1、吸光光度法吸光光度法Spectrophotometry2.1 概概 述述吸光光度法的定义吸光光度法的定义 吸光光度法吸光光度法(Spectrophotometry)是基于物是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光包括比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱法等。谱法等。重点讨论可见光区的吸光光法吸光光度法特点吸光光度法特点灵敏度高。常用于测定试样中质量分数为灵敏度高。常用于测定试样中质量分数为10-210-5的的 微量组分，甚至更低。微量组分，甚至更低。准确度较高。吸光光度法为准确度较高。吸光光度法为2%5%
2、。应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化合物都应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化合物都 可以直接或间接地用吸光光度法进行测定。可以直接或间接地用吸光光度法进行测定。仪器简单、操作简便、快速。仪器简单、操作简便、快速。光的基本性质光的基本性质 光是一种电磁波。根据波长或频率排列，得光是一种电磁波。根据波长或频率排列，得到如表所示的电磁波谱表。到如表所示的电磁波谱表。不同类型的光不同类型的光 单色光（单色光（monochromatic light）：具同一波长的光。）：具同一波长的光。 复合光（复合光（multiplex light）：由不同波长组成的光。）：由不同波长组成的光。 紫外光（
3、紫外光（ultraviolet light）：波长）：波长200400 nm。 可见光（可见光（visible light）：人眼能感觉到的光，波长在）：人眼能感觉到的光，波长在400750 nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的。例混合而成的。 波段（波段（wave band）：各种色光的波长范围不同。）：各种色光的波长范围不同。 互补色光（互补色光（complementary color light）：按一定比例混合，）：按一定比例混合，得到白光（得到白光（white light）。）。吸收光谱产生的原理吸收
4、光谱产生的原理 吸收光谱包括原子吸收光谱吸收光谱包括原子吸收光谱(Atomic absorption spectrum)和分子吸收光谱和分子吸收光谱(Molecular absorption spectrum )。原子吸收光谱原子吸收光谱 由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电磁波而引起的，为线状光谱。磁波而引起的，为线状光谱。 由电子能级跃迁而产生吸收光谱由电子能级跃迁而产生吸收光谱能能量差在量差在120(eV)，是紫外及可见光谱。，是紫外及可见光谱。吸收光谱产生的原理吸收光谱产生的原理 分子吸收光谱比较复杂，呈带分子吸收光谱比较复杂，呈带状光谱，这是由
5、于分子结构的复杂状光谱，这是由于分子结构的复杂性所决定的。性所决定的。分子吸收光谱分子吸收光谱UV/Vis SpectrophotometryInfrared Spectrophotometry 由分子振动能级由分子振动能级(能量差约能量差约0.05l eV)和和转动能级转动能级(能量差小于能量差小于0.05 eV)的跃迁而产生的跃迁而产生的吸收光谱，为红外吸收光谱。用于分子结的吸收光谱，为红外吸收光谱。用于分子结构的研究。构的研究。 物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性 吸收作用而产生的。吸收作用而产生的。物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关
6、系完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意吸光度（absorbance）吸收光谱曲线（吸收光谱曲线（Absorption curve）以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。max最大吸收波长（最大吸收波长（maximum absorption wavelengh ）：光吸收程度最大处的波长。）：光吸收程度最大处的波长。紫色紫色KMnO4溶液对波长溶液对波长525 nm附近绿色光的吸收最强，而对紫附近绿色光的吸收最强，而对紫色和红色的吸收很弱。色和红色的吸收很弱。max=525 nm。浓度不同，吸收光谱曲线形状
7、相同，浓度不同，吸收光谱曲线形状相同， max不变，吸光度不同。不变，吸光度不同。2.1 光吸收的基本规律光吸收的基本规律朗伯朗伯-比尔定律（比尔定律（Lambert-Beer law）透光率透光率(透射比）透射比）T（Transmittance）吸光度吸光度A (Absorbance)A=lg(I0/It)=lg(1/T)=Kbc 当一束平行单色光通过均匀、非散射的透明吸光介质时，当一束平行单色光通过均匀、非散射的透明吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。 朗伯朗伯(Lambert J H)和比尔和比尔(Beer A)
8、分别于分别于1760和和1852年研究了光的吸收与溶液层的厚度及溶液浓度的定年研究了光的吸收与溶液层的厚度及溶液浓度的定量关系，二者结合称为朗伯量关系，二者结合称为朗伯-比尔定律，也称为光的吸收比尔定律，也称为光的吸收定律。定律。朗伯朗伯-比尔定律（比尔定律（Lambert-Beer law）朗伯朗伯-比尔定律（比尔定律（Lambert-Beer law） 朗伯朗伯-比尔定律是进行比尔定律是进行定量分析的理论基础定量分析的理论基础。比例常数比例常数K与吸光物质的性质、入射光波长及温与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。度等因素有关。 含有多种吸光物质的溶液，由于各吸光物质对含有多种吸光
9、物质的溶液，由于各吸光物质对某一波长的单色光均有吸收作用，若各吸光物质的某一波长的单色光均有吸收作用，若各吸光物质的吸光质点之间相互不发生化学反应，当某一波长的吸光质点之间相互不发生化学反应，当某一波长的单色光通过这样一种含有多种吸光物质的溶液时，单色光通过这样一种含有多种吸光物质的溶液时，溶液的溶液的总吸光度总吸光度应等于应等于各吸光物质的吸光度之和各吸光物质的吸光度之和。这一规律称吸光度的这一规律称吸光度的加和性加和性。朗伯朗伯-比尔定律的适用范围比尔定律的适用范围入射光为平行单色光且垂直照射入射光为平行单色光且垂直照射吸光物质为均匀非散射体系吸光物质为均匀非散射体系吸光质点之间无相互作用
10、吸光质点之间无相互作用辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象发生荧光和光化学现象发生吸光度吸光度A、透射比、透射比T与浓度与浓度c 的关系的关系摩尔吸收系数摩尔吸收系数(molar absorptivity) 当浓度当浓度c用用molL-1，液层厚度，液层厚度b用用cm为单为单位表示时，位表示时，K用另一符号用另一符号来表示。来表示。称为摩尔吸称为摩尔吸收系数，收系数，单位为单位为Lmol-lcm-1，它表示物质的量，它表示物质的量浓度为浓度为l molL-1，液层厚度为，液层厚度为l cm时溶液的吸光时溶液的吸光度。度。Abc桑德尔桑
11、德尔(Sandell)灵敏度灵敏度 桑德尔灵敏度桑德尔灵敏度S是指当仪器的检测极限是指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为的吸光物质的最低含量，其单位为gcm-2。S与与及吸光物质摩尔质量及吸光物质摩尔质量M的关系为：的关系为：MS2.1 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计光度计光度计的光学系统的光学系统光度计光度计的部件的部件 用用612 V钨丝灯钨丝灯作可见光区作可见光区的光源，发出的连续光谱在的光源，发出的连续光谱在360800 nm 范围内。要求电源电范围内。要求电源电压保持稳定，通常在仪器内同
12、时压保持稳定，通常在仪器内同时配有电源稳压器。配有电源稳压器。光源光源(light source) 单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。滤光片单色光的装置。滤光片(filter)、棱镜、棱镜(prism)和光栅和光栅(grating)。单色器单色器(monochromator)氘灯氘灯钨灯钨灯 也称吸收池。用于盛放试液的容器。可见光区测量也称吸收池。用于盛放试液的容器。可见光区测量用光学玻璃池。用光学玻璃池。紫外区测量时使用石英吸收池。紫外区测量时使用石英吸收池。 规格：规格：0.5 cm，l cm，2 cm，3 cm和和5 cm光度计
13、光度计的部件的部件比色皿比色皿(cuvette) 接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。光电管测量。光电管(phototube)和光电倍和光电倍(photomultiplier)。检测器检测器( detector) 把放大的信号以吸光度把放大的信号以吸光度A A或透射比或透射比T T的方式显示的方式显示或记录下来。或记录下来。显示装置显示装置 2.1 光度分析法的设计光度分析法的设计0.575I0ItbCTIIAt lglg0未考虑吸收池和溶剂对光子的作用未考虑吸收池和溶剂对光子的作用紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法显色反应显色反应 待
14、测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成的试剂与被测离子反应生成有色化合物有色化合物再进行测再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂（剂（color reagent）。）。待测物质本身有较深的颜色，可以直接测定。待测物质本身有较深的颜色，可以直接测定。络合反应是显色的最主要方法络合反应是显色的最主要方法显色反应显色反应的选择的选择选择性好，干扰少，或干扰容易消除；灵敏度高，有选择性好，干扰少，或干扰容易消除；灵敏度高，有 色物质的色物质的应大于应大于104。有色化合物的组成恒定，符合
15、一定的化学式。有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。有色化合物的化学性质稳定，至少保证在测量过程中有色化合物的化学性质稳定，至少保证在测量过程中 溶液的吸光度基本恒定。这就要求有色化合物不容易溶液的吸光度基本恒定。这就要求有色化合物不容易 受外界环境条件的影响。受外界环境条件的影响。有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显色剂有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显色剂 对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的 吸收峰波长之差吸收峰波长之差(称为对比度称为对比度)大于大于60 nm。显色显色剂剂 有机显色剂种类繁多。如，磺基水杨酸可有机
16、显色剂种类繁多。如，磺基水杨酸可与很多高价金属离子生成稳定的有色螯合物，与很多高价金属离子生成稳定的有色螯合物，主要用于测主要用于测Fe3+，1，10-邻二氮菲可用于测微邻二氮菲可用于测微量量Fe2+。常用的还有二苯硫腙。常用的还有二苯硫腙 ，偶氮胂，偶氮胂(铀铀试剂试剂)，铬天青，铬天青S ，结晶紫等。，结晶紫等。 无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高。如用定，灵敏度和选择性也不高。如用KSCN显色显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒；用钒；用H2O2显色测钛等。显色测钛等。可根据需
17、要进行选择可根据需要进行选择显色显色条件的确定条件的确定溶液酸度溶液酸度 溶液酸度影响显色剂的平衡浓度、颜溶液酸度影响显色剂的平衡浓度、颜色、被测金属离子的存在状态和络合物的色、被测金属离子的存在状态和络合物的组成。组成。 作作pH与吸光度关系曲线确定与吸光度关系曲线确定pH范围范围显色剂用量显色剂用量根据实验结果来确定显色剂的用量根据实验结果来确定显色剂的用量显色时间、温度和试剂等显色时间、温度和试剂等干扰及其消除方法干扰及其消除方法 干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。试样中存在
18、干扰物质会影响被测组分的测定。试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。 干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。量条件下也有吸收，造成正干扰。 干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全。便显色反应不完全。干扰及其消除方法干扰及其消除方法控制反应条件。控制反应条件。加入掩蔽剂。选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作加入掩蔽剂。选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作 用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的络合物的颜色用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的络合物的颜色 应不干扰待测离子的测定。应不干扰待测离
19、子的测定。用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。选择适当的波长。选择适当的波长。当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增 加显色剂的用量来消除干扰。加显色剂的用量来消除干扰。分离。以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法分离。以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法常用的消除干扰的方法有以下几种。常用的消除干扰的方法有以下几种。测量波长的选择测量波长的选择 为了使测定结果有较高的灵敏度，应为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射
20、光，这称为射光，这称为“最大吸收原则最大吸收原则”。在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时，在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时， 则应根据实际需要选择波长。则应根据实际需要选择波长。 丁二酮肟光度法测钢镍，络丁二酮肟光度法测钢镍，络合物丁二酮肟镍的合物丁二酮肟镍的最大吸收波长最大吸收波长为为470 nm，但试样中的铁用酒石，但试样中的铁用酒石酸钠掩蔽后，在酸钠掩蔽后，在470 nm处也有一处也有一定吸收。为避免铁的干扰，可以定吸收。为避免铁的干扰，可以选择波长选择波长 520 nm进行测定进行测定。例例 从仪器测量误差的角度来看，为使测从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准
21、确度，一般应控制标量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在准溶液和被测试液的吸光度在0.20.8范范围内。围内。吸光度范围的选择吸光度范围的选择 可通过控制溶液的浓度或选择不同厚可通过控制溶液的浓度或选择不同厚 度的吸收池来实现。度的吸收池来实现。试液及显色剂均无色，用蒸馏水作参比溶液。试液及显色剂均无色，用蒸馏水作参比溶液。显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离 子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂 空白作参比溶液。空
22、白作参比溶液。参比溶液参比溶液 采用采用几何尺寸及材料完全相同几何尺寸及材料完全相同的比色皿，的比色皿，并并以参比溶液来调节仪器的零点以参比溶液来调节仪器的零点，可消除由，可消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差。的误差。参比溶液选择原则参比溶液选择原则标准曲线的制作标准曲线的制作0Ac 分别测量一系列不同分别测量一系列不同含量的标准溶液的吸光度，含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准过原点的直线，称为标准
23、曲线曲线。 测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上就可测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上就可以查到与之相对应的被测物质的含量。以查到与之相对应的被测物质的含量。在选择的实验条件下在选择的实验条件下2.1 光度分析法的误差光度分析法的误差朗伯朗伯-比尔定律的偏离比尔定律的偏离 在吸光光度分析中，经常出现标在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光特别是当吸光物质浓度较高时物质浓度较高时，明显地看到通过原点，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象向浓度轴弯曲的现象( (吸光度轴弯曲吸光度轴弯曲) )。这种情况称为这种情况称为偏离朗伯偏离朗伯- -比尔定律比尔定律
24、。 若在曲线弯曲部分进行定量，若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。将会引起较大的误差。 由于仪器或溶液的实际条件与朗伯由于仪器或溶液的实际条件与朗伯- -比比尔定律所要求的理想条件不一致引起的。尔定律所要求的理想条件不一致引起的。 朗伯朗伯-比尔定律的偏离比尔定律的偏离非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离单色器色散能力的限制和出口单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，目前各狭缝需要保持一定的宽度，目前各种分光光度计得到的入射光实际上种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光。都是具有某一波段的复合光。选择性能好的单色器选择性能好的单色器在被测物质的最大吸收处测
25、定在被测物质的最大吸收处测定选择适当的浓度范围选择适当的浓度范围介质不均匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离朗伯朗伯-比尔定律的偏离比尔定律的偏离被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸浮液时，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因收外，还有一部分因散射现象而损失散射现象而损失，使透射比，使透射比减少，因而实测吸光度增加，便标准曲线偏离直减少，因而实测吸光度增加，便标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。线向吸光度轴弯曲。光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。朗伯朗伯-比尔定律的偏离比
26、尔定律的偏离溶液本身的化学反应引起的偏离溶液本身的化学反应引起的偏离溶液中的吸光物质因解离、缔合、形成新溶液中的吸光物质因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯因而导致偏离朗伯比尔定律。比尔定律。要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在吸光度测量的误差吸光度测量的误差在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。的主要来源。使待测溶液的透射比使待测溶液的透射比T在在15%65%之间，或之间，或吸光度吸光度A在在0.20.8之间，才
27、能保证测量的相对误差之间，才能保证测量的相对误差较小。较小。由于溶液本身的化学反应引起的偏离由于溶液本身的化学反应引起的偏离A 解离解离 大部分有机酸碱的酸式、碱大部分有机酸碱的酸式、碱式对光有不同的吸收性质，溶液的式对光有不同的吸收性质，溶液的酸度不同，酸酸度不同，酸( (碱碱) )解离程度不同，解离程度不同，导致酸式与碱式的比例改变，使溶导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸光度发生改变。液的吸光度发生改变。B B 络合络合 显色剂与金属离子生成的是显色剂与金属离子生成的是多级络合物，且各级络合物对光的多级络合物，且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在吸收性质不同，例如在Fe()Fe()与与SCNSCN- -的络合物中，的络合物中，Fe(SCN)Fe(SCN)3 3颜色最颜色最深，深，Fe(SCN)Fe(SCN)2+2+颜色最浅，故颜色最浅，故SCNSCN- -浓浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。越大。c c 缔合缔合 例如在酸性条件下，例如在酸性条件下，CrOCrO4 42-2-会缔合生成会缔合生成CrCr2 2O O7 72-2-，而它们，而它们对光的吸收有很大的不同。对光的吸收有很大的不同。
