1、血红蛋白的提取和分离(经典)氨基酸的结合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH氨基酸的结合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH氨基酸的结合方式氨基酸的结合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽键脱水缩合氨基酸的结合方式氨基酸的结合方式:脱水缩合脱水缩合肽键CHCOOHR3HNOH HCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O氨基酸的结合方式氨基酸的结合方式:脱水缩合脱水缩合CCHR1NH2COCHR2HNO肽键二肽CHCOOHR3HNH2O肽键三肽 以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成
2、的含有多个肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠，肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠，形成有一定空间结构的蛋白质分子。形成有一定空间结构的蛋白质分子。H2O血红蛋白血红蛋白思考1 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构思考2 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等
3、分离生物大分子的基本原理。解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法样品的处理样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。1、凝胶色谱法、凝胶色谱法 凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的
4、方法之一，又据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称称分子筛层析分子筛层析。凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等烯酰胺、葡聚糖凝胶等 一、基本概念及原理一、基本概念及原理原理：原理：当不同的蛋白质通过凝胶时当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较小相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶内部的通道凝胶内部的通道容易进入容易进入无法进入凝胶无法进入凝胶内部的通道内部的通道只能在凝胶外部移动只能在凝胶外部移动路程路程较长较长移动速度移动速度较慢较慢路程路程较短较
5、短移动速度移动速度较快较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。分离蛋白质分离蛋白质 在一定范围内，能够抵制在一定范围内，能够抵制 对溶对溶液液PHPH值的影响，维持值的影响，维持PHPH 不变。不变。通常由通常由 溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。调节缓冲剂调节缓冲剂 的就可以制得在的就可以制得在 使使用的缓冲液。用的缓冲液。,利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境，保证环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察血红蛋白的正常结构和功能，便于观察()和科和科 学研究学研究()磷酸缓冲液磷酸缓冲液外界的酸和碱外界的酸和碱基本基本
6、12 种缓冲剂种缓冲剂使用比例使用比例不同不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3带电粒子在带电粒子在 作用下发生作用下发生 的过程。的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有具有 的基团，在一定的的基团，在一定的PHPH下，这些基团会带下，这些基团会带上上 或或 。在电场的作用下，这些带电分子。在电场的作用下，这些带电分子会向着的会向着的 的电极移动。电泳利用的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子了待分离样品中各种分子 以及分子以及分子本身的本身的
7、 、的不同，使带电分子产生不同的不同，使带电分子产生不同的的 ，从而实现样品中各种分子的分离。，从而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。电场电场迁移迁移可解离可解离正电正电负电负电与其所带电荷相反与其所带电荷相反带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度 最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适
8、合于分离，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。大多数蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）迷你双垂直电泳槽迷你双垂直电泳槽等电聚焦多用电泳槽等电聚焦多用电泳槽卧式电泳槽卧式电泳槽电泳槽电泳槽9 （1 1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素。等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小它所带静电荷的多少以及分子的大小（2）、）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有
9、电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（迁移率完全取决于（）。）。分子的大小分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图（A为正面，B为剖面）1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.73：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.310琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。测
10、定蛋白质的相对分子质量常用测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。带电荷的性质和分子的大小、形状。【典例典例1 1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是A.A.它们都是分离蛋白质的重要方法它们都是分离蛋白质的重要方法B.B.它们的原理相同它们的原理相同C.C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D.D.以上说法都正确以上说法都正确 【解题关键
11、解题关键】解答本题的关键应明确以下两点：解答本题的关键应明确以下两点：(1)(1)凝胶色谱法的原理；凝胶色谱法的原理；(2)(2)电泳法的原理。电泳法的原理。A二、实验步骤二、实验步骤 蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定（电泳）纯度鉴定（电泳）样品处理样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程粗分离：粗分离：纯化：纯化：纯度鉴定纯度鉴定透析透析去除样品中分子量较小的杂质去除样品中分子量较小的杂质用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质杂质SDS
12、-聚丙烯酰胺凝胶电泳每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。呈红色。采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用 离心，用 洗 涤，重复洗涤 ，直至 C、能否用蒸馏水代替生理盐水？去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化低速短时间低速短时间五倍体积的生理盐水五倍体积的生理盐水三次三次 上清液不再呈现黄色，上清液不再呈现黄色，表明
13、红细胞已洗涤干净表明红细胞已洗涤干净不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。初次离心后的结果3次洗涤后的结果（2）释放血红蛋白）释放血红蛋白思考：思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？（使用磁力搅拌器充分搅拌）（使用磁力搅拌器充分搅拌）目的分析：目的分析：1.蒸馏
14、水的作用是蒸馏水的作用是_。2.加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。3.充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作（3）分离血红蛋白溶液：）分离血红蛋白溶液：用滤纸过滤，除去用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片分液漏斗中静置片刻后，分出下层的刻后，分出下层的红色透明液体。红色透明液体。柜式离心机 2.粗分离-透析（去除分子量较小的杂质）（1）用 方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成，常用 。将透析袋放入 溶液中进行透析。（2）透析的
15、原理是（3）透析的目的是 。透析透析玻璃纸、肠衣、膀胱膜玻璃纸、肠衣、膀胱膜 透析袋能使小分子自由进出，而将透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内大分子保留在袋内去除样品中分子量较小的杂质去除样品中分子量较小的杂质磷酸缓冲磷酸缓冲（1 1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，两厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。3、纯化（凝胶色谱）、纯化（凝胶色谱）-去除相对分
16、子量去除相对分子量较大的杂质蛋白较大的杂质蛋白 凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作A A、材料：交联葡聚糖凝胶（、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。配置凝胶悬浮液：计算并称取一定配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶悬浮液。A A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1 1、
17、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。间的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果果。教材教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、为什么凝胶的装填要紧密、均匀？均匀？如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效
18、果。质的洗脱次序，影响分离的效果。装配好的凝胶柱(3(3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱加样前加样前 打开下端出口，使柱内凝打开下端出口，使柱内凝胶面上的（胶面上的（）缓慢下）缓慢下降到与（降到与（）平齐，）平齐，关闭出口关闭出口缓冲液缓冲液凝胶面凝胶面正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。加透析样品加透析样品立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液
19、凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱材料：材料：交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶G-75G-75 20mmol/L20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液“G”G”表示表示什么？什么？7575代表什么？代表什么？3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 1.调液面调液面 2.加样加样 3.再调液面再调液面 4.洗脱洗脱 5.收集收集缓冲液缓冲液凝胶凝胶调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：加到色谱柱的（滴加透析样
20、品：加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：（）再调整缓冲液面洗脱：再调整缓冲液面洗脱：收集：待（收集：待（）接近色谱柱底）接近色谱柱底端时收集端时收集顶端顶端样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层红色的蛋白质红色的蛋白质4、纯度鉴定（电泳）、纯度鉴定（电泳）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。1、垂直板电泳装置、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）、微量进样器（可用微量移液器代替）（1）、）、胶板的制备：胶板的制备：.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 .把玻璃板在
21、灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好（2）、分离胶的制备：）、分离胶的制备：按下表制备分离胶按下表制备分离胶(T=12%,pH=8.8)试剂试剂 双蒸水双蒸水 分离胶缓冲液分离胶缓冲液 丙胶贮液丙胶贮液 Ap TEMED用量用量 1.65mL 1.3mL 2.0mL 0.05mL 0.002mL 胶灌至距梳子齿下端胶灌至距梳子齿下端1cm灌毕灌毕封上一层水封上一层水当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。（3）、）、浓缩胶的制备：浓缩胶的制备：按下表制备浓缩胶按下表制备浓缩胶(T=4%,pH=6.8)试剂试剂 双蒸水双蒸水 浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液 丙胶贮液丙
22、胶贮液 Ap TEMED用量用量 1.46mL 0.25mL 0.27mL 0.02mL 0.002mL 用滤纸吸干水用滤纸吸干水倒入浓缩胶倒入浓缩胶插入梳子插入梳子聚合。聚合。（4）、取样）、取样 取纯化后的血红蛋白样品取纯化后的血红蛋白样品10 L加入加入10 L上样上样buffer（内含少许溴酚蓝的（内含少许溴酚蓝的40蔗糖蔗糖）混匀。）混匀。（5）装槽、点样：）装槽、点样：拔出梳子拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上（凹板将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）一侧向内）在电泳槽中加入缓冲液在电泳槽中加入缓冲液 点样点样。（6）电泳：）电泳：（7)、剥胶、染色及脱色、剥胶、染色及脱色 凝胶板剥离
23、：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。色，然后用脱色液脱色。(8)、结果、结果 1 1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。因此操作必须在通风橱内或通风处进行。2 2、TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用
24、，吞服可致命。致命。3 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。步骤完成。操作时要戴好一次性手套。影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能正常。范围内，维持结构和功能正常。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作
25、。血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液（离心）等操作收集到血红蛋白溶液，释放、分离血红蛋白溶液（离心）等操作收集到血红蛋白溶液，即即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后粗分离；然后将相对分子质量较大的杂质蛋白将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即除去，即:样品的纯化；最后经样品的纯化；最后经进行纯度鉴进行纯度鉴定。定。【典例典例2 2】(2011(2011扬州高二检测扬州高二检测
26、)如图表示血红蛋白提取和分如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：离的部分实验装置，请回答下列问题：(1)(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。功能。(2)(2)甲装置中，甲装置中，B B是血红蛋白溶液，则是血红蛋白溶液，则A A是是_；乙装；乙装置中，置中，C C溶液的作用是溶液的作用是_。(3)(3)甲装置用于甲装置用于_ _，目的是，目的是_。用乙装置分离蛋白。用乙装置分离蛋白质的方法叫质的方法叫_，是根据，是根据_分离蛋分离蛋白质
27、的有效方法。白质的有效方法。(4)(4)用乙装置分离血红蛋白时，待用乙装置分离血红蛋白时，待_-_-_时，用试管收集流出液，每时，用试管收集流出液，每5 mL5 mL收集一管，连续收集。收集一管，连续收集。运输运输磷酸缓冲液磷酸缓冲液洗脱血红蛋白洗脱血红蛋白透析透析(粗分离粗分离)去除样品中相对分子质量较小的杂质去除样品中相对分子质量较小的杂质凝胶色谱法凝胶色谱法相对分子质量的大小相对分子质量的大小红色的蛋白质接近色谱柱底端红色的蛋白质接近色谱柱底端观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-5-1818），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、
28、未能除去血浆蛋），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如
29、何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装
30、柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。装填有关。教学反馈教学反馈 1凝胶色谱法是根据（凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小分子的大小 B相对分子质量的大小相对分子质量的大小 C带电荷的
31、多少带电荷的多少 D溶解度溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（维持（）基本不变。）基本不变。A温度温度 B pH C渗透压渗透压 D氧气浓度氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。）的电极移动。A相同相同 B相反相反 C相对相对 D相向相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的）与氧气的运输有关。运输有关。A血红蛋白血红蛋白 B肌红蛋白肌红蛋白 C肌动蛋白肌动蛋白 D肌球蛋白肌球蛋白BBBA5血液由血浆和各种
32、血细胞组成，其中（血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。的含量最多。A白细胞白细胞 B血小板血小板 C红细胞红细胞 D淋巴细胞淋巴细胞6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（凝血剂（）。）。A.NaCl B.甲苯甲苯 C.蒸馏水蒸馏水 D.柠檬酸钠柠檬酸钠7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为可以明显看到试管中的溶液分为4层，层，其中第其中第3层是（层是（）A无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液血红蛋白的水溶
33、液 D其他杂质的暗红色沉淀物其他杂质的暗红色沉淀物CDC1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量
34、较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬
35、酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：分层顺序自上而下是：有机溶剂有机溶剂-脂类物质脂类物质-血红蛋白溶液血红蛋白溶液-红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀1.1.答答:凝胶色谱法也称为分配色谱法凝胶色谱法也称为分配色谱法,它是根据分子量的大小分它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一离蛋白质的方法之一.所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体,这些小球体大多数是由多糖类化合物
36、构成这些小球体大多数是由多糖类化合物构成,小球体内部有许多贯小球体内部有许多贯穿的通道穿的通道,当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时,各分子在各分子在色谱柱内进行两种不同的运动色谱柱内进行两种不同的运动,即垂直向下的运动和无规则的扩即垂直向下的运动和无规则的扩散运动散运动.相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能只能分布在颗粒之间分布在颗粒之间,通过的路程较短通过的路程较短,移动速度较快移动速度较快;相对分子质量相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道较小的蛋白质分子比较容易进入凝
37、胶内的通道,通过的路程较长通过的路程较长,移动速度较慢移动速度较慢.因此因此,样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最小的分子最后相对分子质量最小的分子最后流出流出,这种现象又叫分子筛现象这种现象又叫分子筛现象.1.1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?答答:在一定范围内在一定范围内,能对抗外来少量强酸能对抗外来少量强酸,强碱或稍加强碱或稍加稀释不引起溶液稀释不引起溶液pHpH发生明显变化的作用叫做缓冲作用发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用
38、的溶液叫做缓冲溶液具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液.缓冲溶液通常是由一或两种缓冲剂溶解于水中制得缓冲溶液通常是由一或两种缓冲剂溶解于水中制得,调节调节缓冲剂的配比就可制得不同缓冲剂的配比就可制得不同pHpH范围的缓冲液范围的缓冲液.缓冲溶液的作用维持反应体系的缓冲溶液的作用维持反应体系的pHpH不变不变.在生物体内进在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的行的各种生物化学过程都是在精确的pHpH下进行的下进行的,受到氢受到氢离子浓度的严格调控离子浓度的严格调控.为了在实验室条件下准确地模拟生为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境物体内的天然环境,就必须保持体外生物化学反应过程有就必须
39、保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的与体内过程完全相同的pH.pH.2.2.什么是缓冲溶液什么是缓冲溶液?它的作用是什么它的作用是什么?原理：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过原理：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程程.许多重要的生物大分子许多重要的生物大分子,如氨基酸如氨基酸,多肽多肽,蛋白质蛋白质,核苷核苷酸酸,核酸等都具有可解离基团核酸等都具有可解离基团,它们在某个特定的它们在某个特定的pHpH下会下会带上正电或负电带上正电或负电;在电场的作用下在电场的作用下,这些带电分子会向着这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动与其所带电荷相反的电极方向移动.作
40、用：电泳技术就是在电场的作用下作用：电泳技术就是在电场的作用下,利用待分离样品利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小中各种分子带电性质以及分子本身大小,形状等性质的形状等性质的差异差异,使带电分子产生不同的迁移速度使带电分子产生不同的迁移速度,从而达到对样品从而达到对样品进行分离进行分离,鉴定或提纯的目的鉴定或提纯的目的.3.3.电泳的作用及其原理是什么电泳的作用及其原理是什么?答答:血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,包括包括:样品处理样品处理,粗分离粗分离,纯化和纯度鉴定纯化和纯度鉴定.首先通过洗涤红细胞首先通过洗涤红细胞,血红蛋白的释放血红
41、蛋白的释放,离心等操作收集到血红蛋白溶液离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样即样品的处理品的处理;再经过透析去除分子量较小的杂质再经过透析去除分子量较小的杂质,即样品的即样品的粗分离粗分离;然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去白除去,即样品的纯化即样品的纯化;最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定纯度鉴定.答答:血红蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可以通因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液.这使血红蛋这使血红蛋白的分离过程非常直观
42、白的分离过程非常直观,大大简化了实验操作大大简化了实验操作.4.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?5.5.与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点红细胞有什么特点?这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义?鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。用去离子水配制用去离子水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和，下同）的丙烯酰胺和1%1%的的N,N-N,N-甲甲双双丙烯酰胺的贮存液。丙烯酰胺的贮存液。用去离子水用去离子水配成配成10%10%的贮存液，于室温保存。的贮存液，于
43、室温保存。作用通过催化过硫酸铵形成自由基作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。的自由基。此溶液须配制新鲜液。25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。50 mmol/L Tris50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)HCl(pH 6.8)，100 100 mmol/L
44、 DTT(mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲醇，的甲醇，10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋的冰醋酸。酸。在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，在体积比加入样品处理液，在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。按顺序加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为101025
45、L25 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色即进行凝胶色谱分离之前谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品的样品和凝胶色谱分离之后的样品将电泳将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm8 V/cm。当染料前沿进入分离。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到胶后，把电压提高到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约部上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。去一角，以标注凝胶的方位。将电泳凝胶片放在考马将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色斯亮蓝染色液中染色1-2 h1-2 h。染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色换脱色液脱色3-10 h3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。，其间需多次更换脱色液至背景清楚。SDSSDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与备过程中蛋白质与SDSSDS的结合程度。的结合程度。
