中除了3株位于弱毒分支外，其他的60株位于一个独立进化分支（不同于国外的毒株）。L-
20、MDJ-5-201305L-LY-201310182L-MDJ-2-20130130L-LY-2013091620L-CC-20131204L-JLSY2012020730LSY2L-HB2012083030LNMGYL040920 DQ174459 China3L-MDJ2011GX070079 EU427304 China200LHuaYGX070060 EU427303 China3L-WC120120312LQQHE200LCZL-HN201203263L-YH201203GXY2 EF 546430 China200LFYL-MLHN20113MDJ20121205L-LNCY201
21、20518400L-SD20120723LCDLMS200L-SD2011L-TS201203-100L-CY2011L-CC124-201100L-GYL-20120812L-NT20121113L-30048510LFY-20130306L-QD-201300L-LY2011LCC00L-DQ20131014L-HT2012111500L-HL2011LMDJ-4-2013030196L-YC20121025L-hrb2012091815L-HYYM20120725L-HC20111560100LLYLSY420LMDJ-3-201301300L-MDJ-1-201301301LHC235
22、71 DQ534531 meqN AF493557 ChinaL-hrb2012091428L-ZY201203170095 AF493552 China16LDHLYC19L-DQ2011L-MDJ-6-201309091665LZYG2 AF493556 China1517LHC3L-DL2011L-DL20111213L-DL-20131119LHC4LHC51463948287811648a DQ534534 meq686 DQ534535 meq52549a DQ534530 meq595 DQ534533 meq7374584a DQ534532 meq61md5 AF243438
23、 meq31RB1B DQ534541 meqRM-1 DQ534542 meqJM102W DQ534539 meq71GA AF147806 meq28CU-2 DQ534537 meq7CVI988 Intervet DQ534538 meqLCGZGX060167 EU697887 China14CVI988-BP5L-DH-20130725C3L-SY-2012090417753642320980297 AF493553 China600093 AF493550 China0304 AF493554 China60MDV meq我国MDV流行毒株处于一个独立的进化分支35A：MDV毒
24、株的长重复区遗传进化树B：MDV毒株的短重复区遗传进化树3615株MDV（全基因组）分子进化37K株的KC25和45代（稳定性）-PI：88.MDV pBAC-C全基因组序列MDV pBAC-C全基因组序列MDV pBAC-C全基因组序列马立克氏病引起免疫器官萎缩MDV和ALV都在成纤维细胞中复制，ALV胸腺，法氏囊中复制；Introduction反转录病毒是混乱宿主和疱疹病毒遗传物质的元件之一。HVT(1970s)病毒粒子的数量较多-几乎每个细胞都有病毒粒子Introduction吉林省病例（多发性肿瘤）图1为发病鸡，2和3为系膜瘤，4为肝脏瘤。Introduction（MDV1 S2）MD
25、V095MD的防控 防止雏鸡MDV野毒早期感染 控制混感-重组、加重MD？免疫特点-非清除性抗肿瘤免疫、占位干扰作用-超感染和超感染抑制？-控制传播 疫苗-毒株？-感染程度？免疫剂量 二次免疫控制污染源 -抗病力 -免疫 38MD疫苗株的应用Four generations of MD Vaccines:1.致弱的血清1型毒株(1970)2.HVT(1970s)3.双价苗HVT+SB1(1983)4.CVI988(Rispens株)(1990s)，“814”株 39我国MD疫苗使用情况曾经使用的疫苗：HVT、CVI988、“814”、HVT+SB1、HVT+Z4、HVT+SB1+“814”、C
26、VI988+HVT当前主要使用的疫苗：种鸡、蛋鸡-CVI988、“814”、HVT、CVI988+HVT 肉鸡-主要为HVTHVT-IBDV-VP2-“立克法”“威力克”40814弱毒疫苗种毒株的建立弱毒疫苗种毒株的建立策略：自然弱毒中筛选、建立-弱毒疫苗种毒株优点-安全性好、稳定性好和免疫效力好。黑龙江省牡丹江（白洛克和来航）-多年没有发生MD-毒株培育：K株-DEF、CES；-“814”S株-DEF、QEF-毒株血清型和致病性：血清1型，自然弱毒株41安全性：安全性：（1）接种鸡12个月-（2）回归易感鸡10代免疫原性免疫原性：实验室免疫攻毒（J-1株）K株的KC25和45代（稳定性）-P
27、I：88.9传代传代特点特点:1.KC50-非融合细胞-50-120代也很少见2.病毒粒子的数量较多-几乎每个细胞都有病毒粒子3.容易见到-有囊膜的完全病毒粒子母源抗体干扰母源抗体干扰-HVT、“814”免疫鸡群42MD疫苗“814”株-净化净化必要性-强细胞嗜性-禽源RNA病毒、支原体污染-免疫失败的主要原因之一-MDV 814病毒DNA拯救疫苗疫苗强毒株强毒株保护指数（保护指数（PI）“814”克隆株J-1（国内vMDV）82-93GA（vMDV）Md5（vvMDV）ZY（分离毒株）SY（分离毒株）“814”克隆株的免疫原性43总结：1.我国MD流行呈现散发状态，发病率阶段性增高。2.多种
28、病原混感是疫苗免疫失败的一个重要原因。3.我国流行的MDV毒力向更高方向进化。4.进化分析表明，我国的MDV流行株已经发生明显变化，并且处于一个独立的进化分支。5.正确使用疫苗和控制病原污染是防控MD的主要方法。44谢谢大家！45Map of the evolution of MD incidence.Colors represent the current existence of MD outbreaks as followed:red=current MD outbreaks;yellow=no current MD outbreaks;grey=data not available.T
29、he existence of MD outbreaks during 1990s is indicated by vertical stripes秘鲁俄罗斯尼日利亚摩洛哥葡萄牙中国46Introduction早期溶细胞感染潜伏感染第二次溶细胞感染肿瘤增生-产生成熟病毒粒子47MDV pBAC-C全基因组序列Introduction-毒株培育：K株-DEF、CES；Four generations of MD Vaccines:（gI）MD疫苗“814”株-净化The existence of MD outbreaks during 1990s is indicated by vertical
30、 stripes2011-2013年MDV流行病学检测宿主范围扩大火鸡感染发病细胞核淡明，核仁大而明显。2011-2013年MDV流行病学检测组织上以多形态的淋巴细胞增生浸润为基础，包括小型、中型和大型淋巴细胞。肿瘤细胞呈占位性，呈局灶性浸润。IntroductionK株的KC25和45代（稳定性）-PI：88.早期溶细胞感染48序号序号病毒病毒名称名称分离分离时间时间病料采集病料采集地点地点发病发病鸡鸡日日龄龄代次代次132bp拷贝拷贝数数Meq(bp)致病性致病性1SY062006.06辽宁NAF321020vvMDV2CGZ072007.09黑龙江NAF3多1197mMDV3MS0720
31、07.08四川NAF621020vvMDV4QQHE2007.12黑龙江NAF421020vvMDV5HuaY2008.09四川50F3210206HC1102008.05辽宁110F3多11207HC32008.12辽宁NAF2210208HC1352008.05辽宁135F921020vv+MDV9DH12008.05吉林NAF22102010HC1402008.05辽宁NAF42102011DH72009.04吉林NAF32102012LY112011.06辽宁NAF421020vv MDV13MDJ112011.02黑龙江NAF22102014Hrb112011.03黑龙江NAF321
32、02015ChangZou2011.03江苏NAF4多119716JLCC2011.10吉林114F421020vv+MDV17SDWC2011.11山东110F321020vv MDV18SDCY2011.11山东40F721020vv+MDV19JSYC2012.10江苏NAF321020vv MDV20HB122012.08河北60F221020vv MDV21MDJ20122012.12黑龙江100F42102022HLJWC122012.03黑龙江95F321020vv MDV23ZY122012.03江苏NAF421020vv MDV24JLSY2012.04吉林125F52102
33、025SYTS72012.03辽宁80F42102026SY122012.09辽宁63F3多1197mMDV27TS62012.03辽宁NAF321020vv+MDV28JZ52012.04辽宁NAF32102029YH112012.04辽宁NAF32102030DH132013.07吉林112F32102031LY132013.09吉林140F22102032MDJ132013.05黑龙江NAF321020MDV分离毒株特性注：NA表示未知，“”表示未检测。MDV流行毒株致病性多在vv（9）-vv+（4）符合强、弱毒的分子特征177bp49分离株攻毒 -腺胃MDV肿瘤特征肿瘤组织病理学观察组
34、织上以多形态的淋巴细胞增生浸润为基础，包括小型、中型和大型淋巴细胞。即，细胞的大小不一，形态各异。细胞核淡明，核仁大而明显。浸润范围广泛，取代原来的正常组织（腺胃）。腺胃的肿瘤细胞可见多数的异常核分裂像。同时可见肿瘤细胞的坏死（核浓缩）50CVI988-分离株组-肾-肝-腺胃-肿瘤的差异REV肿瘤特征肿瘤细胞为成淋巴细胞。细胞大小均一，细胞核淡明，核仁1-数个。细胞浆淡染，细胞界限不明显。未见核分裂像。肿瘤细胞呈占位性，呈局灶性浸润。肿瘤组织病灶通常呈圆形或类圆形。未见肿瘤细胞凋亡和坏死。51背景：反转录病毒REV在疱疹病毒MDV基因组中的插入重组基础混合感染混合感染现象-商业鸡群-多致瘤病毒
35、共感染共同的宿主共同的宿主-淋巴细胞和相同的微环境，MDV-感染B和T淋巴细胞，转化T；ALV引起骨髓细胞转化MDV和ALV都在成纤维细胞中复制，ALV胸腺，法氏囊中复制；REV，淋巴细胞或网状内皮细胞，成纤维细胞中复制反转录病毒反转录病毒为了自身复制自身复制，可以整合到任何双链DNA中（宿主、MDV、HVT、禽痘病毒）细胞中相细胞中相同的复制同的复制位置位置52MDV meq序列-88株，测定序列-63株（2006-2013）参考序列-25株（中国分离毒株-11株，国外毒株-14株）我们测的63株中除了3株位于弱毒分支外，其他的60株位于一个独立进化分支（不同于国外的毒株）。L-MDJ-5-
36、201305L-LY-201310182L-MDJ-2-20130130L-LY-2013091620L-CC-20131204L-JLSY2012020730LSY2L-HB2012083030LNMGYL040920 DQ174459 China3L-MDJ2011GX070079 EU427304 China200LHuaYGX070060 EU427303 China3L-WC120120312LQQHE200LCZL-HN201203263L-YH201203GXY2 EF 546430 China200LFYL-MLHN20113MDJ20121205L-LNCY201205184
37、00L-SD20120723LCDLMS200L-SD2011L-TS201203-100L-CY2011L-CC124-201100L-GYL-20120812L-NT20121113L-30048510LFY-20130306L-QD-201300L-LY2011LCC00L-DQ20131014L-HT2012111500L-HL2011LMDJ-4-2013030196L-YC20121025L-hrb2012091815L-HYYM20120725L-HC20111560100LLYLSY420LMDJ-3-201301300L-MDJ-1-201301301LHC23571 DQ5
38、34531 meqN AF493557 ChinaL-hrb2012091428L-ZY201203170095 AF493552 China16LDHLYC19L-DQ2011L-MDJ-6-201309091665LZYG2 AF493556 China1517LHC3L-DL2011L-DL20111213L-DL-20131119LHC4LHC51463948287811648a DQ534534 meq686 DQ534535 meq52549a DQ534530 meq595 DQ534533 meq7374584a DQ534532 meq61md5 AF243438 meq31RB1B DQ534541 meqRM-1 DQ534542 meqJM102W DQ534539 meq71GA AF147806 meq28CU-2 DQ534537 meq7CVI988 Intervet DQ534538 meqLCGZGX060167 EU697887 China14CVI988-BP5L-DH-20130725C3L-SY-2012090417753642320980297 AF493553 China600093 AF493550 China0304 AF493554 China60MDV meq我国MDV流行毒株处于一个独立的进化分支53
