1、第三章第三章 酶的生物合成与发酵生产酶的生物合成与发酵生产1.1.酶发酵生产用微生物菌种酶发酵生产用微生物菌种2.2.酶发酵工艺及控制酶发酵工艺及控制3.3.提高酶产量的方法提高酶产量的方法4.4.酶发酵动力学酶发酵动力学5.5.动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶v生物体内酶合成的过程称为生物体内酶合成的过程称为酶的生物合成酶的生物合成。v利用微生物代谢活动生产所需酶的过程，利用微生物代谢活动生产所需酶的过程，称为称为酶的发酵生产酶的发酵生产。微生物酶的开发应用：微生物酶的开发应用：(1)(1)微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生产
2、酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大，产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大，能够满足迅速扩张的市场需求。能够满足迅速扩张的市场需求。(2)(2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。式，能分解利用不同的底物。(3)(3)这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。(4)(4)特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几特别是当基因工程介
3、入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。乎都能够利用微生物细胞获得。因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。第一节第一节 酶发酵生产用微生物菌种酶发酵生产用微生物菌种v微生物菌种是发酵生产酶的首要条件。微生物菌种是发酵生产酶的首要条件。v目前投入工业发酵生产酶的菌种包括目前投入工业发酵生产酶的菌种包括细菌、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌放线菌、酵母菌、霉菌等。等。一、酶发酵生产用菌种的要求一、酶发酵生产用菌种的要求v产酶量高，具有生产应用价值；产酶量高，具有
4、生产应用价值；v易培养，即能适应大生产粗放的营养和培养条件，易培养，即能适应大生产粗放的营养和培养条件，包括廉价原料，对工艺条件要求不苛刻；包括廉价原料，对工艺条件要求不苛刻；v代谢速率高，发酵周期短；代谢速率高，发酵周期短；v产酶稳定性好，菌种的生产性能不易退化，不易产酶稳定性好，菌种的生产性能不易退化，不易感染噬菌体；感染噬菌体；v安全可靠，要求菌种不是致病菌，其代谢安全无安全可靠，要求菌种不是致病菌，其代谢安全无毒，在系统发育树上最好与病原体无关；毒，在系统发育树上最好与病原体无关；v选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离提取。选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离提取。二、二、微生物产酶菌株的
5、获得微生物产酶菌株的获得v从土壤以及发酵生产材料中分离；从土壤以及发酵生产材料中分离；v菌种保存中心。菌种保存中心。1、含菌样品的采集含菌样品的采集 采样的目的、采样地点、采样方法及采样的采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量数量。若预先不了解某种产酶微生物的具体来源，若预先不了解某种产酶微生物的具体来源，一般可从一般可从土壤土壤分离。分离。v产纤维素产纤维素v产脂肪酶产脂肪酶v产果胶酶产果胶酶v产糖化酶产糖化酶2 2、菌种的分离纯化、菌种的分离纯化v划线分离法划线分离法v稀释分离法稀释分离法3.菌种的初筛4.4.菌种的复筛菌种的复筛5.5.产酶最佳条件的确定产酶最佳条件的确定6.微生物产
6、酶性能的进一步提高微生物产酶性能的进一步提高 经诱变获得高产菌种经诱变获得高产菌种突变体突变体 利用利用代谢工程和代谢调节机理代谢工程和代谢调节机理来提高微生来提高微生物的酶产量。物的酶产量。运用运用遗传工程、基因工程遗传工程、基因工程的手段将原有菌的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环株中的目的基因转移到另外一些对生产环境适应性更强的微生物细胞内，使其高效境适应性更强的微生物细胞内，使其高效表达。表达。7.微生物产酶菌种的保藏微生物产酶菌种的保藏v斜面保藏斜面保藏v沙土管保藏沙土管保藏v冷冻保藏冷冻保藏第二节第二节 发酵工艺条件及控制发酵工艺条件及控制一、培养基的营养成分一、培养
7、基的营养成分v培养基培养基是指人工配制的用于细胞培养和发是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。酵的各种营养物质的混合物。v在设计和配制培养基时，应特别注意各种在设计和配制培养基时，应特别注意各种组分的种类和含量，以满足细胞生长、繁组分的种类和含量，以满足细胞生长、繁殖和新陈代谢的需要，并要调节至适宜的殖和新陈代谢的需要，并要调节至适宜的pHpH。还必须注意到，有些细胞生长、繁殖。还必须注意到，有些细胞生长、繁殖阶段和发酵阶段所要求的培养基有所不同，阶段和发酵阶段所要求的培养基有所不同，在此情况下，要根据需要配制不同的生长在此情况下，要根据需要配制不同的生长培养基和发酵培养基。
8、培养基和发酵培养基。1 1碳源碳源v碳源是指能够向细胞提供碳素化合物的营碳源是指能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。通常碳源同时也是提供能量的能养物质。通常碳源同时也是提供能量的能源。源。v碳是构成细胞成分的主要元素之一，也是碳是构成细胞成分的主要元素之一，也是各种酶的重要组成元素。所以，碳源是酶各种酶的重要组成元素。所以，碳源是酶发酵生产乃至其他产物的发酵生产的必不发酵生产乃至其他产物的发酵生产的必不可少的营养物质。可少的营养物质。v目前，在酶发酵生产中最常用的碳源是淀目前，在酶发酵生产中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如糊精、麦芽糖、葡萄糖粉及其水解物，如糊精、麦芽糖、葡萄糖等。等。v 不同
9、的细胞对各种碳源的利用情况大不相同，所以在配制不同的细胞对各种碳源的利用情况大不相同，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择适宜的碳源。培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择适宜的碳源。v 在酶的发酵生产中，除了要从营养的角度考虑碳源的选择在酶的发酵生产中，除了要从营养的角度考虑碳源的选择以外，还要考虑到碳源对酶生物合成的调节作用，主要要以外，还要考虑到碳源对酶生物合成的调节作用，主要要考虑酶生物合成的诱导作用以及是否存在分解代谢物作用。考虑酶生物合成的诱导作用以及是否存在分解代谢物作用。在选择碳源时应尽量选用对所需的酶有诱导作用的碳源，在选择碳源时应尽量选用对所需的酶有诱导作用的碳
10、源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。例如，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。例如，-淀粉酶的发酵生产中，应选用对该酶有诱导作用的淀淀粉酶的发酵生产中，应选用对该酶有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶的生物合成有分解代谢物阻遏粉作为碳源，而不用对该酶的生物合成有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。作用的果糖作为碳源。-半乳糖苷酶发酵应选用乳糖为半乳糖苷酶发酵应选用乳糖为碳源，而不用或少用葡萄糖为碳源等等。碳源，而不用或少用葡萄糖为碳源等等。v 在选择碳源时，必需考虑原料的供求和价格问题在选择碳源时，必需考虑原料的供求和价格问题。2 2氮源氮源v氮是组成细胞蛋白质和核酸的重要
11、元素之一，也氮是组成细胞蛋白质和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要组成元素。是酶分子的主要组成元素。v凡能够向细胞提供氮源素的营养物质称为氮源。凡能够向细胞提供氮源素的营养物质称为氮源。v氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。有机氮源氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物。如：酪蛋白、主要是各种蛋白质及其水解产物。如：酪蛋白、豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、多肽、氨基酸等。无机氮源是含氮的各种无机化多肽、氨基酸等。无机氮源是含氮的各种无机化合物，如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝合物，如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、
12、硝酸钾、硝酸钠等各种铵盐和硝酸盐等。酸钠等各种铵盐和硝酸盐等。不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般说来，应根据要求进行选择和配制。一般说来，动物细胞要求动物细胞要求有机氮有机氮，植物细胞主要要求，植物细胞主要要求无机氮无机氮，微生物细胞中，异养型微生物用，微生物细胞中，异养型微生物用有机氮有机氮，自养型微生物用，自养型微生物用无机氮无机氮。碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影响。所谓响。所谓碳氮比（碳氮比（C/NC/N）一般是指培养基一般是指培养基中碳元素（中碳元素（C C）的总量与氮元素（）
13、的总量与氮元素（N N）总量）总量之比。可通过测定或计算培养基中碳和氮之比。可通过测定或计算培养基中碳和氮的含量而求出。的含量而求出。有的有的氮源及其浓度氮源及其浓度如氨基酸的变化对酶发如氨基酸的变化对酶发酵有代谢调节作用。酵有代谢调节作用。3 3无机盐无机盐v无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，并对培养基的的无机元素，并对培养基的PHPH、氧化还原电位和、氧化还原电位和渗透压起调节作用。渗透压起调节作用。v根据细胞对无机元素需要量的大小，可分为主要根据细胞对无机元素需要量的大小，可分为主要元素（大量元素）和微量元素两大类。主要元素元
14、素（大量元素）和微量元素两大类。主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。微量元素有：有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。微量元素是细胞生铜、锰、锌、钼、钴、碘等。微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但需要量很少，过量反而会命活动不可缺少的，但需要量很少，过量反而会引起不良效果，必须严加控制。引起不良效果，必须严加控制。v各种无机元素的功用各不相同，有些是细胞的主各种无机元素的功用各不相同，有些是细胞的主要组分，如：磷、硫等；有些是酶的组分，如：要组分，如：磷、硫等；有些是酶的组分，如：磷、硫、锌、钙等；有些是酶的激活剂或抑制剂，磷、硫、锌、钙等；有些是酶的激活剂或抑
15、制剂，如：钾、镁、铁、锌、铜、锰、钙、钼、钴、氯、如：钾、镁、铁、锌、铜、锰、钙、钼、钴、氯、溴、碘等；有些则是对溴、碘等；有些则是对pHpH、渗透压、氧化还原电、渗透压、氧化还原电位起调节作用的，如：钠、钾、钙、氯、磷等。位起调节作用的，如：钠、钾、钙、氯、磷等。v其中磷是特别重要的元素，它是构成核酸和磷脂其中磷是特别重要的元素，它是构成核酸和磷脂的成分。微量元素有的是某些酶的组成成分，有的成分。微量元素有的是某些酶的组成成分，有的是酶的激活剂，也有的是辅酶的必需成分。的是酶的激活剂，也有的是辅酶的必需成分。4 4生长因子生长因子v生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的生长因素是指细胞生长繁殖
16、所必不可缺的微量有机化合物主要包括各种氨基酸、嘌微量有机化合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动植物生长激素呤、嘧啶、维生素，以及动植物生长激素等。等。v在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆玉米浆、酵母膏等天然原料。其中玉米浆、酵母膏等天然原料。其中玉米浆最常用。最常用。5 5、产酶促进剂、产酶促进剂 在培养基中添加某种少量物质，能显著提在培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂产酶促进剂。v诱导物诱导物v表面活性剂表面活性剂 表面活性剂表面活性剂能够增加细胞透性，其处在气能够增加细胞透性
17、，其处在气-液界面改善了氧的传递速度，还可以保护液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶的活性，另外还可消泡提高氧传递系数。酶的活性，另外还可消泡提高氧传递系数。二、二、发酵条件的控制及对产酶的影响发酵条件的控制及对产酶的影响1 1、温度、温度枯草杆菌的最适生枯草杆菌的最适生长温度为长温度为34343737黑曲霉的最适生长黑曲霉的最适生长温度为温度为282832 32 通常在生物学范围内每升高通常在生物学范围内每升高1010，生长速度就加快一倍，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。响其生长和合成
18、酶。有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的可以提高酶所对应的mRNAmRNA的稳定性，增加的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。有些酶的发酵生产，要在不同阶段控量。有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同的温度条件。在生长繁殖阶段控制制不同的温度条件。在生长繁殖阶段控制在细胞生长最适温度范围内，以利于细胞在细胞生长最适温度范围内，以利于细胞生长繁殖，而
19、在产酶阶段，则需控制在产生长繁殖，而在产酶阶段，则需控制在产酶的最适温度。酶的最适温度。在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温度降低，两者综合，决定了培养基的温度。由温度降低，两者综合，决定了培养基的温度。由于在发酵的不同阶段，细胞新陈代谢放出的热量于在发酵的不同阶段，细胞新陈代谢放出的热量差别很大，扩散和散失的热量受到环境温度等因差别很大，扩散和散失的热量受到环境温度等因素的影响
20、，使培养基的温度变化明显。为此必须素的影响，使培养基的温度变化明显。为此必须经常及时地进行调节控制，使培养基的温度经常经常及时地进行调节控制，使培养基的温度经常维持在适宜的范围内。温度控制的方法一般采用维持在适宜的范围内。温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温，故此在发酵罐中，均设计热水升温，冷水降温，故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。夹套、喷淋管等。2 2、pHpH值值 pHpH影响微生物体内各种酶的活性，从而导影响微生物体内各种酶的活性，从而导致微生物的代谢途径发生改变。致微生物的代谢途径发生改变。影
21、响微生物形态和细胞膜的透性，从而影影响微生物形态和细胞膜的透性，从而影响微生物对培养基中营养成分的吸收和代响微生物对培养基中营养成分的吸收和代谢产物的分泌。谢产物的分泌。影响培养基中某些营养物质的分解或中间影响培养基中某些营养物质的分解或中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。物质的利用。v 不同细胞生长繁殖的最适不同细胞生长繁殖的最适pHpH有所不同。一般细胞和放线菌有所不同。一般细胞和放线菌的生长最适的生长最适pHpH为中性或微碱性（为中性或微碱性（pH6.5pH6.58.08.0）；霉菌和酵）；霉菌和酵母的生长最适母的生长最适pHpH为偏酸
22、性（为偏酸性（PH4.0 PH4.0 6.0 6.0）；植物细胞生）；植物细胞生长的最适长的最适pHpH为为5 5 6 6。v 有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的PHPH，往，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例如：黑曲霉可生产往可以改变各种酶之间的产量比例。例如：黑曲霉可生产淀粉酶，又可生产糖化酶。当培养基的淀粉酶，又可生产糖化酶。当培养基的PHPH偏向中性时，偏向中性时，可使可使淀粉酶产量增加而糖化酶减少，反之，当培养基淀粉酶产量增加而糖化酶减少，反之，当培养基的的PHPH偏向酸性时，则糖化酶产量提高而偏向酸性时，则糖化酶产量提高而淀粉
23、酶的量降淀粉酶的量降低。再如用米曲霉生产蛋白酶，当培养基的低。再如用米曲霉生产蛋白酶，当培养基的PHPH为碱性时，为碱性时，主要生产碱性蛋白酶，降低培养基的主要生产碱性蛋白酶，降低培养基的PHPH，则主要生产中性，则主要生产中性或酸性蛋白酶。或酸性蛋白酶。v 培养基的培养基的pHpH在细胞生长繁殖和代谢物产生的过程中往往在细胞生长繁殖和代谢物产生的过程中往往会发生变化。这种变化与细胞特性有关，也与培养基的组会发生变化。这种变化与细胞特性有关，也与培养基的组分密切相关。含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，分密切相关。含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使培养基的会使培养基的pHpH向酸
24、性方向移动；含蛋白质、氨基酸向酸性方向移动；含蛋白质、氨基酸v 较多的培养基，经代谢产生较多的胺类物质，使较多的培养基，经代谢产生较多的胺类物质，使pHpH向碱向碱性方向移动；以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被细胞利用，性方向移动；以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被细胞利用，使培养基使培养基pHpH下降；以尿素为氮源时，先随着尿素被脲酶水下降；以尿素为氮源时，先随着尿素被脲酶水解生成氨，使培养基解生成氨，使培养基pHpH上升，然后又随着氨被细胞同化而上升，然后又随着氨被细胞同化而使使PHPH下降；磷酸盐的存在，对培养基的下降；磷酸盐的存在，对培养基的pHpH起一定的缓冲作起一定的缓冲作用。用。v 所以
25、在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的所以在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的pHpH进行适进行适当的控制和调节。当的控制和调节。PHPH的调节可以通过改变培养基的组分或的调节可以通过改变培养基的组分或其比例来实现。必要时可使用缓冲溶液，或流加适宜的酸、其比例来实现。必要时可使用缓冲溶液，或流加适宜的酸、碱溶液，以调节控制培养基中碱溶液，以调节控制培养基中pHpH变化。变化。生产上对生产上对pH pH 的控制和调节的方法：的控制和调节的方法：调节培养基初始调节培养基初始pHpH值，控制合适的值，控制合适的C/NC/N，调整生理酸性物质与生理碱性物质之间的调整生理酸性物质与生理碱性物质之间的比
26、例比例。补料调节，即通过发酵过程中流加碳源、补料调节，即通过发酵过程中流加碳源、氮源来调节氮源来调节pHpH值值 添加缓冲液，维持一定的添加缓冲液，维持一定的pHpH值值 如如pHpH值变化较大，可直接加酸或碱进行调值变化较大，可直接加酸或碱进行调节。节。通过对溶解氧的调节，来控制中间代谢产通过对溶解氧的调节，来控制中间代谢产物的氧化程度。物的氧化程度。3 3、溶解氧的控制、溶解氧的控制培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液
27、的性质等有密切关系。间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。速率有明显影响。调节通气量调节通气量调节氧的分压调节氧的分压 调节气液接触时间调节气液接触时间 调节气液接触面积调节气液接触面积 改变培养液的性质改变培养液的性质 控制溶解氧方法控制溶解氧方法三、固定化微生物细胞发酵产酶的工艺条件及其控制三、
28、固定化微生物细胞发酵产酶的工艺条件及其控制 固定化细胞又称固定化活细胞或固定化增殖细胞，固定化细胞又称固定化活细胞或固定化增殖细胞，是指用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁是指用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。殖和新陈代谢的细胞。1 1、固定化细胞的预培养、固定化细胞的预培养 固定化细胞制备好以后，一般要进行预培养，以固定化细胞制备好以后，一般要进行预培养，以使固定在载体上的细胞生长繁殖。待长好后，才使固定在载体上的细胞生长繁殖。待长好后，才用于发酵产酶。为了使固定化细胞生长良好，预用于发酵产酶。为了使固定化细胞生长良好，预培养应采用利于生长的生长培养基和工艺条件。培
29、养应采用利于生长的生长培养基和工艺条件。然后改换成有利于产酶的发酵培养基和最佳发酵然后改换成有利于产酶的发酵培养基和最佳发酵工艺条件。有时也可采用相同的培养基和工艺条工艺条件。有时也可采用相同的培养基和工艺条件进行预培养和发酵。件进行预培养和发酵。2 2、溶解氧的供给、溶解氧的供给 固定化细胞在进行培养和发酵过程中，由于固定化细胞在进行培养和发酵过程中，由于受到载体的影响，氧的溶解和传递受到一定的阻受到载体的影响，氧的溶解和传递受到一定的阻碍作用。特别是采用包埋法制备的固定化细胞，碍作用。特别是采用包埋法制备的固定化细胞，氧要通过凝胶层扩散到凝胶粒内部，才能供细胞氧要通过凝胶层扩散到凝胶粒内部
30、，才能供细胞应用，使氧的供给成为主要的限制性因素。为此，应用，使氧的供给成为主要的限制性因素。为此，必须增加溶解氧的量，才能满足细胞生长和产酶必须增加溶解氧的量，才能满足细胞生长和产酶的需要。由于固定化细胞反映器均不能采用强烈的需要。由于固定化细胞反映器均不能采用强烈的搅拌，以免破坏固定化细胞，所以，增加溶解的搅拌，以免破坏固定化细胞，所以，增加溶解氧的主要方法是加大通气量。例如，游离的枯草氧的主要方法是加大通气量。例如，游离的枯草杆菌细胞发酵生产杆菌细胞发酵生产-淀粉酶，通气量一般控制在淀粉酶，通气量一般控制在0.51 m0.51 m3 3/(m/(m3 3.min),.min),而采用固定
31、化细胞发酵，其而采用固定化细胞发酵，其通气量要通气量要12 m12 m3 3/(m/(m3 3.min),.min),或者更多。或者更多。v 此外，可通过改变固定化载体，固定化技此外，可通过改变固定化载体，固定化技术或改变培养基组分等方法，以改善供氧。术或改变培养基组分等方法，以改善供氧。例如，琼脂对氧的扩散不利，应尽量少用例如，琼脂对氧的扩散不利，应尽量少用作固定化载体；在凝胶中加进某些物质，作固定化载体；在凝胶中加进某些物质，使其有利于氧的传递；采用过氧化氢酶与使其有利于氧的传递；采用过氧化氢酶与细胞共固定化，再在培养液中添加适量的细胞共固定化，再在培养液中添加适量的过氧化氢，通过酶的作用
32、，产生氧气，共过氧化氢，通过酶的作用，产生氧气，共细胞使用；降低培养基的浓度，尽量降低细胞使用；降低培养基的浓度，尽量降低培养基的粘度等。培养基的粘度等。v 溶解氧的供给，是固定化细胞好气性发酵溶解氧的供给，是固定化细胞好气性发酵的关键限制性因素之一。有待进一步研究的关键限制性因素之一。有待进一步研究解决。解决。3.3.温度的控制温度的控制 固定化细胞对温度的适应范围较广，在分固定化细胞对温度的适应范围较广，在分批发酵和半连续发酵中，温度不难控制。批发酵和半连续发酵中，温度不难控制。但在连续发酵过程中，由于稀释率较高，但在连续发酵过程中，由于稀释率较高，反应器内温度变化较大。若只是在反应器反应
33、器内温度变化较大。若只是在反应器内调节温度，则在流加的培养液温度差别内调节温度，则在流加的培养液温度差别较大时，难以达到要求。一般在培养液进较大时，难以达到要求。一般在培养液进入反应器之前，必须预先调节到适宜温度。入反应器之前，必须预先调节到适宜温度。4 4培养基成分的控制培养基成分的控制 培养基的浓度不宜过高，并可以通过改变培养基的浓度不宜过高，并可以通过改变培养基组分来降低培养基的黏度，有利于培养基组分来降低培养基的黏度，有利于氧的溶解和扩散，从而克服固定化细胞好氧的溶解和扩散，从而克服固定化细胞好氧发酵过程中氧溶解和传递的限制。氧发酵过程中氧溶解和传递的限制。培养基的组分不能影响固定化细
34、胞的稳定培养基的组分不能影响固定化细胞的稳定性，或影响很小。性，或影响很小。四、固定化微生物原生质体发酵产酶的工四、固定化微生物原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制艺条件及其控制1 1、培养基渗透压的控制、培养基渗透压的控制2 2、控制培养基组分、防止细胞壁再生、控制培养基组分、防止细胞壁再生3 3、维持较高的原生质体浓度、维持较高的原生质体浓度第三节第三节 提高酶产量的方法提高酶产量的方法一、酶生物合成的调控机制一、酶生物合成的调控机制Reverse transcription 操纵子（操纵子（operonoperon）：是一组功能上相关，）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个
35、遗传受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。单位。根据基因调节控制理论，在根据基因调节控制理论，在DNADNA分子中，与分子中，与酶生物合成有密切关系的基因有酶生物合成有密切关系的基因有4 4种。它们种。它们是调节基因是调节基因(Regulator gene)(Regulator gene)、启动基因、启动基因(Promoter gene)(Promoter gene)、操纵基因、操纵基因(Operator(Operator gene)gene)和结构基因和结构基因(Strutural gene)(Strutural gene)。结构基因是编码蛋白的基因，它与多肽链有对结构基因是编码蛋白的基
36、因，它与多肽链有对应关系。应关系。操纵基因在操纵子中起操纵基因在操纵子中起“开关开关”作用，它可以作用，它可以与调节基因产生的别构蛋白（阻遏蛋白）中的与调节基因产生的别构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。合成速度。启动基因有两个位点组成，一个是启动基因有两个位点组成，一个是RNARNA聚合酶的聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMPcAMP）与环腺）与环腺苷酸接受蛋白（苷酸接受蛋白（CRPCRP）的复合物（）的复合物（cAMP-CRPcAMP-CRP）的结合位点。只有在的结合位点。只有在
37、cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启复合物结合到启动基因的位点上时，动基因的位点上时，RNARNA聚合酶才能结合到其在聚合酶才能结合到其在启动基因的位点上，这样，酶的合成才有可能启动基因的位点上，这样，酶的合成才有可能开始，否则酶就无法开始合成。开始，否则酶就无法开始合成。调节基因编码调节蛋白。调节基因编码调节蛋白。操纵子的类型操纵子的类型 诱导型操纵子（诱导型操纵子（inducible operon)inducible operon)：在无诱导：在无诱导物的情况下，其基因不表达或表达的水平很低，物的情况下，其基因不表达或表达的水平很低，只有当诱导物存在时，才能进行转录生成只有当诱导
38、物存在时，才能进行转录生成mRNAmRNA，进而经翻译合成酶。进而经翻译合成酶。乳糖操纵子乳糖操纵子 阻遏型操纵子（阻遏型操纵子（repressible operonrepressible operon）：在无）：在无阻遏物情况下，基因正常表达，当有阻遏物存阻遏物情况下，基因正常表达，当有阻遏物存在时，转录则受阻遏，酶不能合成。在时，转录则受阻遏，酶不能合成。色氨酸操色氨酸操纵子纵子 此外，启动基因位点上的此外，启动基因位点上的cAMP-CAPcAMP-CAP复合物的结复合物的结合与否，也对酶的生物合成起调节作用。合与否，也对酶的生物合成起调节作用。基因对酶生物合成的调节控制有基因对酶生物合成
39、的调节控制有3 3种模式种模式 分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用 酶合成的诱导作用酶合成的诱导作用 酶合成的反馈阻遏作用。酶合成的反馈阻遏作用。1 1、酶生物合成的诱导作用、酶生物合成的诱导作用v加进某种物质加进某种物质,使酶的生物合成开始或加速使酶的生物合成开始或加速进行的过程进行的过程,称为称为酶生物合成的诱导作用酶生物合成的诱导作用。简称为简称为诱导作用诱导作用。v起诱导作用的物质，称为起诱导作用的物质，称为诱导剂诱导剂。酶生物合成的诱导作用酶生物合成的诱导作用（A A）-无诱导物时无诱导物时 （B B）-添加诱导物时添加诱导物时2 2、酶生物合成的反馈阻遏作用、酶生物合成的反馈阻遏
40、作用 1.1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；存在；2.2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。消失。3.3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。需要就不合成。某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行
41、的，过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做这种现象叫做酶合成的阻遏酶合成的阻遏。能阻遏酶合。能阻遏酶合成的物质叫成的物质叫辅阻遏物辅阻遏物。被辅阻遏物作用而。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫停止合成的酶叫阻遏酶阻遏酶。调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构与操纵基因结合，结构基因不能表达基因不能表达色
42、氨酸操纵子（酶的阻遏）色氨酸操纵子（酶的阻遏）-阻遏物和操纵基因的调节阻遏物和操纵基因的调节3 3、分解代谢阻遏、分解代谢阻遏 某些物质（主要是葡萄糖和其他容易利用某些物质（主要是葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代谢的产物阻遏某些酶的碳源等）分解代谢的产物阻遏某些酶（特别是参与分解代谢的酶）生物合成的（特别是参与分解代谢的酶）生物合成的现象称为现象称为分解代谢阻遏作用分解代谢阻遏作用，也称为，也称为葡萄葡萄糖效应糖效应。分解代谢阻遏作用之所以产生，一是由于分解代谢阻遏作用之所以产生，一是由于葡萄糖的分解代谢引起葡萄糖的分解代谢引起ATPATP浓度的上升，消浓度的上升，消耗胞内的环腺苷酸（耗胞
43、内的环腺苷酸（cAMPcAMP）;二是当葡萄糖二是当葡萄糖等作为唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺等作为唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶活性有抑制作用，降低苷酸环化酶活性有抑制作用，降低cAMPcAMP的的生成。生成。细菌乳糖操纵子的作用机制细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏降解物阻遏)调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacZ lacYlacACAPcAMPCAP-cAMPCAP-cAMP复合物复合物mRNAmRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则则cAMPcAMP的浓度降低，的浓度
44、降低，CAP-CAP-cAMPcAMP复合物减少，不能与启动子结合，故复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。转录不得进行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶过去称葡萄糖效应过去称葡萄糖效应本节目录+转录转录无葡萄糖，无葡萄糖，cAMP浓度高时浓度高时促进转录促进转录有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP浓度低时浓度低时不促进转录不促进转录ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正调控的正调控 乳糖操纵子的启动基因内，除乳糖操纵子的启动基因内，除RNARNA聚合酶结合位聚合酶结合位点外，还有一个称为点外，还有一个称为cAMP-CAPcAMP-CAP复合
45、物的结合位复合物的结合位点。点。cAMPcAMP是环腺苷酸是环腺苷酸 ，CAPCAP是降解物基因活化蛋白是降解物基因活化蛋白（又称（又称cAMPcAMP受体蛋白，受体蛋白，CRPCRP）当）当CAPCAP与与cAMPcAMP结合结合后，就会被活化。后，就会被活化。cAMP-CAPcAMP-CAP复合物又会激活启动基因，使复合物又会激活启动基因，使RNARNA聚合聚合酶与启动基因结合。酶与启动基因结合。乳糖和葡萄糖同时存在时，因为分解葡萄糖的乳糖和葡萄糖同时存在时，因为分解葡萄糖的酶类属于组成酶，能迅速地将葡萄糖降解成某酶类属于组成酶，能迅速地将葡萄糖降解成某种中间产物，既会阻止种中间产物，既会
46、阻止ATPATP环化形成环化形成cAMPcAMP，同时，同时，又会促进又会促进cAMPcAMP分解分解AMPAMP，从而降低，从而降低cAMPcAMP的浓度，的浓度，继而阻遏了乳糖降解有关的诱导酶合成。继而阻遏了乳糖降解有关的诱导酶合成。二、打破酶合成调节机制限制及提高酶产量的方法二、打破酶合成调节机制限制及提高酶产量的方法1 1、通过条件控制提高酶产量、通过条件控制提高酶产量（1 1）添加诱导物）添加诱导物诱导物包括：诱导物包括：酶的作用底物酶的作用底物 一些难以代谢的底物类似物一些难以代谢的底物类似物 酶催化的产物酶催化的产物 诱导物的前体物质诱导物的前体物质同一种酶有同一种酶有多种多种诱
47、导物诱导物诱导和阻遏之间没有绝对的界限，其关键在于诱导和阻遏之间没有绝对的界限，其关键在于浓度浓度（2 2）降低阻遏物的浓度）降低阻遏物的浓度v产物阻遏作用：由酶催化作用的产物或代产物阻遏作用：由酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。谢途径的末端产物引起的阻遏作用。v分解代谢阻遏作用：有葡萄糖和其他容易分解代谢阻遏作用：有葡萄糖和其他容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质引起的阻遏作用。物质引起的阻遏作用。为了减少或者解除分解代谢阻遏作用，应为了减少或者解除分解代谢阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源当控制培养基中葡萄糖等容易
48、利用的碳源浓度。浓度。常采取的措施如下常采取的措施如下：尽量不用葡萄糖等容易被利用的碳源，而尽量不用葡萄糖等容易被利用的碳源，而采用其他较难利用的碳源。采用其他较难利用的碳源。采取补料流加以及分次流加碳源的方法，采取补料流加以及分次流加碳源的方法，将碳源的浓度控制在较低的水平。将碳源的浓度控制在较低的水平。添加一定的添加一定的cAMPcAMP 对于受产物阻遏作用的酶（酶合成的反馈阻遏作对于受产物阻遏作用的酶（酶合成的反馈阻遏作用），可以通过以下措施降低尾产物积累，解用），可以通过以下措施降低尾产物积累，解除阻遏，从而提高酶合成的产量。除阻遏，从而提高酶合成的产量。在培养基中添加尾产物类似物，避
49、免尾产物大在培养基中添加尾产物类似物，避免尾产物大量生成。量生成。采用尾产物的营养缺陷型菌株发酵生产酶。通采用尾产物的营养缺陷型菌株发酵生产酶。通过外加该营养物质，人为控制其营养物质处于过外加该营养物质，人为控制其营养物质处于亚适量状态，避免它对酶合成造成阻遏。亚适量状态，避免它对酶合成造成阻遏。直接去尾产物法。直接去尾产物法。在培养基中添加阻止尾产物形成的抑制剂，以在培养基中添加阻止尾产物形成的抑制剂，以减少阻遏物的积累。减少阻遏物的积累。2 2、通过基因突变和基因重组提高酶产量、通过基因突变和基因重组提高酶产量通过基因工程提高酶产量的途径：通过基因工程提高酶产量的途径：v使诱导型菌株变成使
50、诱导型菌株变成组成型菌株组成型菌株v使阻遏型菌株变为使阻遏型菌株变为去阻遏型菌株去阻遏型菌株（抗阻遏（抗阻遏型菌株）。型菌株）。v通过基因工程的手段增加细胞内的通过基因工程的手段增加细胞内的基因拷基因拷贝数贝数。诱变的方法：诱变的方法：v物理物理v化学化学v物理和化学的结合物理和化学的结合菌株筛检菌株筛检（1 1）组成型突变株筛选）组成型突变株筛选 将诱变后的产酶菌将诱变后的产酶菌株在低诱导力的诱导物为主要碳源或氮源株在低诱导力的诱导物为主要碳源或氮源的培养基上培养，并同时限制诱导物浓度的培养基上培养，并同时限制诱导物浓度在一定水平，或同时加入诱导抑制剂，在在一定水平，或同时加入诱导抑制剂，在
