1、荧光定量荧光定量PCR技术在技术在临床检测中的应用临床检测中的应用中山大学 中山医学院生物化学教研室 达安基因股份有限公司首席科学家朱振宇 医学博士、教授、博士生导师Tel：13922430138，02037656430九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测PCR 发展简史发展简史PCR (Polymerase Chain Reaction)1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成功实验发明了PCR1985 关于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人 在Science上 发 表1989
2、 12月Science杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry 1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术 循环次数循环次数 DNA的链数的链数 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿亿 PCR循环次数与循环次数与DNA产量关系产量关系PCR循环PCR特点：高效扩增、忠实复制特点：高效扩增、忠实复制 灵敏度高灵敏度高 快捷快捷 简便简便 对样品纯度要求低
3、对样品纯度要求低 可以相对定量可以相对定量PCR反应的特点Ct值的意义Ct值与重复性值与重复性同一样本在相同条件下同时进行同一样本在相同条件下同时进行96次次扩增扩增FQ-PCRCt值与浓度值与浓度不同的模板达到荧光域值时的不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同值不同荧光定量荧光定量PCR的临床应用的临床应用一 感染性疾病 1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的监控、预测与预防临床应用临床应用二 肿瘤1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等2.
4、肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因三 遗传病1. 等位基因检测2. 多基因遗传病的突变检测3. 基因表达异常所致遗传病检测荧光定量PCR在病原体检测中的应用一 肝炎病毒定量检测二 性病病原体检测三 结核杆菌及呼吸道病原体检测四 优生优育(TORCH)相关项目检测临床应用1 肝炎病毒定量检测HBVHCV临床应用（一） 乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBe
5、Ab：有一定的保护作用，预后良好HBVHBV（二） HBV-DNA与“两对半”3. 血清学指标()不能排除HBV感染。 HBV（二） HBV-DNA与“两对半”HBsAg()HBV-DNA() HBeAg ()HBV-DNA()103 copyHBV(三)HBV-DNA定量检测的临床意义3. HBV-DNA定量与预后 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌变的几率明显高于含量低者 1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效 a. 专家提出103 copy /ml做为阴性或临床治愈标准 b. HBV-DNA定量分析与干扰素干扰素治疗(前、中、后)
6、 c. 拉咪呋拉咪呋啶啶HBV感染与干扰素治疗治疗前： a: 治疗前HBV低水平复制者对干扰素的反应性明 显优于高水平复制者。 b: 治疗前HBV DNA 含量特别高者大多没有疗效。 c: HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV DNA 含量较低者。HBV感染与干扰素治疗治疗中：病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。 相反，治疗期间HBV DNA复制水平下降较慢， 或下降幅度较小，或者变化不明显者，大多是 干扰素治疗无效。HBV感染与干扰素治疗治疗后： a: 治疗结束后，采用PCR定量法检测，HBV DNA 103 copy/ml 者，可能不再复发。 b: 终止治疗后HBV DNA 仍保持较
7、低水平者， 反跳的可能性较大。ALTMonths after Start of Therapy0Normal Alt治疗前治疗前1234561224HBV DNAHBe AgHBs Ag拉咪呋拉咪呋啶：啶： 有显著降低高病毒载量作用，近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV变异，患者易出现耐受性，而且容易出现停药后反弹。HBV感染与拉咪呋拉咪呋啶啶治疗0 -20 -40 -60 -80 -100治疗周数拉米夫定安慰剂血清HBV DNA; 中位%变化0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52n=192 n=404n=171 n=359HBV(三)HBV-DNA
8、定量检测的临床意义4. HBV-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查5. 肝脏移植与HBV-DNAMazzaferro等报告：105copy /ml 发生了严重HBV再感染6. 血液制品和献血员的筛选病毒特点： 1. 单正链RNA病毒 2. E1和E2区基因高度变异性（一）丙型肝炎病毒特点HCV感染特点：1. HCV在血中含量极微 2. 输血后肝炎主要致病因子3. 免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一4. 有一部分人感染HCV后，不产生抗-HCV 5. 感染易于慢性化(50-85%)6. 疫苗研制尚不成功单链RNA(二)HCV-RNA定量检测的临床意义 1. 早期诊断 a.
9、 临床以 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。 b. HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。 c. 严格筛选献血员 ,提高对窗口期感染者的检出率。 d. 医疗纠纷中的“举证倒置”，病人入院前后进行HCV-RNA检测。 HCVHCV(二)HCV-RNA定量检测的临床意义2. HCV-RNA载量与抗-HCV滴度、ALT水平之间的相关性。抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。3. HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。4. 慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这时如果进行HCV-RNA 定量检测可以鉴别活动性、复制程度。二常见性传播疾病病原体一淋球菌（N
10、GH）二沙眼衣原体（ CT ）三解脲脲原体（UU）四梅毒螺旋体（TP）五单纯庖疹病毒（HSV）六乳头瘤病毒（HPV）七人类免疫缺陷病毒（HIV）八 EV71 A16 通用型STD艾滋病艾滋病 艾滋病是英文艾滋病是英文AIDS（Acquired Immunity Deficiency Syndrome) 的中文译音，全称是的中文译音，全称是“获得性免疫缺陷综合获得性免疫缺陷综合征征”。它可以由人类免疫缺陷病毒（。它可以由人类免疫缺陷病毒（HIV,Human-being Immunity Deficiency Virus ），又称艾滋病病毒引起的），又称艾滋病病毒引起的疾病。当病毒侵入人体后，经一
11、段时间的潜伏期，破坏人疾病。当病毒侵入人体后，经一段时间的潜伏期，破坏人体的免疫力，从而发病，病死率高，是一种严重的传染病。体的免疫力，从而发病，病死率高，是一种严重的传染病。 艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定传播途径传播的慢性传染病，属于传播途径传播的慢性传染病，属于传染病防治传染病防治法法中规定的乙类传染病中规定的乙类传染病HIV病毒：多亚型和多变异HIV-1和和HIV-2M组、组、O组和组和N组组亚性型：亚性型：A-KCRF：基因重组亚型，主要是：基因重组亚型，主要是HIV-1型型毒株亚型监测的意义毒株亚型监测的意义 不同亚型与不同传播
12、途径的关系：不同亚型与不同传播途径的关系：B主要通过男性同性性主要通过男性同性性行为和静脉注射吸毒传播，行为和静脉注射吸毒传播，C主要异性性接触传播主要异性性接触传播 流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的C亚型和亚型和B亚亚型型 重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的B/A重组重组流行、泰国的流行、泰国的A/E重组重组艾滋病病毒在外界的抵抗力HIV病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很快消失很快消失HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，对环境中的物理因素和
13、化学因素抵抗力均较弱，比乙型肝炎病毒（比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多）的抵抗力低得多对对HBV有效得消毒和灭活方法均适用于有效得消毒和灭活方法均适用于HIV典型进展者：典型进展者：8-10年潜伏期后成为艾滋病人，年潜伏期后成为艾滋病人，80% -90%快速进展者：快速进展者：CD4细胞细胞2-5年内迅速下降，年内迅速下降，HIV病毒病毒载量一直维持较高水平，而且分离的载量一直维持较高水平，而且分离的HIV有均一有均一性。性。长期存活者（又称长期不进展者）：维持长期存活者（又称长期不进展者）：维持15年以上，年以上，而且而且CD4计数维持正常，在所有感染者中比例一计数维持正常，在所有感染
14、者中比例一般在般在8%-10%。HIV感染的三种结局感染的三种结局艾滋病的诊断艾滋病的诊断HIV感染者：确定感染者：确定HIV感染的个体感染的个体 抗体检测：初筛和确认抗体检测：初筛和确认 辅助诊断辅助诊断艾滋病病人：临床诊断标准见国家标准艾滋病病人：临床诊断标准见国家标准HIV/AIDS的的诊断标准和防治原则诊断标准和防治原则 GB16000-1995荧光定量PCR的应用为艾滋病的初筛和辅助检查提供了有力的工具NGH淋球菌感染与致病1. 人是淋球菌的惟一宿主。2. 2. 发病率最高，在所发病率最高，在所STDSTD疾病中，高达疾病中，高达60%60%左右。左右。3. 发病趋势： a. 男性多
15、于女性。 b. 城市走向农村， c. 高收入阶层向低收入阶层扩展4. 4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。久，再感染和慢性患者普遍存在。5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎CT沙眼衣原体感染与致病1. 严格的细胞内寄生。2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原体。3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害 性已超过淋球菌而居STD之首。4. 在我国，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。在我国，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。5. 泌尿生殖道感染，妨碍妊娠。6. 盆腔感染，可致生殖能力损害。
16、UU解脲脲原体感染与致病1. 合成尿素酶，分解尿素2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率仅次于衣原 体感染，居第二位。3. 流产超过4次以上者，检出率高达80%。4. 有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。5. 与男性不育相关。男性不育患者精液中，脲原体检出率高达66.6。检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高。1. 非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。2. 对无症状或症状轻者，可以早期确诊。3. 对NGH、CT、UU 等混合感染者，诊断和鉴别诊断。4. 指导用药、考核疗效。 荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义NGH/CT/UUNGH/CT/UU荧光定量PCR诊断NGH/C
17、T/UU的意义人乳头瘤病毒感染与致病1. HPV具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是HPV的惟一宿主。2. 有100多个型。3. 低危型：HPV 6、11引起良性病变 (尖锐湿疣、喉乳头瘤等)HPV人乳头瘤病毒感染与致病HPVHPV1. 对典型病例可以明确诊断。2. 对临床表现和组织病理改变都不典型的病例同样可以做出诊断。3. 对亚临床和隐性HPV感染做出诊断。4. 基因分型。5. 考核疗效与预后。6. 病毒载量与患癌症风险。HPV荧光定量PCR检测HPV的意义HPV手足口病（手足口病（hand-foot-mouth diseasehand-foot-mouth dise
18、ase，HFMDHFMD）为全球性传染病，世界大部分地区均有流行的报道。为全球性传染病，世界大部分地区均有流行的报道。 19571957年在加拿大首次报告，新西兰年在加拿大首次报告，新西兰SeddonSeddon于于19571957年最早加年最早加以描述，以描述，19581958年加拿大年加拿大RobinsonRobinson从患者粪便和咽拭中分离从患者粪便和咽拭中分离出出CoxA16CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长，同时患者血清抗体有四倍增长, ,初步查明初步查明CoxA16CoxA16为本病病原；为本病病原； 19591959年提出年提出HFMDHFMD命名，命名，HFMDHFMD
19、在全球广泛流行，无明显的地在全球广泛流行，无明显的地域分布。域分布。 之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV EV 7171引起的手足口病流行。引起的手足口病流行。发热发热, , 不适不适, , 咽喉肿痛咽喉肿痛, , 口腔、手、脚侧面及掌口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡心、屁股出现小泡传染性极高传染性极高病程约病程约1 1周周HFMDHFMD的的病原病原u 手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括 CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯萨以及部分埃可病毒和柯
20、萨 奇奇B组病毒组病毒, 以以CoxA16 和和 EV71最为常见最为常见 u 传播途径传播途径: 粪粪-口途径传播口途径传播: 唾液与粪便唾液与粪便; 呼吸道传播呼吸道传播: 空气飞沫空气飞沫; 接触接触传播传播u 疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。u HFMD为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布, 但但 近年近年EV71在东南亚一带流行在东南亚一带流行, 引起较多的重症和死亡病例。引起较多的重症和死亡病例。u 在在80年代和年代和90年代，中国手足口病的流行主要以年代，中国手足口病的流
21、行主要以 CoxA16为主，为主，2008年，年，CoxA16 和和EV71 共循环引起手共循环引起手 足口病爆发足口病爆发, EV71在大部分省市为优势病毒。在大部分省市为优势病毒。 致病特点致病特点隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。免疫力低下的成人易感。 病毒在机体肠道中增殖病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。状，是以消化道为原发灶的全身感染。不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现。人肠道病毒可引起不同临床表现。感染过程中
22、形成病毒血症。感染过程中形成病毒血症。中国中国HFMD的流行的流行1981年，我国在上海首次报道了HFMD病例1987年在中国分离到CVA161995年以来，我国陆续在武汉、深圳、上海、重庆、山东和安徽等地的HFMD患者中分离到EV71病毒。2007年，山东发生了手足口病爆发流行，累计报告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡。实验室检测发现EV71是引起山东临沂HFMD的主要病原，同时还检测到Echo3 和/或 CVA16。2008年全国出现HFMD爆发流行,以HEV71为优势,CVA16还有其它EV共循环引起加强加强HFMDHFMD病原检测和监测的十分必要病原检测和监测的十分必要依
23、据台湾依据台湾1998-20081998-2008和中国大陆和中国大陆2007-20082007-2008年的经验年的经验 掌握手足口病病原谱，特别是掌握手足口病病原谱，特别是EV71EV71感染所占的比例，对析感染所占的比例，对析 判断判断HFMDHFMD疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值。疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值。手足口病的实验室检测手足口病的实验室检测 手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定，如果
24、没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检定，如果没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检测。测。 很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。行株也不同。 通常用于肠道病毒分离的细胞系为通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD、HEp-2、Vero等，等，联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒。病毒。检测抗体检测抗体/ /抗原抗原检测病毒检测病毒检测核酸检测核酸EL
25、ISA/HI/PAELISA/HI/PA蛋白印迹蛋白印迹病毒分离病毒分离ELISAELISA电镜电镜中和试验中和试验RT-PCRRT-PCR实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR套式套式PCRPCRLAMPLAMP免疫荧光免疫荧光基因芯片基因芯片New molecular tools for epidemiologystudies and diagnosis三结核杆菌与呼吸道病原体检测 TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia MP：Mycoplasmal pneumonia SARS：severe acute respiratory syndrome
26、 H1N1甲型流感 呼吸道合胞病毒结核杆菌流行现状（1）l罗伯特科赫（），德国细菌学家，结核杆菌发现者 l结核病是一个全球性的问题，近年来在世界范围内出现流行，且呈增长的趋势 TB结核杆菌流行现状（2） 我国结核病的疫情仅次于印度而居世界第二位 2000年，全国人口结核感染率为44.5%，其中1544岁人群占了53 ，每年约有25万人死于结核病 结核杆菌引起的感染l肺部感染：原发性肺结核，开放性肺结核。l肺外感染：脑、肾、骨、关节、生殖结核、肠结核、结核性腹膜炎、全身性结核。常规结核病实验室诊断方法及不足1. 痰涂片作抗酸染色：阳性率低 、费时2. 细胞培养“金标准”：周期太长(3-4W)3.
27、 血清学诊断： a. 接种BCG可出现阳性 b. 不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人 c. 交叉反应，假阳性不能早期诊断！容易漏诊、误诊！TB荧光定量PCR检测TB-DNA的意义1. 能稳定检测10copy的TB-DNA ，灵敏度高 ，特异性强2. 早期、快速、准确地诊断结核病。 痰液、肺及支气管灌洗液肺结核 血液播散性结核和各脏器的结核病 脑脊液中枢神经系统结核病 宫颈拭子、尿道拭子泌尿生殖道结核病TB3. 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。 4. TB-DNA浓度可用于判断疗效： 痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 ，TB-DNA拷贝数下降
28、。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据 TB荧光定量PCR检测TB-DNA的意义n CP、MP感染可致咽炎、支气管炎和肺炎，潜伏期约2-3周，通常起病较缓慢。持续性咳嗽。 肺炎衣原体(CP)、肺炎支原体(MP)感染与致病CP/MP荧光定量PCR用于非典型性肺炎的诊断意义：1. 直接检测病原体，早期、快速、特异诊断非典 型性肺炎。 2. 治疗方案与细菌、病毒感染的治疗方案不同 3. 流行病学调查。 TB、MP、CP已被许多医院尤其是妇幼保健医院和儿童医院纳为肺部感染的常规检测项目 MP/CP/SARS甲型H1N1流感 流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三种流感病毒引起的急性呼吸
29、道传染病。甲型流感病毒根据其表面(H和N)结构及其基因特性的不同又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶9个亚型(N1-N9)。 “猪流感猪流感”更名为更名为“甲型甲型H1N1流感流感”世界卫生组织4月30日宣布，从当日起，该组织不再使用“猪流感”一词指代当前疫情，而开始使用“A（H1N1）型流感”一词。与之相对应，我国的官方文件从5月1日起相继用“甲型H1N1流感”代替原来的“人感染猪流感”。世界卫生组织发言人说，之所以更改叫法，是因为“猪流感”一词容易误导消费者，美国和墨西哥等国的猪肉及猪肉制品已明显受到其他国家进口禁令影响。世界卫生组织的声
30、明说，根据目前掌握的科学依据，此次流行的病毒仅在人际间传播，尚无证据表明它在猪群内传播，或由猪向人传播，也无证据表明人因食用猪肉或相关产品染病。病 原 学 甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科，典型病毒颗粒呈球状，直径为80 nm120 nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA 和M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳, 呈螺旋状对称, 直径为10nm。甲型H1N1流感病毒为单股负链RNA 病毒，基因组约为13.6 kb，由大小不等的8 个独立片段组成。 流行病病学特点传染源传染源 主要为病猪和携带病毒的猪，感染猪流感病毒的人也被证实可以传播病毒。感染这种病毒的动
31、物均可传播。传播途径传播途径 主要为呼吸道传播，也可通过接触感染的猪或其粪便、周围污染的环境或气溶胶等途径传播。某些毒株如H1N1可在人与人之间传播，其传染途径与流感类似，通常是通过感染者咳嗽或打喷嚏等。易感人群易感人群 普遍易感。患者多数年龄在25岁至45岁之间，目前报道以青壮年为主，应注意老人和儿童。临床表现潜伏期一般1至7天左右，较流感、禽流感潜伏期长。 人感染甲型H1N1流感后的早期症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。 部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、突然高热、体温超过39，甚至继发严重肺炎、急性
32、呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及Reye综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡。实验室检查1.外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；2.血清学诊断：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等；3.反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）：由于PCR技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，已用于猪流感病毒基因的检测和分子流行病学调查等； 4 病毒分离：从患者呼吸道标本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管吸出物、痰或肺组织）分离甲型H1N1流感病毒。常用的方法有鸡胚接种法和细胞培养法。现有的诊断
33、方法中，病毒分离法是较敏感的，但需要2-3周时间。人感染猪流感的诊断标准1. 医学观察病例：曾到过甲型H1N1流感疫区，或与病猪及甲型H1N1流感患者有密切接触史，1周内出现流感临床表现者。列为医学观察病例者，对其进行7天医学观察（根据病情可以居家或医院隔离）。2 疑似病例：曾到过疫区，或与病猪及甲型H1N1流感患者有密切接触史（也可流行病学史不详），1周内出现流感临床表现，呼吸道分泌物、咽试子、痰液、血清H亚型病毒抗体阳性或核酸检测阳性。3.临床诊断病例：被诊断为疑似病例，且与其有共同暴露史的人被诊断为确诊病例者。4.确诊病例：从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒；RT-PCR对上述标本检测，
34、有甲型H1N1病毒RNA存在，经过测序证实，或两次血清抗体滴度4倍升高，可确诊为人感染甲型H1N1流感。四TORCH感染特点与检测TOX : ToxoplasmagondiiRV: Rubellavirus CMV: HumancytomegalovirusHSV: HerpessimplexvirusTORCHTORCH感染特点 1. 母-胎传播的主要病原体 2. 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因3. 自然状态下呈隐性感染4. 怀孕、多次输血、AIDS等易发生显性感染 5. 可致多发性、全身性感染6. 只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防 TORCH(一) 弓形虫感染与致病l 滋养体如弓
35、形 ，广泛分布，人兽共患。l 寄生在有核细胞中，猫和猫科动物是终宿主l 易感者多，免疫者少 l 我国智力低下儿的弓形虫感染率28 畸形儿的弓形虫抗体IgM阳性率12.25 l 艾滋病患者约有2080合并弓形虫感染 ，造成艾滋病死亡的一个重要并发病 TORCH TOXl 人群自然感染率达到60-90%，多为隐性感染l 免疫功能低下(怀孕、多次输血、器官移植、AIDS)发生显性感染l 可发生垂直传播，是宫内感染和胎儿畸形的主要病毒之一l 围生期感染l 血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可检出病毒(二) 人巨细胞病毒感染与致病TORCH-CMVl 风疹是一种世界性的病毒传染病， 是造成畸胎及先天性疾病的
36、病毒之一 l 出疹前1周至出疹后5天均有传染性l 人是风疹病毒的唯一宿主 l 风疹感染后可获得持久的免疫力，临床显性再感染并不多见。(三) 人风疹病毒感染与致病TORCH-RVl 先天性风疹感染往往发生在母体初次感染之时，可致先天性风疹综合症(CRS) 三联症：白内障、耳聋、心脏病。 l 妊娠时体内皮质类固醇激素的增加以及细胞免疫功能的减弱，这种对正常人无害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影响胎儿。 TORCH-RV(三) 人风疹病毒感染与致病l HSV原发感染多为隐性，大多无临床症状或呈亚临床表现 l HSV-1主要引起口唇疱疹，疱疹性结膜炎、脑炎，皮肤性疱疹l HSV-2主要引起原发性生殖器
37、疱疹 (80%) 。l HSV感染后大多数个体不能彻底消灭病毒，也不能阻止复发，病毒以潜伏状态长期存在宿主体内。TORCH-HSV(四) 人单纯疱疹病毒感染与致病l 妊娠期妇女因HSV-1被激活，可通过胎盘感染胎儿，引起胎儿畸形、智力低下、流产等。l 围产期感染可引发新生儿疱疹，死亡率高达50%以上。 l HSV常与HIV-1同时感染，并能促进病情发展，引起严重的局部和播散性感染。目前认为HSV是一种调节因素，能激活HIV复制 l 与宫颈癌关系密切。TORCH-HSV(四) 人单纯疱疹病毒感染与致病常规TORCH检测方法与不足l 组织培养或病原体分离：慢，费力，阳性率低。l 血清学诊断： Ig
38、G： 人群自然感染率高达60-90%。 IgG()不能区别既住感染与现症感染；新生儿IgG()不能说明有感染。 IgM： IgM()可能是原发性感染； IgM()不能排除感染。TORCH 荧光探针检测TORCH的优势原理：直接检测TORCH病原体的核酸优点：灵敏、快速，特异 意义：早期诊断，妇幼保健、优生优育1. 筛选TORCH患者，提高出生人口素质。2. 有利于预测胎儿宫内感染状况及妊娠结局。 3. TORCH感染孕妇的治疗效果观察。4. 器官移植、免疫系统疾病等病人监控。 5. 建立TORCH的分子诊断标准 TORCHTORCHTOXCMVRVHSV核测核酸DNADNARNADNA检测标本
39、血液、羊水、绒毛膜血液、尿液、乳汁、唾液、精液、分泌物咽拭子、血液、尿液、羊水、胎盘、妊娠物疱疹液、患处刮片、粘膜、血液TORCH检测核酸与检测标本的比较检验报告单结果读取 3.637E+06 检测下限: 1000拷贝/毫升 3.637106 1.000E+03 copy/ml 如果是标本量是可以定量的，如血液、脑脊液等，则检测结果报告为：copy/ml如果是标本量不能定量，如分泌物等，则结果只能报告为：copy 1.亲子鉴定 2.法医物证 3.PCR-RFLP技术的法医学应用 4.罪犯鉴定 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，
40、而许多病原体床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的的免疫学检测存在较长的“窗口期窗口期”，不利，不利于对疾病的早期诊断；于对疾病的早期诊断；PCRPCR方法直接检测病方法直接检测病原体的原体的DNA/RNADNA/RNA，能大大缩短，能大大缩短“窗口期窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断诊断。1乙型肝炎乙型肝炎病毒病毒（HBV）; 2. 丙型肝炎丙型肝炎病毒病毒（HCV）3淋球菌淋球菌(NGH); 4 人类免疫缺陷病毒（人类免疫缺陷病毒（HIV）5解脲脲原体解脲脲原体(UU) 6 肺炎支原体肺炎支原体(MP)7单纯疱疹单纯疱疹II型型 8 人巨细胞病毒人巨细胞病毒（HCMV）9人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒（HPV）6、1110高危型人乳头瘤病毒高危型人乳头瘤病毒（HPV 8个型）个型）11沙眼衣原体沙眼衣原体(CT) 12a-地中海贫血地中海贫血13结核分支杆菌结核分支杆菌(TB) 14新型冠状病毒新型冠状病毒(SARS) 荧光定量PCR技术中国专利 国家重点新产品 多种荧光PCR试剂盒新药证书多项国家、省部级等科技进步奖 三十余项国家、省部级重点科研项目 业务遍布全国1026家医疗卫生单位达安烙印
