1、生物大分子全册配套最完整生物大分子全册配套最完整 精品课件精品课件1 生物大分子生物大分子 from the point view of material science 生物大分子的种类生物大分子的种类 蛋白质蛋白质：由氨基酸通过酰胺键（肽键）连接而成 核酸核酸：一种线型多聚核苷酸，核苷酸由碱基、戊糖 与磷酸组成 多糖多糖：由单糖分子缩合、失水形成糖苷键连接而成 脂类脂类：简单脂类（不含结合脂肪酸的脂类）；复合 脂类（与脂肪酸结合的脂类） 什么是生物材料？什么是生物材料？ 生物材料(Biomaterials)通常有两种定义： 1. 天然生物材料天然生物材料(Biological Materi
2、als)， 也就是由生物过 程形成的材料，如结构蛋白（胶原纤维、丝等）、生 物矿物（骨、牙、贝壳等）和纤维素。 2. 生物医用材料生物医用材料(Biomedical Materials)，用于取代、修 复活体组织的天然或人造材料。 可以预见，随着组织工程的发展，生物医用材料的 定义将逐渐增大生物过程形成材料的成分，这样，两种 定义将会有越来越多的重叠。 蛋白质的分类蛋白质的分类 简单蛋白质：简单蛋白质：仅由氨基酸组成的蛋白质（核糖核酸酶，胰岛 素等） 结合蛋白质：结合蛋白质：由氨基酸和非氨基酸两部分组成，其非氨基酸 部分通常是糖类、脂类、核酸及各种辅助因子等（血红蛋白， 核蛋白等） 化学结构
3、分子外形的对称程度 球状蛋白质：球状蛋白质：分子对称性佳，外形接近球状或椭球状，溶解 度较好，能结晶 纤维状蛋白质：纤维状蛋白质：分子对称性差，分子类似细棒或纤维；又可 再分为可溶性（肌球蛋白、血纤维蛋白原等）和不溶性（胶 原、角蛋白、丝素蛋白等） 结合蛋白质结合蛋白质 糖蛋白：糖蛋白： 由低聚糖（分子量为 5203500 左右）通过共价键 与蛋白质连接而成的复合蛋白。 有的蛋白质还与几 个带有高电荷的多糖（如硫酸软骨素、肝素和透明 质酸）通过共价键或非共价键结合在一起。 脂蛋白：脂蛋白： 脂主要通过非共价键相互作用与蛋白质连接，且脂 可大可小。 核蛋白：核蛋白： 蛋白质与核酸（既有 RNA，
4、也有 DNA）紧密相连， 其连接在本质上是非共价结合的。 不少蛋白质还需要小分子量的辅助因子来完成其生 物功能，这些辅助因子常与蛋白质紧密相连，分离时常 常同蛋白质一起被分离出来；它们的连结，既有共价结 合，也有非共价结合。 蛋白质的基本结构蛋白质的基本结构 蛋白质的基本组成蛋白质的基本组成氨基酸氨基酸 组成蛋白质基本结构的有二十种氨基酸（氨基酸） 氨基酸通式 脯氨酸 从 H 向 C方向看过去，氨基、羧基、R 基若沿顺时针 方向排列的是 L构型。自然界中存在 D氨基酸，但蛋白 质中的所有氨基酸都是 L构型。 氨基酸的分类氨基酸的分类 H2NCHC CH3 OH O H2NCHC CH2 OH
5、O CH2 CH2 NH C NH2 NH H2NCHC CH2 OH O C NH2 O H2NCHC CH2 OH O C OH O H2NCHC CH2 OH O CH2 C OH O H2NCHC CH2 OH O N NH H2NCHC CH2 OH O CH2 CH2 CH2 NH2 H2NCHC CH2 OH O CH2 C NH2 O H2NCHC CH2 OH O SH H2NCHC CH2 OH O CH2 S CH3 H2NCHC H OH O H2NCHC CH OH O CH3 CH3 HN COH O H2NCHC CH2 OH O CHCH3 CH3 H2NCHC
6、 CH2 OH O H2NCHC CH OH O CH3 CH2 CH3 H2NCHC CH2 OH O HN H2NCHC CH2 OH O OH H2NCHC CH OH O OH CH3 H2NCHC CH2 OH O OH 侧链性质侧链性质 acidic large hydrophobic basic small hydrophobic polar residue sulphur containing alcoholic residues 谷氨酸 Glu 天冬氨酸 Asp 甲硫氨酸 Met 半胱氨酸 Cys 组氨酸 His 精氨酸 Arg 赖氨酸 Lys 天冬酰胺 Asn 谷酰胺 Gl
7、n 苯丙氨酸 Phe 亮氨酸 Leu 色氨酸 Trp 异亮氨酸 Ile 酪氨酸 Tyr 丝氨酸 Ser 苏氨酸 Thr 甘氨酸 Gly 丙氨酸 Ala 脯氨酸 Pro 缬氨酸 Val 被修饰的氨基酸被修饰的氨基酸 氨基酸序列氨基酸序列蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构就是氨基酸残基的排列顺序以及二硫键（如果存在）的位置。理 论上，每种蛋白质具有唯一而确切的氨基酸顺序。 多肽链组成的蛋白质 是有方向的，惯例认 为氨基端为多肽链的 头，简称N端；相应地， 羧基端为尾，简称C端 卵清溶菌酶的一级结构 蛋白质一级结构的重要性蛋白质一级结构的重要性 测定蛋白质中氨基酸顺序
8、的意义：测定蛋白质中氨基酸顺序的意义： 氨基酸顺序是决定蛋白质生物活性的分子基础（氨基酸顺序是决定蛋白质生物活性的分子基础（i.e. 酶酶 的活性部位及其作用机理的阐明）的活性部位及其作用机理的阐明） 从某种意义上，氨基酸顺序将决定蛋白质的二级结构从某种意义上，氨基酸顺序将决定蛋白质的二级结构 构象和三级结构；而其与三级结构之间的相互关系构象和三级结构；而其与三级结构之间的相互关系 的分析，更揭露了控制多肽链折叠的一些规律的分析，更揭露了控制多肽链折叠的一些规律 如果蛋白质具有生理活性的话，氨基酸顺序的异常可如果蛋白质具有生理活性的话，氨基酸顺序的异常可 能导致其功能异常和疾病（能导致其功能异
9、常和疾病（i.e.镰刀形贫血症）镰刀形贫血症） 氨基酸顺序指明该蛋白质的进化史（进化中的分子事氨基酸顺序指明该蛋白质的进化史（进化中的分子事 件）件） 蛋白质一级结构的测定方法蛋白质一级结构的测定方法 蛋白质均一性的确定：蛋白质均一性的确定：分子量、荷电性、氨基酸组成、氨端分子量、荷电性、氨基酸组成、氨端 和羧端残基、生物活性、结晶性等和羧端残基、生物活性、结晶性等 氨基酸顺序测定程序：氨基酸顺序测定程序： 蛋白质或肽链的氨基酸定量分析（有时也包括其他化蛋白质或肽链的氨基酸定量分析（有时也包括其他化 学组成，如糖、核酸等的分析）学组成，如糖、核酸等的分析） 肽链末端残基，包括肽链末端残基，包括
10、N端基与端基与C端基残基的测定端基残基的测定 肽链的专一性降解与碎片的分离纯化肽链的专一性降解与碎片的分离纯化 分别测定肽链与碎片的氨基酸顺序分别测定肽链与碎片的氨基酸顺序 从已知肽的顺序，根据有交盖重叠顺序的碎片相联的从已知肽的顺序，根据有交盖重叠顺序的碎片相联的 原则，复现肽链或蛋白质的一级结构原则，复现肽链或蛋白质的一级结构 确定分子中二硫键的位置确定分子中二硫键的位置 肽链的降解肽链的降解 降降解解方方式式 降降解解专专一一 化化学学降降解解 溴溴化化氢氢 甲甲硫硫氨氨酸酸的的羧羧基基端端（但但对对 Met-Thr 和和 Met-Ser 的的产产率率较较低低，而而对对甲甲硫硫 氨氨酸酸
11、的的砜砜和和亚亚砜砜则则完完全全不不降降解解） BNPS甲甲基基吲吲哚哚 色色氨氨酸酸的的羧羧基基端端 稀稀酸酸 天天冬冬氨氨酸酸的的两两侧侧，极极少少作作用用于于天天冬冬酰酰胺胺、谷谷氨氨酸酸、谷谷氨氨酰酰胺胺 甲甲酸酸(70) 最最适适于于天天冬冬氨氨酸酸脯脯氨氨酸酸键键 羟羟胺胺 天天冬冬酰酰胺胺甘甘氨氨酸酸键键 酶酶法法降降解解 胰胰蛋蛋白白酶酶 赖赖氨氨酸酸、精精氨氨酸酸的的羧羧基基端端(赖赖氨氨酸酸脯脯氨氨酸酸，精精氨氨酸酸脯脯氨氨酸酸例例外外，酶酶 解解较较少少) 内内肽肽酶酶 Lys-C 赖赖氨氨酸酸(和和 S氨氨乙乙基基半半胱胱氨氨酸酸)的的羧羧端端 内内肽肽酶酶 Arg-C
12、 精精氨氨酸酸的的羧羧基基端端 内内肽肽酶酶 Glu-C 谷谷氨氨酸酸的的羧羧基基端端 内内肽肽酶酶 Asp-N 天天冬冬氨氨酸酸和和氧氧化化蛋蛋白白中中的的氨氨基基末末端端 胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶 最最适适位位点点是是苯苯丙丙氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸和和亮亮氨氨酸酸的的羧羧基基端端 嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶 最最适适位位点点是是疏疏水水残残基基(亮亮氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸、颉颉氨氨酸酸、甲甲硫硫氨氨 酸酸、色色氨氨酸酸)的的羧羧基基端端 肽键和二面角肽键和二面角 两个氨基酸连接成的二肽。图中表 示了和的定义：代表绕CC 单键的转动；代表绕CN单键的 转动
13、肽键具有部分双键性质 （0.132nm），不能自由 旋转 肽单位是刚性平面结构 在肽单位上，CO 与N H或两个C呈反式排布 构象构象蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 蛋白质二级结构：蛋白质二级结构： 多肽链主链骨架中的若干肽段， 各自延着某多肽链主链骨架中的若干肽段， 各自延着某 个轴盘旋或折叠， 并主要以氢键维系。个轴盘旋或折叠， 并主要以氢键维系。 其涉及按主链相互接近其涉及按主链相互接近 的氨基酸残基的空间关系，而不涉及氨基酸残基的侧链构象的氨基酸残基的空间关系，而不涉及氨基酸残基的侧链构象 螺旋螺旋 ( -helix)：棒状结构。蛋白质中发现的均为右手型螺棒状结构。蛋白质中发现的均为
14、右手型螺 旋旋 折叠折叠 ( -sheet)： 片状物。 相邻的两条链可以是走向相同 （平片状物。 相邻的两条链可以是走向相同 （平 行），也可相反（反平行）行），也可相反（反平行） 转折转折 ( -turn)：可使多肽链扭转走向可使多肽链扭转走向 无规线团无规线团 (random coil)：没有规则的那部分肽链构象没有规则的那部分肽链构象 螺旋螺旋 helix 的具体参数的具体参数 折叠折叠 平行和反平行平行和反平行 折叠折叠 Hydrogen bond patterns in beta sheets. Here a four-stranded sheet is drawn schemat
15、ically which contains three anti-parallel and one parallel strand. Hydrogen bonds are indicated with red lines (anti- parallel strands) and green lines (parallel strands) connecting the hydrogen and receptor oxygen. 转折（转折（I型和型和II型）型） Turns are classified into Types according to the (, ) angles of th
16、e two central residues (residue 2 and 3). The main types are Type I and Type II which have mirror images in Types I and II (because the mirror image types require positive (, ) angles the most common residue in these turns is Gly). The Pro residue is very common in -turns, as it always has the corre
17、ct angle (-60) and it has one less unsaturated hydrogen donor. Since a -turn has several unsaturated back- bone hydrogen bond donors and acceptors, it is polar, and is usually found near the surface of the protein. A -turn is a short secondary structure, only 4 residues in length, which enables the
18、overall structure to have 180 degree turns. Turns are characterized by a hydrogen bond between the CO group of residue n and the NH group of residue n+3. 维持蛋白质分子构象的化学键维持蛋白质分子构象的化学键 1. 氢键：氢键：XH Y，XH 为质子供体，Y 为质子受体 2. 疏水键：疏水键：两个非极性基团（疏水基团）为避开水相而群集 在一起的作用力 3. 范德华引力（键）：范德华引力（键）：一类静电引力（取向力、诱导力、色 散力），与距离六次
19、方成反比，相互吸引，但不碰撞。氢 键是一种特殊的范德华引力 4. 离子键：离子键：由于正负离子之间的静电吸引所形成的化学键 5. 配位键：配位键：两个原子之间，由单方面提供共用电子对所形成 的共价键 6. 二硫键（桥）：二硫键（桥）：两个硫原子之间的化学键，键能很大（30 100 千卡/克分子） 维持构象化学键的形式维持构象化学键的形式 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 蛋白质三级结构：蛋白质三级结构：一条多肽链在二级结构的基础上， 由于其顺序上相隔较远的氨基酸残基侧链的相互作 用，而进行广泛的盘旋和折叠，从而产生特定的很 不规则的球状构象。其不涉及一条多肽链上的原子 与另一条多肽链的关系。此
20、定义仅适用于球状蛋白 维持蛋白质分子三级结构的化学键主要也是次级键，但 二硫键和疏水键的作用大大提高 硫氧还蛋白的二、三级结构硫氧还蛋白的二、三级结构 The protein thioredoxin (2TRX) contains a five-stranded -sheet comprised of three parallel strands and three antiparallel strands. The entire protein is shown as a cartoon with the -strands (three parallel strands and three
21、antiparallel strands) colored red and -helices colored yellow. 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 蛋白质四级结构：蛋白质四级结构：各亚单位在寡聚蛋白中的空间 排布及亚单位之间的相互作用。不考虑亚单位本 身的构象。由相同亚单位构成的四级结构均 一四级结构；由不同亚单位构成的四级结构 非均一四级结构 亚单位（亚单位（Subunit）：）：有些球蛋白含有两条或更多条多肽 链，并彼此以非共价键相连，每条肽链有自己的三级结构， 此多肽链即为蛋白质分子的亚单位（亚基） 寡聚蛋白（寡聚蛋白（Multimeric protein）：）：由亚单位聚集
22、而成的 蛋白质分子 谷氨酸脱氢酶的四级结构谷氨酸脱氢酶的四级结构 分子量为313 , 000的六聚体（相同的亚单位） 蛋白质的变性和复性蛋白质的变性和复性 牛胰核糖核酸酶(Rnase)的复性，活性恢复95以上 蛋白质（多肽）的合成蛋白质（多肽）的合成 蛋白质的合成 化学合成 生物合成 由不同氨基酸按一定顺序 的控制合成 蛋白质（多肽）的化学合成 由一种或几种氨基酸聚合 或共聚合 液相合成法：液相合成法：在有机溶剂中进行的均相反应 固相合成法：固相合成法：以不溶性高聚物为载体，尽可能以统一的自动 化方法在短时间内合成 意义和基本步骤意义和基本步骤 多肽的全合成可验证新的多肽结构 设计新的多肽，用
23、于研究结构和功能的关系 为多肽生物合成反应机理提供重要信息 建立模型酶 合成新的多肽药物 氨基、羧基和侧链基团的保护 羧基的活化和形成酰胺键的缩合反应 重复上述反应以形成更多的酰胺键 脱除保护基团，得到最终产物目标多肽 氨基酸之间反应的复杂性氨基酸之间反应的复杂性 DCC：N,N-二环己基碳二亚胺（N,N-dicyclohexylcarbodiimide） 对暂时勿需参与反应的活性基团的保护和对参与形成 酰胺键的羧基进行活化，是成功合成具有特定氨基酸顺序 的多肽的两个基本条件。 保护基团的原则保护基团的原则 能与被保护基团结合 除去时不影响肽链 氨基的保护氨基的保护 氨基的亲核性很强，其经酰化
24、后，亲核性消失。因此对 游离氨基实施酰基化，是保护氨基的基本方法 1. 叔丁氧基羰基(tert-butoxycarbonyl group, 简称t-Boc) t-Boc基团可以在温和的酸性条件下被除去，产物容易分离 氨基的保护氨基的保护 2. 苄氧羰基(carbobenzoxy group, 简称CBz) 氨酯结构 CBz基在弱酸性条件下比较稳定，在催化氢解时可被除 去，产物也容易分离 注意CBz的除去条件与t-Boc的不同! 常用的氨基保护基团常用的氨基保护基团 保护基保护基缩写名称缩写名称在以下条件稳定在以下条件稳定除去条件除去条件 t-BocH2/Pd 或碱或碱 HBr+CH3COOH
25、或或 CF3COOH CBzCF3COOH 或碱或碱HBr+CH3COOH 或或 H2/Pd BPoc碱碱CH3COOH+HCOOH, CF3COOH 或或 HBr Na-NH3, H2/Pd, HCl 或或 HBr+CH3COOH NH2NH2-H2O 常用的氨基保护基团常用的氨基保护基团 保护基保护基缩写名称缩写名称在以下条件稳定在以下条件稳定除去条件除去条件 TosylHBr+CH3COOH 或碱或碱Na-NH3 Trityl碱碱 H2/Pd 或或 CH3COOH(80%) H2/Pd 或或 Na-NH3NH2NH2+醇醇+酸酸 温和碱性条件温和碱性条件 羧基的保护羧基的保护 氨基酸中的
26、羧基一般是以成盐（钾盐、钠盐、三乙胺盐 等，临时性）或成酯的方式被保护。氨基酸甲酯和乙酯是将 氨基酸与甲醇或乙醇在盐酸存在下反应制得。 氨基酸苯甲醇酯（benzyl ester, 苄酯）：先生成氯亚硫酸酯 羧基的保护羧基的保护 叔丁醇酯（t-butyl ester）的制备一般采用酯交换法 保保护护基基缩缩写写名名称称在在以以下下条条件件稳稳定定除除去去条条件件 BzlCF3COOH H2/Pd或或碱碱（有有副副反反应应） t-BuH2/PdCF3COOH H2/Pd或或酸酸 NH2NH2-H2O或或碱碱（有有 副副反反应应，易易消消旋旋和和肽肽键键 断断裂裂） 侧基的保护侧基的保护 , -CO
27、OH of Glu and Asp Glu(OMe) Glu(OBut) Glu(OBzl), Asp(OBzl) -OH of Ser and Thr Ser(Bzl) Ser(But) Thr(Bzl) His的咪唑基：His(CBz), His(Tos, 对甲苯磺酸基) 保护至最后 -NH2 of Lys：Tos；在Na-NH3中除去，在催化氢化 或HBr/HAc除-NH2的保护基CBz时不受影响 -SH of Cys：Bzl (Na-NH3中除去); MBzl(对甲氧苄基， HF、0C、30min除去); Trt(三苯甲基) 羧基的活化羧基的活化 正常条件下，氨基酸的羧基和氨基之间不会
28、自发形成肽键，故两者 必须有一转变为更活泼的形式。由于活化氨基的反应激烈，且常常产生 消旋化，通常将羧基活化。 其共同的驱动力为碳原子亲电性的加强：由于活化取代基X的负诱 导效应，被活化基团中原来的低电子密度进一步降低，形成的亲电中心 允许亲核的非离子化氨基对它进行攻击。 合成肽的常规方法是从C端向N端进行 肽键的形成肽键的形成 1. 羧基活化法 酰氯法 实际中很少应 用，因为容易 引起氨基酸消 旋化 酸酐法 由于有两个亲电中心，形成肽键时有等量的副产物 解决方法： 仍有氨基 酸消旋化 的问题 酰基叠氮法 优点是不易引起氨基酸的消旋化 缺点是？ 酰基叠氮 在使用和 储存时易 分解，但 可进一步
29、 将其变为 活性酯 活性酯法 另一种重要的活性酯 活性酯与氨基反应形成的酰胺键 偶联剂和肽键的形成偶联剂和肽键的形成 偶联剂：偶联剂：一种能帮助羧基和氨基之间脱水和缩合的试剂 碳二亚胺(carbodiimides)：一类偶联剂的总称，结构通式为 分子的中心碳原子具有亲电性，容易受亲核试剂进攻， 因而碳二亚胺可与各种弱酸加成 类似酸酐结构类似酸酐结构 碳二亚胺与羧基反应，形成不稳定的类酸酐中间产物，可进一步发生三种类型的反应碳二亚胺与羧基反应，形成不稳定的类酸酐中间产物，可进一步发生三种类型的反应 由第二分子酸由第二分子酸 进攻形成酸酐进攻形成酸酐 （脲） 与胺直接反应形成酰胺键与胺直接反应形成
30、酰胺键 最常用的是N,N-二环己基碳二亚胺(DCC): DCC作为偶联剂合成作为偶联剂合成 二肽的反应过程二肽的反应过程 在温和反应条件在温和反应条件(0 C)下，第二分子氨基酸（羧基已被保护）与下，第二分子氨基酸（羧基已被保护）与DCC不发生作用，但不发生作用，但 可以与类酸酐中间产物反应，生成肽键。可以与类酸酐中间产物反应，生成肽键。DCU不溶于大多数有机溶剂，易与多肽产物不溶于大多数有机溶剂，易与多肽产物 分离。分离。 Woodward试剂：本身是一种脱水剂。先在碱的作用下开环， 形成一类似于碳二亚胺的活性碳原子： Woodward 试剂的应用范围比DCC小。优点是方法简便， 产率高；缺
31、点是容易产生消旋化。 多肽合成的策略多肽合成的策略 肽肽链链逐逐渐渐增增加加法法 片片段段组组合合法法 g-h a-b c-d e-f g-h f-g-h a-b-c-d e-f-g-h e-f-g-h, , a-b-c-d-e-f-g-h a-b-c-d-e-f-g-h 产产率率： 7（8 1） （8 为多肽中氨基酸残基数； 为偶 联反应的平均产率） 3（log28） 保保护护基基团团去去除除 每加入一个新氨基酸残基前须除去一 个氨基保护基 两个肽段缩合前，须除去一个肽段 的氨基和另一肽段的羧基保护基 消消旋旋化化 可能性较小，可用各种偶联剂 可能性较大，必须选择 DCC 等不 易引起消旋化
32、的偶联剂 对对偶偶联联反反应应的的 要要求求 每一步偶联反应较易进行，但要求高 产率 片段多肽之间偶联较难进行，但对 每一步反应产率要求不高 对合成相对分子质量不大的多肽，两种方法均可采用；而若合成相对 分子质量大的多肽，一般采用片段组合法：合成含有32个氨基酸残基的多 肽，若要求总产率为30%，对于片段组合法和逐步增长法，其每一步的产率 分别要求为78%和96%左右。 多肽固相合成法多肽固相合成法 Merrifield合成法：合成法：所要合成的目标多肽的C端氨基酸的 羧基（氨基被保护）以共价键形式与一个不溶性的高分子树 脂相连；脱除氨基保护基后，以此氨基酸的氨基为多肽合成 的起点，同其它氨基
33、酸（氨基被保护）已活化的羧基作用形 成肽键。不断重复此过程，即可得目标多肽产物。 优点 反应时间短 易实现自动化蛋白质自动合成仪 无需溶解（选择溶剂）和精制中间体 缺点适合于合成1520肽；当合成肽较大时，纯度不高。 常选择PS为载体，在树脂的苯基上引入氯甲基，将目标多肽的C端羧 基与苄氯作用形成苄酯，第二个氨基酸的氨基用叔丁氧羰基保护后，以 DCC为缩合剂而形成肽键。重复此程序。合成的最后一步，是将树脂悬浮 在无水三氟乙酸中，通入干燥HBr，即可将多肽从树脂上解脱，同时残存的 保护基也被去掉。 多肽固相合成和液相合成的比较多肽固相合成和液相合成的比较 羧基递增方式羧基递增方式：把氨基酸N端的
34、氨基以共价键连于固相载体，活化其羧 基与下一个氨基酸的氨基缩合。 将侧链功能基团连于固相载体：将侧链功能基团连于固相载体：i.e.二硝基苯为桥将组氨酸的咪唑基连 于固相载体。此法既可以双向伸长肽链，又有利于肽的环化（二硫键 的生成），同时也可在温和条件下从载体上裂下肽段。 组合合成法合成多肽组合合成法合成多肽 组合合成法：组合合成法：由于多肽及蛋白质在生命过程中的特殊作用，特别是在药物 化学和分子生物学等领域的研究中，需要获得大量的不同结构的多肽，以 便进行结构与活性关系研究和生物活性的筛选。因此，合成单一产物的传 统合成方法已经不能满足要求。近十年来，化学家们在多肽固相合成法基 础上，发展成
35、一种新的多肤组合合成法建立肽库。 组合合成法合成多肽主要有两条途径：并行合成法并行合成法(parallel synthesis) 和均分合成法均分合成法(split synthesis)。前者合成速度较慢，合成容量小，现在已 经很少应用。 均分合成法的基本原理基本原理是：每一个合成步骤分别合成出x组 中间体，混合均匀后再平均分成x份，分别延长一个结构单 元。反应产物再混合均分成x份，再延长一个结构单元，直 至完成全部合成。 合成目标：合成目标：C- 端为Ala，其他 三个氨基酸组 成为G1u，Phe 和Lys的四肽。 这种类型的四 肽库共有异构 体数目应为33 27个。 近年来，均分法合成多肽
36、的技术发展很快。现在已经可以应用该 技术同步合成上百万个多肽分子，并同时进行生物活性筛选。例如应用 改进的均分法成功地合成了五肽库。首先将19种氨基酸(由于Cys容易氧 化形成交联二硫键，在该合成中未采用)分别连接在树脂上，得到19个 树脂-氨基酸。将其混合均匀并脱除保护基后，均分成19份，分别与19 种氨基酸(氨基和侧链必须保护)进行缩合反应，可以得到1919=361个 树脂-二肽。重复上述步骤三次(混合、脱保护基、均分和与19种氨基酸 缩合)，即可合成出195=2,476,099个树脂-五肽。在脱除保护基后，多肽 不必从树脂上分离，即可直接进行生物活性筛选与受体分子反应。 其中与受体分子作
37、用的树脂-多肽能够形成显色络合物，可以在显微镜 下将它们分检出来。由于此法可以保证在同一个树脂株上合成的多肽是 完全相同的，因此，筛选出来的树脂-多肽，用8mo1/L的盐酸胍将多肽 与树脂分离后，可用微量多肽测序仪测出该肽的氨基酸顺序。这样，我 们就能够从上百万个多肽异构体中，快速筛选出有希望的多肽。 组合合成法与传统的合成方法相比较，最大的特点是可同时制备 大量不同结构的多肽异构体，而且简化了百分之八十以上的操作步骤， 是一个高效率低成本的理想合成法。 蛋白质的分离和提纯蛋白质的分离和提纯 蛋白质分离提纯的一般原则蛋白质分离提纯的一般原则 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质 在
38、组织或细胞中通常都是以复杂的混合物形式存在，每种 类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。目前为止，还没 有一个单独的方法能把任何的一种蛋白质从复杂的混合蛋 白质中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择 一套适当的分离提纯程序以获得高纯度的制品。蛋白质提蛋白质提 纯的总目标是增加制品纯度或比活性。纯的总目标是增加制品纯度或比活性。 为了成功地分离和纯化一种蛋白质，需要有一个根据背 景知识和下述准则建立起来的合适策略 什么是最好的来源？ 需考虑来源是否方便得到和来源的量，以及所需蛋白质是否丰 富等。过去在实验室中常从动物的肝脏中得到大量的蛋白质； 现在，大多数生化学家则是采用培养的细胞如细菌、
39、酵母或哺 乳动物细胞。目前，利用基因克隆的长处，所需的蛋白质可以 通过表达来大量得到，从而使纯化方法更具有意义。 关于蛋白质我们已知什么？ 如果一个蛋白质过去已从不同的来源纯化得到，它的很多 信息可应用到新来源的蛋白质。例如：分子的大小、定位、 等电点、疏水性及翻译后的修饰等，应该保持相同。如果 蛋白质是一个酶或受体，则根据该蛋白质与底物或配体的 关系可以制定出一个成功的纯化策略。 蛋白质需要有多纯？ 蛋白质纯化的程度通常取决于它最后的用途。如果蛋白质 是供研究用的，则它应该是非常纯的，如果蛋白质是用于 工业的，部分纯化就足够了。 纯化蛋白的量要多少? 对于活性研究用的，只需要比较少量的活性蛋
40、白质；而对 于进行结构研究用的蛋白质来说，则需要比较大量的高纯 度蛋白质。 蛋白质应该如何进行鉴定? 在蛋白质纯化过程中，为了进行蛋白质的追踪，必须有一 个快速、重复性好而且灵敏的鉴定方法。此鉴定方法还应 该是经济的，能在小体积下进行操作，而且不要求采用昂 贵的仪器。 纯化时间应该多长? 纯化步骤应该很快，以减少蛋白质活力的丧失和蛋白质降解 等。一般来说蛋白质的量在纯化过程的各步中均会有损失， 因此应当尽量减少纯化步骤，以期获得最大的产率。 什么是最终花费? 对于商用蛋白质来说费用和时间非常重要。 蛋白质分离提纯的一般程序蛋白质分离提纯的一般程序 分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可分为前处理、
41、 粗分级和细分级三步： 前处理：前处理：分离提纯蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组 织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状 态，不至于丢失其生物活性。不同的组织或细胞可用不同 的方法破碎；组织或细胞破碎以后，选择适当的介质（一 般用低浓度的缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。有时在 肌肉组织中抽提时也用稀碱（肌肉中含有乳酸）；在提取 膜蛋白或包含在体内的蛋白质时，可加入表面活性剂以增 加溶解度。由于在细胞中普遍存在各种蛋白质水解酶，有 时需低温操作和加一些相应的蛋白酶抑制剂、螯合剂可防 止蛋白质的降解。 粗分级：粗分级：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的 方法将所要的蛋白质与其
42、它杂蛋白质分离开来。一般这类 的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 其特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩 蛋白质溶液。 细分级：细分级：即样品的进一步提纯。一般使用层析法包括凝 胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必 要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦电泳等 作为后续的提纯步骤。 结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。尽管结晶并不能保 证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量上 占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程 度的提纯，而重结晶又可除去少量的夹杂蛋白质。由于 结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的
43、结晶不仅 是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力 指标。 蛋白质的纯度越高、溶液浓度越浓就越容易结晶。结晶 的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，这可以借控制 温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH等方法来达到。 蛋白质的分离蛋白质的分离 根据蛋白质在溶液中的性质分离蛋白质混合物的方法根据蛋白质在溶液中的性质分离蛋白质混合物的方法 根据根据分子大小不同分子大小不同的分离方法的分离方法 透析和超过滤：透析和超过滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质， 使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 常用的半透膜是赛璐玢纸、赛璐啶纸或其它合成以及天然 材料。超过滤是利用压力或离心力强行使
44、水和其它小溶质 分子通过半透膜。密度梯度（区带）离心：密度梯度（区带）离心：蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它 的大小，也取决于它的密度。如果蛋白质颗粒在具有密度 梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度 小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到于自身密 度相等的介质梯度时，就停滞不前，最后各种蛋白质在离 心管中被分离成各自独立的区带，并于离心管的底部被收 集。 凝胶过滤，即凝胶过滤层析：凝胶过滤，即凝胶过滤层析：这是根据分子大小分离 蛋白质混合物最有效的方法之一。当不同分子大小的 蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分 子不能进入珠内网状结构而被排阻在凝胶珠外，随溶 剂在凝胶珠
45、之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比 网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。 这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离。 利用利用溶解度差别溶解度差别的分离方法的分离方法 利用蛋白质的溶解度差别来分离各种蛋白质是实践中最 常用的方法。影响蛋白质溶解度的因素很多，但在同一 的特定外界条件下，不同蛋白质应具有不同的溶解度， 因为溶解度归根结底取决于蛋白质本身的分子结构。适 当地改变外界因素，就可以选择性地控制蛋白质混合物 中某一成分的溶解度。 等电点沉淀和等电点沉淀和pH控制：控制：蛋白质是带有正电荷和负电荷的 两性电解质，带电基团的电荷数量则因pH的不同而变化。 当蛋白质处于等电点
46、pH时，蛋白质的净电荷为零，以至 于蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于集聚、沉淀，因 此其溶解度达到最低点，由此可将蛋白质混合物彼此分 开。如此沉淀出来的等电蛋白质保持着天然构象，能重 新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 蛋白质的盐溶和盐析：蛋白质的盐溶和盐析：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显 著的影响。低浓度时，中性盐可增加蛋白质的溶解度盐 溶，其机理为蛋白质分子吸附某种盐离子后，带电表层使 蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子间的相互作用却 增强。当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶 解度开始下降，离子强度足够高时，很多蛋白质可从水溶 液中沉淀出来盐析。主要是大量的中性盐的加入，
47、使水 的活度降低，原来的大部分自由水转变为盐离子的水化水， 从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋 白质分子表面的水化层。 有机溶剂分级法：有机溶剂分级法：与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇 和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室 温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变 性。若将溶剂冷却到40C60C，然后在不断搅拌 下逐滴加入有机溶剂以防局部浓度过高，变性问题可在 很大程度上得以解决。在一定温度、pH和离子强度下， 引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度会有差别，由此控制 有机溶剂浓度也可以分离蛋白质。有机溶剂引起蛋白质 沉淀的主要原因有二，一是改变了介质的介电常数，即
48、 导致了两个相反电荷之间吸引力的变化；二是与蛋白质 争夺水化水（同盐析现象类似），促使蛋白质集聚并沉 淀。 温度对蛋白质溶解度的影响：温度对蛋白质溶解度的影响：在一定的温度范围内（约 040C之间），大部分球状蛋白的溶解度随温度的升 高而增加，但也有例外。在4050C以上，大部分蛋白 质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去 溶解能力。 根据携带根据携带电荷不同电荷不同的分离方法的分离方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的 方法通常有两种 电泳：电泳：在外电场的作用下，带电颗粒，如不处于等电状态 的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现 象被称为电泳或离
49、子泳；或者说，电泳是在外电场存在下， 利用分子携带的净电荷不同分离分子混合物的一种实验技 术。带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净 电荷量以及颗粒的大小和形状。离子交换层析：离子交换层析：这是一种用离子交换树脂（在蛋白质和核 酸的分离中，常用离子交换纤维素和离子交换交联葡聚糖 作为支持介质）作为支持剂的层析法。阴离子交换树脂含 有碱性基团，可解离出OH，能和溶液中的阴离子发生交 换而使之结合在树脂上。在离子交换层析中，蛋白质对离 子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引， 而后者又于溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋 白质的电离程度。蛋白质混合物的的分离可以由改变溶
50、液 中的盐离子强度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的 蛋白质首先由层析柱中洗脱出来。 蛋白质的选择吸附分离蛋白质的选择吸附分离 某些物质，如极性的硅胶和氧化铝以及非极性的活性炭等 粉末具有吸附能力，能将其它种类的分子吸附在其粉末颗 粒的表面，而吸附力的强弱又随被吸附的物质性质不同而 异。吸附层析法就是利用这种吸附力的强弱不同而达到分 离的目的。蛋白质分子与各种吸附剂结合的真实性被了解 得很少：认为与非极性吸附剂作用可能主要是靠范德华力 和疏水相互作用，而与极性吸附剂作用可能是离子吸引和 （或）氢键键合。蛋白质提纯中使用最广泛和最有效的吸 附剂是结晶磷酸钙Ca10(PO4)6(OH)2。具推
