1、第五章第五章海洋微藻的细胞操作海洋微藻的细胞操作1.概论v海洋微藻是海洋初级生产力的主要贡献者，其中许多种类具有重要的经济价值。例如：螺旋藻中的藻蓝蛋白，是蓝色色素的重要资源。盐藻可以积累甘油和类胡萝卜素，特别是-胡萝卜素和变泡藻黄素，这些物质具有很高的保健和药用价值。紫球藻是重要的海藻多糖和不饱和脂肪酸来源藻，其多糖的药用价值不容忽视。v一些微藻如褐紫藻、等鞭金藻、扁藻、菱形藻和小环藻等是海珍品如虾、海参、鲍鱼、和扇贝幼体等生长发育的饵料。这些微藻的培养和改良对海珍品的养殖具有重要意义。v一些微藻是生理生化、代谢、发育和遗传学研究的极好材料，植物的一些生理现象、代谢途径和发育过程都是以微藻为
2、实验材料探明的。海洋微藻细胞操作的意义v微藻因为其结构简单和易于培养等特点，成为原生质体制备、再生和增殖、细胞融合以及细胞工程等细胞操作和基因工程研究的极好材料。v绝大多数海洋微藻有细胞壁，其细胞操作收到了限制。因此，海洋微藻细胞操作的第一步是去除细胞壁，获得原生质体。v通过原生质体进行细胞操作和遗传饰变的要点概况成为：（1）原生质体的分离（2）原生质体的培养及再生（3）细胞融合（4）把外源遗传物质、细胞器或微生物导入原生质体海洋微藻细胞操作研究的历史与现状v50年代末期，Fuhs利用丝状体蓝藻制备得到原生质体。70年代其他种类的原生质体的制备也获得成功。这些微藻原生质体分离成功为海藻原生质体
3、分离和培养研究提供了宝贵的基础资料，为80年代大型海藻原生质体分离和培养工作的活跃开展奠定了宝贵的基础。v从80年代开始，微藻原生质体分离、培养以及细胞融合的研究逐渐向大型海藻转移，这种研究重点的转移似乎可以说明，大型海藻的遗传饰变更加困难和复杂，在理论和实践上有更多的问题需要解决。微藻细胞操作的有关问题v微藻细胞操作的材料应具备下列特征 1.生长状态良好、健康 2.形态简单均一 3.细胞结构和组成简单易于原生质体化 4.原生质体能稳定的再生和增殖 5.可在琼脂培养基上进行增殖选择 6.具有可供选择的标记（如抗生素的耐性）v细胞操作的全过程应保持在细胞的正常生理状态，这在再生和增殖阶段更为重要
4、。需要注意的要点是：1.处理前细胞状态的控制 2.处理过程细胞状态 的控制，特别是外界条件如：温度、光照、盐度、PH、和处理时间等的控制 3.渗透压调节剂的种类和浓度 4.原生质体膜的稳定性 5、原生质体的纯化方法及纯度 6、不同研究目的的不同原生质体化程度。5.2海洋微藻的分离和纯化技术 在以海洋为材料的的各种研究中，常常要求培养物是单种和无菌的。为实现这一目的，合适的分离和纯化技术是必需的。5.2.1 藻的采集v藻体的最初来源一般是采自自然环境。浮游藻可用浮游生物网采集和浓缩。附着的和丝状体种类可以从礁石、叶状体或其他大型藻类上刮取。当藻种采集后，必需在最短的时间内进行观察、鉴定和分离，应
5、为有一些重要的微藻种类在几小时后可能开始解体。5.2.2 分离方法1.毛细滴管复洗技术 选直径较细（约5毫米）玻管，在火焰上加热，待快熔时，快速拉成口径极细的微吸管。将稀释适度藻液水样，置浅凹载玻片上，镜检。用微吸管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出，放入另一浅凹载片上，镜检这一滴水中是否达到纯分离的目的。如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中培养，一般在每个培养皿中接2030个个体。从分离出少量细胞扩大培养到200毫升的培养量，如硅藻一般需20天以上。为了较长时期保存藻种，可将分离到的藻种用青霉素（10005000单位或链霉素（20ppm）处理后，获得较纯藻种。2
6、.喷雾技术 相当简捷的技术，可用来分离和纯化采集的藻样。用离心洗涤法洗89ml藻样，最后离心一次后，在离心管中留2ml上清液，其余倒掉。将毛细管通过棉塞插到离心管的底部，将离心管固定于滴定台上。将压缩空气通过一滴管吹出并从离心管中的毛细管的顶端通过。离心管中的悬浮液会被吸出并形成细雾。将一灭菌的琼脂培养基平板迅速通过细雾，距离大约为25cm左右。盖好培养皿，至于合适的光照和温度下培养。经几天生长后，可用毛细滴管将没有细菌和真菌污染的单细胞或藻落挑出移入新鲜培养液中。v3.琼脂板技术 将采集的少量藻与已冷却的但未凝固的含有营养物的琼脂培养液混合，搅匀后倒入培养皿，冷却凝固。在适宜条件下经几天培养
7、后，将形成的藻落切下，再移入新鲜培养液中培养。5.2.3 纯化方法1.离心洗涤技术 细菌和海藻一般可以较容易地通过离心和在无菌培养液中洗涤分开来。2.抗生素技术 用混合的抗生素可以成功地纯化海藻培养物，这一方法特别适用于那些较大的不适于离心洗涤的藻类。3.紫外光处理技术 紫外光可用来处理纯化海洋微藻，因为大多数藻类对紫外线处理的致死效应比细菌的抗性强。v4.过滤技术 膜滤可用来分离丝状体海藻和细菌。v5.纯化程度的检测 经纯化的培养物，应进行检测以确定培养物是否真正逮到了无菌，用一般性培养基做检测在不同温度和光暗条件下进行。5.3 培养基成分及作用培养基成分及作用v海水是海藻生长的理想介质，自
8、然海水可以满足孢子萌发和不同藻种的分离等研究的需要，但在多数的培养中，用几种植物培养物如N、P、和Fe等加富海水是必要的。v合成培养基的主要目的是提供简化的和确定的培养基。v在配制培养基的过程中，一个主要的问题是海水培养基高压灭菌时会产生沉淀。v目前，解决这一问题的途径主要有两个：1.加入某种适宜且无毒的PH缓冲剂和螯合物，同时降低培养基的盐度，特别是钙的浓度。2.用滤膜过滤的方法灭菌。v用于藻类培养的培养基配方有很多种，每种配方主要适用于一定藻种，这里介绍几种比较常用的。v水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可
9、用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。常用培养基配方见下表。v以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5琼脂。培养基的配制及其原则一、培养基母液的配制一、培养基母液的配制v(一)母液配制的目的 1.方便配制其它的培养基：2.保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取。(二)母液配制方法 1.单配法 将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克
10、溶质。2.混配法 将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液，浓度可用a mg/L表示，即配制一升培养基吸取该母液a ml。v（三）母液配制的药品与器材 1、药品：配制藻类培养基所需的药品、蒸馏水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL 等。2、器材：各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、母液瓶、标签、冰箱等。（四）母液配制（以MS培养基为例）无机大量无机大量 母液母液铁盐母液铁盐母液配制MS培养基时母液的计算二、培养基的配制二、培养基的配制 海藻的培养基一般由三部分组成：大量元素、微量元素和 维生素。配置步骤：三、配制藻类培养基的
11、原则 1、要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。2、应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等 3、要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合 藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。4、要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）。5、要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。6、要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。vMS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培
12、养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。5.4 海洋微藻的生长测量和培养技术5.4.1 培养类型 海洋微藻的培养类型按时间长短分为：1.长期保存培养2.短期保存培养类型类型长期保存培养长期保存培养短期保存培养短期保存培养定义定义 指长时间保持一特定的海藻以备将来的使用的培养，能在长
13、达3个月甚至1年的时间里保持藻的活力 指藻体材料用于实验前的较短时间的培养实验实验用法用法 一般不宜直接用于实验 可以直接用于实验培养培养基基 营养琼脂培养基：如蛋白胨的Bold营养琼脂培养基,用于绿藻的长期保存培养获得正常获得正常微藻微藻较低浓度培养基加速生长加速生长 较高浓度培养基缺点缺点（1）营养物必须是无菌的（2）某些藻在琼脂培养基上不能生长 不能长期保存5.4.2 生长测定 1.1.分裂速率的计算分裂速率的计算 生长规律生长规律：慢块慢 生长指标生长指标：细胞数目 适宜条件下，当生长速度达恒定时（指数生长期），细胞增加的速度与原来细胞数目之间有：dNKeNdt1010ln(/)/()
14、KeNNtt1N0N1t0t1010ln2(/)/()KNNtt表示在和时测得的细胞数。若用以2为底的对数来计算生长常数，则和这时k的意义为每天分裂的次数K（分裂次数/d）=Ke/ln2生长常数也可以用细胞加倍时间DT表示：DT=1/K=ln2/Ke2.2.细胞计数方法细胞计数方法1）血球计数板计数法 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1m
15、m3.计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格.但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由1625=2516=400个小方格组成,见图.计数方法：计数方法：用酒精擦洗计数板 取一滴藻液滴在盖玻片一侧边缘，使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室 计数 1ml细胞数=1个大方格（0.1ul）细胞数10 10002)光密度法 原理：原理：分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成
16、样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。方法方法:用分光光度计测得各浓度藻类的光度值，以细胞数为纵坐标，光度值为横坐标绘制细胞数和光度值的对应曲线。利用这一曲线，在测得样品的光度值后，可以查得样品的细胞数。优点：优点：计数快速方便5.4.1 培养方法1.分批培养2.连续培养3.同步培养1.分批培养 分批培养是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量微藻种进行培养，使微藻生长繁殖，在特定条件下完成一个生长周期的培养方法。是最简单和普遍采用的方法。单胞藻的生长可分为：生长延缓期：细胞刚开始适应环境，所以生长并不旺盛，生长曲线基本呈平线状 指数生长期：细胞适应了环境，生长旺盛，生长速
17、度极快，细胞数量呈倍数增长，生长曲线陡然上升 静止期：因培养基营养物有限，而细胞此时数量已达很多，相互间竞争，所以死亡的细胞数和新生的细胞数持平，生长曲线再次呈平线。2.连续培养v指在一个限定的系统中，通过不断加入新鲜的营养液，在生长速度和稀释速度间建立一种平衡的关系，使培养液细胞浓度保持一定的培养方法。v分为：（1）半连续培养：定期定量加入营养液，定期定量取出培养物。（2）全连续培养：不断加入营养液的同时营养液又不断流出。3.同步培养v采取某种措施（变换光暗周期，温度和营养条件），使培养液中的藻类处于细胞周期中同一时期的培养方法。v优点：每一周期均可得到细胞数目、干物质和细胞组成一致的材料v
18、同步培养的方法有诱导法和选择法两种。v(一一)诱导法诱导法 控制环境条件。诱导法就是采用物理、化学因子使微藻细胞生长进行到某个阶段而停下来，使先到达该阶段的微藻细胞个体能进人下一生长阶段，待全部群体细胞都到达该生长阶段后，再除去该因子，使全部群体细胞同时进人下个生长阶段，以达到诱导微藻细胞同步生长的目的。（二）选择法（二）选择法：用密度梯度离心或微孔滤膜，分离刚分裂的小细胞（体积和重量大致相等），然后再培养即可。5.5 原生质体分离技术本节要点：本节要点：v原生质体与原生质球v检测细胞壁存在的方法v海藻原生质体的制备方法v原生质体分离方法一一.原生质体与原生质球原生质体与原生质球 根据藻类细胞
19、脱壁程度的不同，将脱壁后的藻细胞分为原生质体和和原生质球。v原生质体：是指质膜外的细胞壁和包被层全部除去而保持其余细胞组分的任何基因型的藻细胞。v原生质球是指细胞壁被全部或部分除去，仍保持质膜外包被层的含全部细胞内组分的部分v原生质体与原生质球的区别：原生质体与原生质球的区别：原生质球：细胞壁完全或部分去除，包被原生质球：细胞壁和包被层全部去除层完整保留。v原生质体的特征：原生质体的特征：（1）无细胞壁障碍，可对膜、细胞器进行基础研究，同时可进行遗传操作。（2）具有全能性，能在人工条件控制下，进行大量，快速繁殖。（3）可诱导融合，形成杂种细胞，为体细胞杂交提供实验材料。由于质膜外的包被层存在与
20、否尚无标准的检测方法，故原生质体与原生质球间的差别常被忽略。二二.检测细胞壁存在的方法检测细胞壁存在的方法v电子显微镜v细胞壁染色技术v处理后的细胞对渗透胁迫的敏感性三三.海藻原生质体的制备方法海藻原生质体的制备方法v海藻原生质体的制备方法有机械法、微生物酶解法和酶法。v机械法由于原生质体得率太低，费时费力目前已很少使用。v微生物酶解法：利用海洋细菌与藻体共培养过程中释放出来的特殊酶，把海藻细胞壁分解掉从而得到原生质体，这实际也是酶法。v酶法：是特定的酶水解藻细胞壁，具有很强的专一性，同时酶解的条件十分温和在细胞能够承受的范围之内，所以对细胞无伤害，而且酶法效率高从而能获得大量的有活力的原生质
21、体。目前普遍采用目前普遍采用酶解的方法酶解的方法（一）海洋微藻原生质体分离实例（一）海洋微藻原生质体分离实例v蓝藻（细胞壁含有粘肽），因而可以用溶菌酶消化的方法制备蓝藻的原生质体。v绿藻（细胞壁含有纤维素），因而可用纤维素酶处理获得原生质体或原生质球。v硅藻、甲藻（细胞壁结构特殊），可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶液处理。v红藻和褐藻可用多糖酶消化细胞壁成分制备原生质体。（二）原生质体制备的酶的来源（二）原生质体制备的酶的来源v微生物来源的海藻解壁酶。如从假单胞菌、产气单胞菌、弧菌、埃氏交替单胞菌、的发酵液或培养液中提取粗酶，这种粗酶可用于分离原生质体。微生物来源的海藻解壁酶有：琼胶
22、酶、褐藻酸酶、卡拉胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶!紫菜聚糖酶。v动物来源的海藻解壁酶。如从海兔中提取褐藻酸酶、从疣鲍中提取鲍酶、从紫海胆提取海胆酶、韩宝芹等，研究了14种无脊椎动物消化酶液对海藻的解壁作用，最v终从滩栖螺、石鳖和笠贝中制备出海螺酶、石鳖酶和笠贝酶，并研究了这3种酶对4种绿藻、7种红藻和3种褐藻细胞的解壁作用。v目前用于制备原生质体的酶类，如纤维素酶、纤维素酶、果胶酶、崩溃酶、离析酶等，已有商品出售。四四.原生质体分离方法原生质体分离方法5.6 原生质体的培养技术一、原理v植物原生质体是除去细胞壁的一个为质膜所包围的的裸露细胞，用酶降解法脱去细胞壁的具有活力的原生质体，其在合适的离体
23、培养条件下具有繁殖，分化，再生成为完整植株的能力。而动物本身没有细胞壁，自然不用去除细胞壁。二、实验仪器v灭菌培养皿，v血球计数板，v显微镜，v试管等。三、培养基v液体再生培养基v琼脂再生培养基四、实验过程v稀释离心沉淀弃上清液洗涤悬浮计数光照取原生质体培养繁殖再繁殖再光照藻落出现v具有活力的原生质体在合适的培养条件下，36天就可以看见原生质体的第一次分裂，2周左右可见到小细胞团。要不断加入新鲜细胞培养细胞培养基，加入的时间和容量按实验的情况而异，原则上要在原生质体一次或几次分裂后逐步再加入。细胞团继续长大成愈伤组织到植株分化的过程与其它组织培养的情况相同。5.7 细胞学技术一、破碎细胞的方法
24、v1.杆状玻璃匀浆器法v该匀浆器由一根端部表面磨砂的玻璃杆和一个内壁磨砂的玻璃套管组成。使用时，先用锋利的刀片把组织块切碎，然后把碎块加入套管中，用力使玻杆移动使组织细胞破碎。2.高速组织捣碎机法v使用时将4预冷的组织碎块或细胞悬液加入捣碎机的梅花玻璃杯中，至杯体积的1/3即可盖好玻璃杯盖，固定好带杆叶片刀，缓慢调整旋转速度，一般开机数十秒后，组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。但不宜时间过长，以防高速旋转产生热而导致分离物中的活性物降解，用冷却水降温更好。3.超声波处理法v超声波发生器能产生高强度的超声信号，经换能器传送至与之接触的溶液中，由声波形成冲击和振动而产生剪力，致使细胞破碎，动物组
25、织肝、肾、胸腺、淋巴结、腹水细胞、红细胞、体外培养的细胞均可在短时间内破碎，因超声时可产热，应注意冰浴冷却，生物大分子如核酸和酶对超声敏感，一般不宜采用。4.化学裂介法v在细胞悬液中加入Triton-100、NP-40、SDS，去氧胆酸钠均可使细胞裂解，往往仍需机械去辅助，方可在短时间内使细胞完全裂解，裂解后应清除化学裂解剂，以防止干扰分析。5.反复冻融法v组织细胞浓液在-70或液氢中冷冻后，于37融化，经34次冻融周期，可使细胞破碎。二、部分细胞器的分离方法v一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。差速离心v差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物
26、质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。密度梯度离心v用一定的介质在离心管内形成一连续或不连用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细细胞胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且）能产生
27、密度梯度，且密度高时，粘度不高；密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性或易调为中性；中性；3）浓度大时渗透压不大；）浓度大时渗透压不大；4）对细胞）对细胞无毒。无毒。1.细胞膜的分离v细胞膜又称质膜，分离细胞膜有助于研究生物膜的结构与功能。一般说，红细胞膜与线粒体膜的制备用差速离心法即可，其他细胞膜的分离可根据膜组分的密度大小不同，采用梯度离心后，分布于指定区域，可分离得到纯制品v线粒体普遍存在于真核细胞中，它是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需能量主要依靠在线粒体内进行氧化所产生的能，线粒体的分离主要靠差速分离。3.线粒体膜分离v线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心4.聚核糖体的分离v核糖
28、体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核酸蛋白颗粒，附着在粗面内质网的称固着核糖体，分散在细胞内的称游离核糖体，数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核糖体，一般用差速离心法可分离出聚核糖体。5.微粒体分离v微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡，含核糖核酸，蛋白质和脂类，分离微粒体的方法是利用分级离心法，去掉细胞核和线粒体后，经超速离心而制备。三、细胞核的分离和细胞脱核技术v细胞核作为一个功能单位，完整地保存遗传物质，并指导RNA合成，进而表达出相应的蛋白，在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，可用分级离心
29、等方法将细胞核进行分离纯化。1、细胞核的分离 用溶液用溶液A粗提离心取沉淀粗提离心取沉淀B液中除蛋白，然后于液中除蛋白，然后于C液中进行液中进行蔗糖密度梯度高速离心，沉淀用蔗糖密度梯度高速离心，沉淀用A液离心洗涤一次可收取。液离心洗涤一次可收取。v(1)溶液溶液A：0.25mol/L蔗糖蔗糖v10mmol/L Tris-HCL pH8.0v3mmol/L MgCL2v0.1mmol/L苯甲基磺酰氟化物苯甲基磺酰氟化物(PMSF为蛋白酶抑制剂，用为蛋白酶抑制剂，用乙醇现配乙醇现配)v(2)溶液溶液B：含：含0.1%(v/v)Triton-100的溶液的溶液A。v(3)溶液溶液C：2.2mol/L蔗糖蔗糖v10mmol/L Tris-HCL pH8.0v3mmol/L MgCL2v0.1mmol/L PMSF2、细胞脱核技术v细胞经松胞菌素B(Cytochalasin B；CB)以10mg/L浸没,以12000r/min离心1520分钟，可使99%的细胞发生脱核，形成无核细胞质体(Cytoplast)和无胞质的核质体(Nucleoplast)
