1、培养液中酵母菌种群数量的变化培养液中酵母菌种群数量的变化探究探究实践实践指导指导本活动旨在让学生通过对培养液中酵母菌种群数量进行连续 7 天的观察，统计数据，建立数学模型，绘制酵母菌种群数量的变化曲线，达成探究种群数量变化规律的目的。（一）材料准备1.菌种可从公司购买或联系大学等科研院所获得，也可使用安琪酵母自行纯化。安琪酵母纯化的简单步骤如下。（1）取 0.3 g 干酵母，放入 250 mL 锥形瓶（含 100 mL培养液）中，置于摇床上振荡培养 12-15 h（30 ，150rmin-1），得到活化的酵母菌。（2）将活化的菌液摇匀，用无菌水进行 10 倍的稀释，然后取稀释液 100 uL，
2、涂布在固体培养基平板上，于 30恒温倒置培养 40-48 h，至平板上长出单菌落。（3）选取长势较好的单菌落，用无菌接种环挑取接种到100 L 锥形瓶 （含 50 mL培养液） 中， 振荡培养 12 h （30 ，r min-1） ， 得到实验所用菌种。 菌种可放在冰箱冷藏室内 （4）保存备用，可保存 2 周。2，培养基可以用教材中提到的无菌的马铃薯培养液、肉汤培养液、也可以用无菌的马铃薯葡萄糖培养基（PDA medium）或酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基（YPD medium），培养基可以购买获得；也可以由教师或学生配制，分装后于高压蒸汽灭菌锅中，121 灭菌 20 min，取出备用。3.其他用具
3、锥形瓶（配备封口膜、皮筋）、血细胞计数板、微量移液器或滴管、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、冰箱等。（二）实施建议本实验持续时间较长（7 天），因此一定要提前做好周密的计划。1，预实验和准备前期须进行预实验，以确定合适的接种量、培养条件和培养时间。通过血细胞计数板进行计数是本实验的难点，可在正式实验前培训学生。可以先选择易于观察、带有颜色的细胞，如蓝细菌等，专门训练学生操作显微镜和血细胞计数板的技能，以帮助学生较快掌握计数方法。由于本实验不能在一节课内完成，因此须提前规划，确保学生有足够的时间进行取样计数，可以选择以下方法。（1）接种后，每天在固定时间（如午休时间）取样。取样前先
4、摇匀，然后取样进行计数。（2） 提高培养温度。 将培养条件设为 35 ，150r min-1，分别于培养 0h、2h、4h、6h、8h、10 h、12h 时取样，可以将样品放在冰箱冷藏室内（4 ）保存，待上课时取出进行计数，计数前注意先摇匀。2.血细胞计数板血细胞计数板是一个特制的载玻片，其中部被一个横向的凹槽分为上下两部分（图 1-3），上下两个部分各有一个方格网，每个方格网分 9 个大方格。中央的一个大方格为计数用，称为计数室（图 14）。计数室的规格有两种：一种为 25 ?16 型，即一个计数室被分为 25 个中方格，每个中方格又分成 16 个小方格；另一种为 16 x 25 型，即一个
5、计数室被分为 16 个中方格，每个中方格又分成 25 个小方格。这两种计数室都由 400 个小方格组成。计数室的边长通常为 1mm，计数室两侧各有一条高出计数室平面 0.1 mm 的结构，因此，当在计数室上方盖上专用盖玻片后，可以使盖玻片和计数室之间形成 0.1 mm 的缝隙，所以计数室的容积为 0.1 mm3。教材第 11 页图、本页图 1-3 中的计数板显示小格面积为1/400 mm2，说明该计数板的计数室的边长为 1mm。如果计数室中充满酵母菌培养液，则计数体积为 0.1 mm33，计数（1）计数操作时应使用专用盖玻片。普通盖玻片较薄，重量较轻，面积较小，有可能会使渗人的菌液体积不准确，
6、导致计数不准确。（2）先将盖玻片放在计数室上，再用移液器或滴管将培养液滴在盖玻片边缘，让培养液自行渗入，用镊子轻压盖玻片，避免因菌液过多顶起盖玻片而改变计数室的容积。稍等片刻，待酵母菌细胞全部沉降到计数室底部再计数。如果先加培养液再盖盖玻片，那么盖玻片可能由于已加入液滴的表面张力而不能严密地盖到计数板表面，使计数室内部液体增多，导致计数结果偏高。此外，先盖盖玻片再滴加培养液，还能避免因直接滴加培养液时，在计数室内产生气泡，导致计数室相对体积减小而造成误差。如果酵母菌未能全部沉降到计数室底部，通过显微镜观察时就可能出现以下现象：要么能看清酵母菌但看不清格线，要么能看清格线但看不清酵母菌。（3）从
7、试管中吸出培养液进行计数前要振荡试管。如果未振荡试管就吸出培养液，可能出现两种情况：一是从试管下部吸取的培养液浓度偏大；二是从试管上部吸出的培养液浓度偏小。另外，酵母菌常出现“抱团”现象，因此取样前需要将培养液充分振荡、摇匀，最好用移液器来回吹吸若干次，以确保样品被混匀。（4）如果小方格内酵母菌数量过多，应当对菌液进行稀释。一般样品稀释后的适宜范围是 510 个菌体/每小格。（5）如果使用 25 16 型计数室，可采用五点取样法计数，即取四角（左上、左下、右上、右下）和最中间的 5 个中方格计数（图 1-5）；如果使用 1625 型计数室，可以取四角的 4 个中方格计数。（6）对于压在小方格界
8、线上的酵母菌，可依据“计上不计下，计左不计右”的原则计数。（7） 如遇酵母菌出芽， 芽体大小达到或超过母细胞的 1/2时，可将芽体作为 1 个菌体计数。4，统计与记录（1）如果使用 25x 16 型计数室，则培养液中酵母菌种群密度的计算公式为：酵母菌种群密度（个.mlL）=中方格中酵母菌数量的平均值?5x 10 x 稀释倍数。如果使用 16?25 型计数室，则培养液中酵母菌种群密度的计算公式为：酵母菌种群密度（个.mL）=中方格中酵母菌数量的平均值 x16x 10 x 稀释倍数。（2）可以利用 Excel 记录数据并作图，这样课上可快速绘制出酵母菌种群数量变化的曲线图。（三）注意事项1，应尽量
9、安排学生在超净工作台进行接种等操作；可使用数码显微镜进行计数。2，有条件的学校，可使用一次性的细胞计数板进行计数，这样可以节省时间、降低操作难度；可以利用细胞计数仅对待测细胞培养液中的细胞进行自动计数；还可采用其他方法代替血细胞计数板计数法，如使用分光光度计测定酵母菌培养液的吸光度，用吸光度表示酵母菌培养液的浓度。3，实验结束后，应将培养液等进行高温高压蒸汽灭菌处理。（四）拓展方案1，可对不同培养条件（如温度、pH、通 02量或通 CO2量不同，以及使用加糖或不加糖的培养基）下，酵母菌种群数量增长的情况进行探究。2，本实验的目的是研究一定时间内酵母菌活细胞数量的动态变化，但实际上显微镜直接计数的是总的菌体（包括死菌和活菌）。可以通过台盼蓝染色法区别活细胞与死细胞。活的酵母菌将呈无色，死的酵母菌将呈蓝色，然后分别计数，算出两者比例，从而进一步换算出总菌体数中的活菌数。需要注意的是，加入的台盼蓝的体积应折算在稀释倍数中。3，可以将本实验与选择性必修 3生物技术与工程中“酵母菌的纯培养”“制作果酒结合，探究酿酒过程中酵母菌数量的变化，还可以利用糖度计和酒精计测定酿酒过程中糖度和酒精度的变化，将种群数量变化曲线与糖度、酒精度变化曲线进行比较分析。
