1、3.1 3.1 导入扩增19441944年年艾弗里等人通过艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是不仅证明了遗传物质是DNADNA，还证明了，还证明了DNADNA可以可以在同种生物个体间转移。在同种生物个体间转移。19611961年年尼伦伯格和马尼伦伯格和马太太破译了第一个破译了第一个编码编码氨基酸的氨基酸的密码子密码子。截。截至至1966619666年，年，6464个密个密码子均被破译成功。码子均被破译成功。19701970年年科学家在科学家在细菌中发现了第细菌中发现了第一个一个限制性核酸限制性核酸内切酶内切酶（简称限（简称限制酶）制酶）19721972
2、年，年，伯格首伯格首先在体外进行了先在体外进行了DNADNA的改造，成功的改造，成功构建了构建了第一个体第一个体外重组外重组DNADNA分子分子。19821982年，年，第一个基因工第一个基因工程药物程药物- -重组人重组人胰岛素胰岛素被批准上市。基因工程被批准上市。基因工程药物药物成为世界各国研究成为世界各国研究和投资开发的和投资开发的热点热点。19531953年年沃森和克沃森和克里克建立了里克建立了DNADNA双双螺旋结构模型并螺旋结构模型并提出了遗传物质提出了遗传物质自我复制自我复制的假说。的假说。19671967年，年，科学家发科学家发现，在细菌拟核现，在细菌拟核DNADNA之外的质粒
3、有自我之外的质粒有自我复制能力，并可以复制能力，并可以在细菌细胞间转移在细菌细胞间转移。2020世纪世纪7070年代初，年代初，多种多种限限制酶制酶、DNADNA连接酶连接酶和和逆转录逆转录酶酶被相继发现。这些发现被相继发现。这些发现为为DNADNA的的切割、连接切割、连接以及功以及功能基因的获得创造了条件。能基因的获得创造了条件。19731973年，年，科学家证明了质科学家证明了质粒可以作为基因工程的载粒可以作为基因工程的载体，构建重组体，构建重组DNADNA，导入受，导入受体细胞，使外源基因在原体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并核细胞中成功表达，并实实现了物种间的基因交流现了物种间
4、的基因交流。至此，至此，基因工程正式问世基因工程正式问世。19851985年，年，穆里穆里斯等人发明斯等人发明PCRPCR, ,为获取目为获取目的基因提供了的基因提供了有效手段。有效手段。从社会中来 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用大下降。科学家通过精心设计用“分子工分子工具具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。番木瓜环斑病毒。 DNADNA双螺旋的直径只有双螺旋的直径只有2nm,2nm,对如此微小对如此微小的分子
5、进行操作，是一项非常精细的工作，的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的更需要专门的“分子工具分子工具”。那么，科学。那么，科学家究竟用到了哪些家究竟用到了哪些“分子工具分子工具”？这些？这些“分子工具分子工具”各具有什么特征呢？各具有什么特征呢？非转基因番木瓜非转基因番木瓜转基因番木瓜转基因番木瓜基因工程 就是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新就是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在
6、DNADNA分子水平上分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做进行设计和施工的，因此又叫做重组重组DNADNA技术技术。原原 理：理：基因重组基因重组操作水平：操作水平： DNADNA分子水平分子水平结结 果：果：定向定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的要的生物类型和生物产品生物类型和生物产品1 1、不同生物的基因为什么能拼接？、不同生物的基因为什么能拼接？2 2、外源基因为什么能在受体细胞中表达？、外源基因为什么能在受体细胞中表达？思考-讨论(1)DNA(1)DNA的基本组成的基本组成单位单位都是四种脱氧核苷酸。都是四种脱氧核苷酸。(2)(2)双链双链D
7、NADNA分子分子的的空间结构空间结构都是规则的双螺旋结构。都是规则的双螺旋结构。(1)(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)(2)遗传遗传信息的传递信息的传递都遵循中心法则。都遵循中心法则。(3)(3)生物界生物界共用一套遗传密码共用一套遗传密码。相同的遗传信息在。相同的遗传信息在 不同的生物体内表达出相同的蛋白质。不同的生物体内表达出相同的蛋白质。基因工程诞生的理论基础基因工程诞生的理论基础 “工欲善其事，必先利其器工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因番木瓜时，。在培育转基因番木瓜时，既要在体外对含有所需基因的既要在体外对含有所需基因的DNADN
8、A分子分子“切割切割”、改造和、改造和“拼拼接接”；又要将重组；又要将重组DNADNA分子导入番木瓜体内，并使其表达。分子导入番木瓜体内，并使其表达。DNA分子极小，实现这些精确操作需要哪些“分子工具”呢？3.1 3.1 重组重组DNADNA技术的基本工具技术的基本工具重组DNA技术的基本工具：（三）分子运输车（三）分子运输车-运载体运载体分子运输车（一）分子手术刀（一）分子手术刀-限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 分子手术刀分子手术刀（二）分子缝合针（二）分子缝合针-DNA-DNA连接酶连接酶 （一）分子手术刀（一）分子手术刀-限制性内切核酸酶（限制酶） 1、来源： 主要从原核生物中分离纯化
9、来的主要从原核生物中分离纯化来的3、特点 :4、: 2、种类： 数千种数千种 12345 G12345 A3,5-磷酸二酯键3端5端3端5端: （2）限制酶的识别序列 限制酶所识别序列的特点是：限制酶所识别序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是呈现碱基互补对称，无论是6 6个个碱基还是碱基还是4 4个碱基，都可以找到个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双一条中心轴线，中轴线两侧的双链链DNADNA上的碱基是上的碱基是反向对称重复反向对称重复排列的排列的 ，称为，称为回文序列回文序列 在切割部位，一条链在切割部位，一条链正向正向读的碱基顺序与另一条链读的碱基顺序与另一条链反向反向读的顺序
10、完全读的顺序完全一致一致。 能被限制性内切酶特异性识能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有别的切割部位都具有回文序列回文序列：黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端（3）EcoRI 限制酶的切割:伸出的核苷酸伸出的核苷酸互补配对互补配对黏性末端黏性末端EcoRI 只能识别只能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。黏性末端黏性末端黏性末端中轴线（4）SmaI 限制酶的作用SmaISmaI只能识别只能识别CCCGGGCCCGGG序列，并在序列，并在C C和和G G之间切开。之间切开。 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的当限制酶从识别序列的中心轴
11、线处切开时，切开的DNADNA两条单两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。在在C C和和G G之之间切开间切开平末端平末端（5 5）SmaI SmaI 限制酶限制酶的切割的切割 供体生物细胞取出DNA限制酶目的基因 现有现有EcoRIEcoRI限制酶（限制酶（识别识别GAATTC序列序列，在，在G和和A之间切）和之间切）和SmaISmaI限制限制酶（酶（识别识别CCCGGG序列序列，在，在C和和G之间切）之间切），请用这两种限制酶将、，请用这两种限制酶将、号号DNA片段分别切割为两段片段分别切割为两段。ATAGCATGCTATGAATTCGGCAT
12、ACCCATTATCGTACGATACTTAAGCCGTATGGGTAATAGCATGCTATCCCGGGAACATACCCATTATCGTACGATAGGGCCCTTGTATGGGTA模拟实验模拟实验1 1：模拟限制酶的剪切：模拟限制酶的剪切EcoRI限制酶限制酶只只能识别能识别GAATTC序列序列，并在，并在G和和A之间切割。之间切割。SmaI限制酶限制酶只能只能识别识别CCCGGG序列序列，并在，并在C和和G之间切割之间切割。ATAGCATGCTATGAATTCGGCATACCCATTATCGTACGATACTTAAGCCGTATGGGTAATAGCATGCTATCCCGGGAACATA
13、CCCATTATCGTACGATAGGGCCCTTGTATGGGTA回文序列限制酶识别序列的特征：反向重复，中心对称。结果结果：形成：形成黏性末黏性末端端或或平末端平末端黏性末端：黏性末端：平末端：平末端：ATAGCATGCTATGTATCGTACGATACTTAAAATTCGGCATACCCAT GCCGTATGGGTAATAGCATGCTATCCCTATCGTACGATAGGGGGGAACATACCCATCCCTTGTATGGGTA1 1、你、你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNADNA
14、的入侵，但生物在长期的进的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNADNA侵入时，侵入时，会利用限制酶会利用限制酶将外源将外源DNADNA切割掉切割掉，以保证自身的安全。所以，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNADNA、使之失效，从而、使之失效，从而达到保护自身的目的。达到保护自身的目的。寻根问底2 2、为什么为什么限制酶不剪切细菌本身的限制酶不剪切细菌本身
15、的DNADNA？ 通过通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶的识别切割序列不具备这种限制酶的识别切割序列，或者，或者通过甲基化酶将通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNADNA被切断，并且被切断，并且可以防止外源可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 寻根问底识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核
16、苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是原核生物数千种 1、来源： 2、种类：3、作用特点：4、结果：形成两种末端“分子手术刀分子手术刀”黏性末端黏性末端平末端平末端5、限制酶切一次可产生2个末端和2个游离的磷酸基团G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割用同种限制酶切割( (思考： 缺口怎么办？缺口怎么办？G C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G什么样的末端才能连接起来？，（二）分子缝合针（二）
17、分子缝合针-DNA-DNA连接酶连接酶1. 作用：2. 种类： Ecoli DNAEcoli DNA连接酶连接酶 T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶酸酸磷酸二酯键磷酸二酯键 。两两DNADNA片段要具有片段要具有互补的黏性末互补的黏性末端端才能拼起来才能拼起来可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，注意：DNADNA连接酶可连接双链DNADNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNADNA！1、Ecoli DNA连接酶的缝合作用（2 2）T T4 4 DNADNA连接酶连接酶可可把把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来起来，效率低，效率低CTTCATG
18、GAAGTACTTAAAATTCCCTAA GGGATT GG.TCTTAAAATTCC.AG TCTTCATGAGAAGTACTTAAAATTCCCTAAG GGGATTC GG.TCTTAAAATTCC.AG （3 3） Ecoli DNADNA连接酶在基因工程中的应用连接酶在基因工程中的应用（4）Ecoli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：类型类型DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶 DNA聚合酶DNA聚合酶(5)DNA聚合酶的作用DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶相同点相同点作用实质作用实质化
19、学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象作用作用结果结果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要DNA的一条链的一条链作模板作模板形成完整的重组形成完整的重组DNA分子分子形成形成DNA的一条链的一条链基因工程基因工程DNA复制复制只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连接连接到已有的到已有的DNADNA片段上，片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键在在两个两个DNADNA片段片段之间之间形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键（6）DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：（三）分子运输车（三）分子运输车-运载体运载体分子运输车质粒质粒将外源基因送入受体细胞
20、。将外源基因送入受体细胞。 1.1.作用作用：动植物病毒动植物病毒噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物2.2.种类：种类：质粒3、运载体需具备的条件（1 1）（2 2）有一个至多个有一个至多个限制酶切点限制酶切点（3 3）有某些有某些标记基因标记基因（4 4）对受体细胞）对受体细胞无害无害、易分离、易分离能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；便于与不同目的基因结合便于与不同目的基因结合便于鉴定和筛选便于鉴定和筛选大肠杆菌及质粒结构模式图质质粒粒的的特特点点质粒是基因工程中最常用的运载体质粒是基因工程中最常用的运载体最常用的质粒是大肠杆菌的质粒最常用的质粒是大肠
21、杆菌的质粒细胞染色体外能自主复制的小型环状细胞染色体外能自主复制的小型环状DNADNA分子分子存在于许多细菌及酵母菌等生物中存在于许多细菌及酵母菌等生物中质粒的存在对宿主细胞无影响质粒的存在对宿主细胞无影响质粒的复制只能在宿主细胞内完成质粒的复制只能在宿主细胞内完成4、小资料-质粒的特点：真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的大肠杆菌及质粒结构模式图 AATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAA ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG目的基因目的基因 TCCTAG AGGATCTTAA AATTCCATAC GAGCCATACTTAAA
22、ATTCTCGGTATGGGTATG 实例：实例： 重组重组DNADNA分子的模拟操作分子的模拟操作 AATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAA ATAGCATGCTATCCATG目的基因目的基因 TCCTAG AGGATCTTAA AATTCCATAC GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG GCCGTATG1 1、选目的基因两端和运载体、选目的基因两端和运载体都有都有的酶切位点；的酶切位点；2 2、所选酶切位点、所选酶切位点不能破坏不能破坏目的基因以及标记基因目的基因以及标记基因规律：-选择酶切位点的原则：Hind III和EcoR I下
23、列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？各抒己见限制酶限制酶DNA连接酶连接酶载体载体对受体细胞无害；对受体细胞无害；有一个至多个限制酶切割位点；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因；有特殊的标记基因；能自我复制或能整合到宿主能自我复制或能整合到宿主DNA上。上。质粒、质粒、 噬菌体衍生物噬菌体衍生物 、动植物病毒、动植物病毒小结小结基基因因工工程程的的基基本本工工具具作为载体作为载体的条件的条件种类种类:磷酸二酯键磷酸二酯键来源：来源：主要来源于原核生物主要来源于原核生物特点：特点：作用部位：作用部位：具有专一性具有专一性结果：结果：形成黏性末端或平末端形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键连接部位：磷酸二酯键 种类种类： E.coliDNA连接酶、连接酶、T4 DNA连接酶连接酶作用作用： 把把两条双链两条双链DNADNA片段拼接起来片段拼接起来
