1、病毒增殖技术病毒增殖技术 动物增殖病毒技术动物增殖病毒技术禽胚增殖病毒技术禽胚增殖病毒技术细胞增殖病毒技术细胞增殖病毒技术一、动物增殖病毒技术一、动物增殖病毒技术 选择动物的标准：选择动物的标准：大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、青壮年和健康(经临床检查、检疫)；对相应病毒易感，并十分敏感；经隔离饲养和观察检查证明健康；家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准；体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。 二、禽胚增殖病毒技术二、禽胚增殖病毒技术（一）禽胚的选择（一）禽胚的选择 SPF鸡胚鸡胚 据国
2、家标准，无据国家标准，无22种特定病原体种特定病原体 非免疫鸡胚非免疫鸡胚 应无特定病原的母源抗体，应无特定病原的母源抗体， 普通鸡胚普通鸡胚 可能带有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产可能带有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产 异源性性疫苗：鸭胚和鸽胚异源性性疫苗：鸭胚和鸽胚（二）禽胚接种途径与收获（二）禽胚接种途径与收获 绒毛尿囊膜接种法 尿囊腔接种法 卵黄囊接种法 羊膜腔接种法 静脉接种法 脑内接种法鸡胚绒毛尿囊膜接种法鸡胚绒毛尿囊膜接种法 尿囊腔接尿囊腔接种法种法 尿囊液收获方法尿囊液收获方法 鸡鸡胚卵黄囊接种法胚卵黄囊接种法1种蛋质量种蛋质量病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病
3、毒、支原体及传染性贫血因子等。母源抗体：抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体 2孵化技术孵化技术温度：3739.5。传染性支气管炎病毒37 湿度：鸡胚5357，水禽胚比鸡胚高510。通风：氧气，二氧化碳。 翻蛋：（三）影响禽胚增殖病毒的因素（三）影响禽胚增殖病毒的因素3接种技术接种技术 不同病毒的增殖有不同的接种途径， 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。接种日龄：鸡胚1314日龄。鸭胚1516日龄，尿囊液含 量最高，平均约68ml，羊水约12ml。接种部位：不应伤及胚体和血管，以免影响其发育严格防止禽胚污染 鸡胚接种时严格无菌操作； 定期清扫消毒孵化室，保持室内空气新鲜； 种蛋入孵前先
4、用温水清洗，消毒，凉干。三、细胞增殖病毒技术三、细胞增殖病毒技术 1细胞培养的概念细胞培养的概念 细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养。细胞分类细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 原代细胞(primary cell) 细胞株(cell strain) 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line)（1）原代细胞）原代细胞(primary cell) 指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。细胞。（2）细胞株）细胞株(cel
5、l strain) 又称二倍体细胞又称二倍体细胞 指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很多代多代(50100代代)，但为有限生命；没有肿瘤原。如，但为有限生命；没有肿瘤原。如PKl5、BHK21和和Vero （3）传代细胞（）传代细胞（continued cell line） 细胞系细胞系(cell line) 能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性均能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性均类似于恶
6、性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如HeLa细胞系细胞系 静置培养静置培养 转瓶培养转瓶培养悬浮培养悬浮培养(suspension cell culture ) 微载体培养微载体培养(microcarrier cell culture) 中空纤维细胞培养中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) 微囊化细胞培养微囊化细胞培养2细胞培养方法细胞培养方法悬浮培养悬浮培养 通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。 微载体培养微载体培养微载体直
7、径应为60105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞吸附在表面，如DEAESephadexA-50、Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3等。微载体培养的容器为特制的生物反应器，有自动化装置。细胞产量达106107个/m1，每升培养液可加微载体25g，每克有80009000个珠子，培养面积约为25万cm2，比常规培养面积大1025倍。 中空纤维细胞培养中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) 组成组成:中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵中空
8、纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯丙烯复合物或多聚碳酸硅中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯丙烯复合物或多聚碳酸硅等材料制成，外径等材料制成，外径50100m，壁厚，壁厚2575m，壁呈海绵状，壁呈海绵状，上面有很多微孔。上面有很多微孔。中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有滞留作用。滞留作用。培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持
9、高度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度可达可达6090；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。 培养液培养液血清血清细胞接种量细胞接种量pH温度温度无菌条件无菌条件培养器皿清洁度培养器皿清洁度3. 细胞培养要素细胞培养要素RPMI-1640、199、DMEM、F12 血清血清成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。-珠蛋珠蛋白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、a2-球蛋
10、白和球蛋白和脂蛋白脂蛋白G2能促进细胞贴壁。能促进细胞贴壁。血清选择：同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于血清选择：同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56灭活灭活30min，并进行细胞毒性试验。生长液血清含量一般为，并进行细胞毒性试验。生长液血清含量一般为520。维持液中血清量为。维持液中血清量为0%5。血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、上皮生长因血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、上皮生长因子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴
11、壁因子（如鱼精蛋白、子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白、聚赖氨酸）和微量元素（如硒）四类几十种，多数无血清聚赖氨酸）和微量元素（如硒）四类几十种，多数无血清培养液须补加培养液须补加38种血清替代因子。种血清替代因子。细胞接种量细胞接种量 细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，这些物质分泌量少，而作用也小。这些物质分泌量少，而作用也小。接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多对细胞生长也不利。对细胞生长也不利。鸡胚成纤维细胞为鸡胚成纤维细胞为1
12、00万万m1小鼠或地鼠肾细胞为小鼠或地鼠肾细胞为50万万m1猴肾细胞量为猴肾细胞量为30万万ml传代细胞为传代细胞为1030万万m1(1) 细菌污染细菌污染(2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。真菌污染：念珠菌或酵母菌。 培养液中可见黄白色小点状悬浮物培养液中可见黄白色小点状悬浮物 镜检时可见菌丝结构。镜检时可见菌丝结构。 (3) 支原体污染：污染率为支原体污染：污染率为5060(4) 病毒污染病毒污染 组织带毒组织带毒 培养液带毒培养液带毒4细胞培养污染问题细胞培养污染问题（1）血清）血清 ：维持液内犊牛血清含量一般不超过：维持液内犊牛血清含量一般不超过2。（2）温度：）温度：狂犬病病毒狂犬病病
13、毒32，犬疱疹病毒，犬疱疹病毒36。（3）pH：（4）病毒接种剂量：）病毒接种剂量：应以应以TCID50为依据为依据 一般按维持液的一般按维持液的110(VV)量接入。量接入。 接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价；接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价； 接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接种方法：病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。异步接毒和同步接毒。5. 细胞培养病毒要素细胞培养病毒要素6. 病毒增殖指标与收获病毒增殖指标与收获细胞病变细胞病变(CPE)：细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；细胞聚合，如腺病毒；细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；轻微病变，如正粘病毒、冠状病毒等。包涵体和血凝性：包涵体和血凝性：也可作为检查病毒增殖的指标。 有些病毒不产生CPE。病毒收获病毒收获：CPE达80时收获，反复冻融多次使病毒释放， 然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20保存。病毒毒价病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA疫苗制造工艺流程疫苗制造工艺流程病毒性细胞疫苗制造工艺流程病毒性细胞疫苗制造工艺流程 病毒性组织疫苗制造工艺流程病毒性组织疫苗制造工艺流程细菌疫苗和类毒素制造工艺流程细菌疫苗和类毒素制造工艺流程 寄生虫疫苗制备的工艺流程寄生虫疫苗制备的工艺流程
