1、Chapter 6 Enzyme Kinetics Metabolic Control Analysis 代谢通量分析可以找到需要优化的途径（通量），代谢通量分析可以找到需要优化的途径（通量），而如何快速有效地实现对目的途径（通量）的优而如何快速有效地实现对目的途径（通量）的优化呢？化呢？ 需要知道途径中各单个反应速率变化对目标通量需要知道途径中各单个反应速率变化对目标通量的影响程度，显然改造那些具有较大影响程度的的影响程度，显然改造那些具有较大影响程度的反应的效果最好。反应的效果最好。Metabolic control analysis is a method for analysing h
2、ow the control of fluxes and intermediate concentrations in a metabolic pathway is distributed among the different enzymes that constitute the pathway. 1PPT课件 Enzyme kineticsEnzyme kinetics Metabolic Control AnalysisMetabolic Control Analysis2PPT课件6.1 酶动力学酶动力学单底物的酶催化反应动力学模型单底物的酶催化反应动力学模型: : 由由V. C .
3、R. Henri V. C .R. Henri 于于19021902年及年及L. Michaelis L. Michaelis 和和M. L. Menten M. L. Menten 于于19131913年建立的。简单年建立的。简单的酶催化反应动力学通常是指的酶催化反应动力学通常是指Michaelis-MentenMichaelis-Menten动力学或饱和动力学或饱和动力学。动力学。 11kk 2k E+SESE+P 两个假定：两个假定：1.1.形成形成ESES复合物的反应速度很快复合物的反应速度很快. . 2. 2.第二步的逆反应速率可忽略。此假设仅在反第二步的逆反应速率可忽略。此假设仅在
4、反应初期产物的累积量很少时才能成立。（应初期产物的累积量很少时才能成立。（快速平衡假设快速平衡假设） 19251925年年Briggs Briggs 及及HaldaneHaldane在快速平衡假设基础上做了改进：在快速平衡假设基础上做了改进：拟稳态假设拟稳态假设, ,此假设在反应初期不成立，经过短暂过渡期后此假设在反应初期不成立，经过短暂过渡期后（ms)ms)成立成立（P193, note6.1P193, note6.1） 。 3PPT课件（1）米氏方程的推导）米氏方程的推导 快速平衡假设快速平衡假设 拟稳态假设拟稳态假设2k E+SESE+P 11kk 2PESdvkdt 02PESSSSm
5、mmdVvkdtKK 11E SESmkKk 112ESE SESESdkkkdt 0E = E- ES 121E SESmkkKk 111010E SESEES SESESES =+ SmkkkkK 10120ES0EES SESES =0ESES =SmddtkkkK 02PESSSSmmmdVvkdtKKK Km m: : 即即ESES的解离常数的解离常数, ,单位浓度下复合物解离速度与形成速度之单位浓度下复合物解离速度与形成速度之比比K Km m: : 单位浓度下复合物总解离速度与形成速度之比单位浓度下复合物总解离速度与形成速度之比Kcat=Vm/E0=k2 Kcat/Km 4PPT课
6、件012345600.10.20.30.40.5srslope = k/Km rmax = k SSmmVvKSKm时 ， SSmmVvVS = Km时 ，12mvV5PPT课件 SSmmVvK 111SmmmKvVV参数的确定：双倒数作图法参数的确定：双倒数作图法6PPT课件1212kkkkESESEP 1201212()k skpesekkk skp121222001212()()k k sk kprk eskp eesekkk skpES0ddt 0E = E- ES121FmkkKk122RmkkKkmax20max10FRVk EVk Emaxmax / /1 / /FFRRmmFR
7、mmVSKVPKrSKPK产物浓度很低时，即米氏方程产物浓度很低时，即米氏方程7PPT课件maxmax1 111 miKIvvKSv12-1E+SESE+P+IEIkkkiK E IEIiK ,appiI1mmmKKKKI=0I0竞争性抑制的最终作用结果竞争性抑制的最终作用结果是使是使 ，因此，因此降低了反应速度。最大反应降低了反应速度。最大反应速度不变。竞争性抑制可通速度不变。竞争性抑制可通过提高底物浓度来克服。过提高底物浓度来克服。 ,appmmKK(2) Competitive inhibition enzyme kineticsmax,maxappvv iSI1SmmVvKK 121E
8、 SESmkkKk8PPT课件(3)Non-competitive inhibition enzyme kineticsmaxmax111 1 miKIvvSvK非竞争性抑制剂不是底物类似物。抑制剂非竞争性抑制剂不是底物类似物。抑制剂与酶结合的位点不是酶的活性位点，这种与酶结合的位点不是酶的活性位点，这种结合降低了酶的有效浓度。高底物浓度不结合降低了酶的有效浓度。高底物浓度不能克服非竞争性抑制。必须加入其它试剂能克服非竞争性抑制。必须加入其它试剂去阻止抑制剂与酶的结合。去阻止抑制剂与酶的结合。 2 E+SESE+PIIEI+SESImmkKKiK ,appmmKKmax,maxmax1 1ap
9、pivvvIK EIES I=EIESIiK I=0I0 iSI1(S )mmVvKK 121E SESmkkKk9PPT课件(4) Uncompetitive inhibition enzyme kinetics反竞争性抑制剂只与反竞争性抑制剂只与ESES复合物结合，而复合物结合，而且它与酶无亲和作用。且它与酶无亲和作用。 VmVm值的降低要比值的降低要比KmKm值的降低更具显著作用，其最终结果值的降低更具显著作用，其最终结果是使反应速率降低。是使反应速率降低。 max,maxmax1 1appivvvIK ES I=ESIiKI=0I02E+SESE+PIESImKkiK m axm ax
10、1111 miKIv vS vK ,appi1I1mmmKKKK iSI1SmmVvKK 121E SESmkkKk10PPT课件(5) Substrate inhibition enzyme kinetics212E+SESE+PSESmKkSK 如果底物自身有抑制作用：一种反竞如果底物自身有抑制作用：一种反竞争抑制，争抑制，1/v1/v是是1/s1/s的双曲函数，该双的双曲函数，该双曲函数具有一垂直和一倾斜渐近线曲函数具有一垂直和一倾斜渐近线 12S ESESSK 12SSSSmmVvKK在低底物浓度时，在低底物浓度时，SS2 2/K/KSISI11，观察不到抑制作用。反应速率为，观察不到
11、抑制作用。反应速率为 1SmmVvK 在高底物浓度时，在高底物浓度时，KKm m/S1/S1n1。15PPT课件maxmaxmaxmax1lnlnlnnnnnnnnnrsrrsKKrsKrsrsrnsnKrr slpoe=nlnsmaxlnrrrln K参数n和K的确定:P205:例6.2 噻唑篮（MTT)法测定胞内NADH浓度 两种底物MTT0X及乙醇过量，反应中可以认为浓度不变 ADH快速将NAD+还原为NADH，反应体系中NADH浓度稳定不变 dMTTred/dt=kMTT0XNADH 做标准曲线（图6.7），测定MTTred生成速度后在标准曲线上确定对应的NADH 16PPT课件 HK
12、, PFK-1, and pyruvate kinase (PYK) are the rate-limiting steps because: They are the slowest enzymes in the pathway by at least one order of magnitude (they have the lowest Vmax values). They are allosteric enzymesIn consequence, to vary the glycolytic flux, one of these enzymes has to be modified.G
13、APDHPGKENOPGAM6.2 6.2 代谢控制分析代谢控制分析17PPT课件EMPEMP途径通量控制分散，需要多个酶一起扩增途径通量控制分散，需要多个酶一起扩增控制分析需要解决的问题：修饰哪些酶？酶活改变多少？控制分析需要解决的问题：修饰哪些酶？酶活改变多少？18PPT课件（1） 基本概念与定理基本概念与定理 通量通量J J 反应速率反应速率r r 稳态时，一条途径的稳态时，一条途径的J J等于这条途径中任何一步反应的等于这条途径中任何一步反应的r r 线性途径中最好的情况是：某步反应速率线性途径中最好的情况是：某步反应速率r r提高提高a%, a%, 达到新的稳达到新的稳态后，这条途径
14、的其它所有反应速率态后，这条途径的其它所有反应速率r r均提高均提高a%a%，从而流经该反应的通，从而流经该反应的通量也提高量也提高a%a% 最差的情况是：某步反应速率最差的情况是：某步反应速率r r提高提高a%, a%, 达到新的稳态时，其它达到新的稳态时，其它所有反应速率均不变化，该步反应速率恢复到原水平，流经该反应的所有反应速率均不变化，该步反应速率恢复到原水平，流经该反应的通量不能提高。通量不能提高。 更一般的情况是：某步反应速率更一般的情况是：某步反应速率r r提高提高a%, a%, 达到新的稳态时，其达到新的稳态时，其它所有反应速率均提高了它所有反应速率均提高了b%b%，该步反应速
15、率从提高，该步反应速率从提高a%a%降至提高降至提高b%b%，流，流经该反应的通量提高经该反应的通量提高b% b% 。121rrSSP 111k srsK2 1212k srsK11211111211222 12 12122121121(1)k sfk srrsKsKk ssfk sfK sfKssKsKsKfssKf s新稳态：110.52ss一般性原则：一般性原则：19PPT课件 如何对这种影响程度实行量化？如何对这种影响程度实行量化？ 通量控制系数（通量控制系数（FCCsFCCs) ) 由代谢途径中一个由代谢途径中一个酶活酶活的的无穷小变化无穷小变化所引起的所引起的通量的相对变化通量的相
16、对变化与该与该酶活的相对变化酶活的相对变化之比。之比。通量控制系数（通量控制系数（Flux control coefficients)/(6.33)/JiiiiiEJ JJCEEJEChannelling effect Channelling refers to mechanisms in which the product of one enzyme is transferred directly to an enzyme that uses it as substrate without necessarily passing through the free solution. Only
17、 independent catalysts:Only independent catalysts:酶活酶活= =酶浓度酶浓度Many enzyme-catalysed reaction rates are linear in terms of the enzyme concentration (at least in a certain range of enzyme concentrations), control coefficients can be written using enzyme concentrations 12%0%1;00%;JJaCCaaa20PPT课件通量控制系数
18、的加和定理通量控制系数的加和定理summation theorem 在在线性途径线性途径中酶促反应的通量控制系数的和为中酶促反应的通量控制系数的和为1 1 ：1(6.34)1IJiiC121ISSSSP;1,iidEaiIEdJaJ1212121212.JJJiiiiJJJidJdEdJdJdEdEdJCCCJJJJEEEaCaCaCaThe summations are over all the steps of the system. This may include not only the steps of the pathway of interest but also of oth
19、er pathways (as long as there are links between them). In principle for a whole cell, the summation would have to be over all metabolic steps of that cell. Giersch, C. (1988) Control analysis of metabolic networks. 1. Homogeneous functions and the summation theorems for control coefficients. Eur. J.
20、 Biochem. 174, 509-513.921PPT课件浓度控制系数浓度控制系数Concentration-control Coefficients 同样地，途径中某个酶活的变化也会影响到胞内同样地，途径中某个酶活的变化也会影响到胞内代谢物的浓度，这种影响程度用浓度控制系数来代谢物的浓度，这种影响程度用浓度控制系数来量化：量化：/;1,1,1(6.35)/jjjiijiijisssECiIjIEEsE121ISSSSPI I个反应，个反应，I-1I-1个胞内代谢物个胞内代谢物这些系数说明了当第这些系数说明了当第i i个酶活性无穷小变化所引起的第个酶活性无穷小变化所引起的第j j个个中间代
21、谢物浓度的相对变化与酶活相对变化之比。中间代谢物浓度的相对变化与酶活相对变化之比。 22PPT课件浓度控制系数浓度控制系数Concentration-control Coefficients101,1(6.36)IijiCjI浓度控制系数的加和定理浓度控制系数的加和定理所有酶按同样的程度所有酶按同样的程度a a改变时（见注释改变时（见注释6.36.3），中间产物浓度保），中间产物浓度保持不变：持不变： 这表明对每个中间产物，至少有一个酶施加负控制，即当该酶的浓度这表明对每个中间产物，至少有一个酶施加负控制，即当该酶的浓度增加时代谢物浓度却下降了增加时代谢物浓度却下降了 12121211200j
22、jiIjjjjijjijijijjidssdsdsdsdsdededeCCCaCsseee As a consequence of the summation theorems, one concludes that the control coefficients are global properties and that in metabolic systems, control is a systemic property, dependent on all of its elements (steps). 23PPT课件 同样地，代谢物浓度的变化对途径中的某些反应速率也有同样地，代谢
23、物浓度的变化对途径中的某些反应速率也有影响，这种影响程度用弹性系数来描述：影响，这种影响程度用弹性系数来描述： 代谢物代谢物j j对于第对于第i i个酶的弹性系数可定义为：个酶的弹性系数可定义为： 弹性系数弹性系数 Elasticity cofficients/;1,1,1(6.37)/jiiijijjijsr rriIjIssrs和第第i i个反应速率对于第个反应速率对于第j j个代谢物浓度的弹性：在假定其它系个代谢物浓度的弹性：在假定其它系统变量保持不变的条件下，由代谢物浓度的无穷小变化所引统变量保持不变的条件下，由代谢物浓度的无穷小变化所引起的反应速率相对变化与代谢物浓度相对变化之比起的
24、反应速率相对变化与代谢物浓度相对变化之比负的弹性系数表明当第负的弹性系数表明当第j j个中间产物浓度增加时第个中间产物浓度增加时第i i个反应速率降低，反个反应速率降低，反之亦然。如果第之亦然。如果第j j个中间产物不影响第个中间产物不影响第i i个酶反应的反应速率（此反应的个酶反应的反应速率（此反应的速率可能与速率可能与s sj j的浓度无关或酶被饱和），那么的浓度无关或酶被饱和），那么 0jiUnlike control coefficients, elasticity coefficients are not systemic properties but rather measure
25、how isolated enzymes are sensitive to changes in parameters. （反应速率只和底物、产物、调节物这三类代谢物（反应速率只和底物、产物、调节物这三类代谢物有关）有关）24PPT课件 A particularly useful and important feature of MCA is that it can relate the kinetic properties of the individual reactions (local properties) with (global) properties of the whole
26、intact pathway. This is done through the connectivity theorems that relate the control coefficients and the elasticity coefficients of steps with common intermediate metabolites Kacser, H. & Burns, J.A. (1973) The control of flux. Symp. Soc. Exp. Biol. 27, 65-104.Connectivity theorem25PPT课件通量控制的连接定理
27、通量控制的连接定理Flux-control connectivity theorem10;1,1(6.38)IJijiiCjIP215 P215 证明证明具有具有低的通量控制系数低的通量控制系数的反应具有的反应具有高弹性系数高弹性系数反之，具有反之，具有高的通量控制系数高的通量控制系数的反应具有的反应具有低弹性系数低弹性系数因为：具有高通量控制系数的反应的速率变化将使其它所有反应速率（具有低因为：具有高通量控制系数的反应的速率变化将使其它所有反应速率（具有低的通量控制系数）也发生较大的变化，而这种变化是由代谢浓度的变化传递的。的通量控制系数）也发生较大的变化，而这种变化是由代谢浓度的变化传递的
28、。所以其它反应对代谢物浓度变化一定比较敏感，即具有较高的弹性系数。所以其它反应对代谢物浓度变化一定比较敏感，即具有较高的弹性系数。相反，具有低通量控制系数的反应的速率变化也将引起代谢物浓度变化，但代相反，具有低通量控制系数的反应的速率变化也将引起代谢物浓度变化，但代谢物浓度变化不能使其它反应发生较大的变化谢物浓度变化不能使其它反应发生较大的变化121ISSSSP1112123131.0JJJJIICCCC1(1)12(1)23(1)3(1).0JJJJIIIIIICCCC1212223232.0JJJJIICCCC1j 2j I-1j 26PPT课件浓度控制的连接定理浓度控制的连接定理Conc
29、entration-control connectivity theorem111;1,1(6.39)0;,1,1(6.40)IijjiiIijkiiCjICj kIkj 和利用矩阵符号，可以将（利用矩阵符号，可以将（6.346.34）、（）、（6.366.36）、（）、（6.386.38）、）、（6.396.39）、（）、（6.406.40）中所有的法则概括为：）中所有的法则概括为：1111,1111212212,11,11,21,1,1111100010(6.41)001JIJIIJIIIIIII ICCCCCCCCC121ISSSSPI I个反应，个反应，I-1I-1个胞内代谢物个胞内代
30、谢物下标下标j j、k k表示代谢物，表示代谢物，i i表示反应表示反应加和加和连接连接通量通量 浓度浓度I-1个等式个等式（I-1）2-（I-1)个等式个等式（I-1I-1）I I个个 I I个个 I(I-1)I(I-1)个个代谢物1代谢物2代谢物I-1代谢物1代谢物2代谢物I-127PPT课件 此时此时I I为单位阵（维数为单位阵（维数I II I）。对于非奇异阵）。对于非奇异阵E E，控制，控制系数为：系数为： *(6.42)ECI*1(6.43)CE例例6.3 6.3 由弹性系数求通量控制系数由弹性系数求通量控制系数(P216)(P216)11111111121111111211212
31、(1)(1)(1)1(1)(2)eqeqeqeqKbsyKr sk sKsassys rKrsKsKbKKar scs ryc 111222;eqKksKKJxyJabcksksss28PPT课件由式由式6 64141得：得：1111112212111001JJCCCC1111221110JJCC 12112111111211121112112111111010JJCC 1212121111JCbyacx由于知道动力学方程后求弹性系数比较容易，所以由于知道动力学方程后求弹性系数比较容易，所以可以方便地通过弹性系数得到通量控制系数可以方便地通过弹性系数得到通量控制系数121rrSSP 1222(
32、)()4)aaaaacyaxaxxbbbbb C1J是是x的减函数，的减函数， P217, Figure 6. 92 1212k srsK1111(1)eqk srssKK6.2810,1JxC则29PPT课件例例6 64 4 代谢控制分析举例代谢控制分析举例123SSSSP4 4个反应，个反应，3 3个胞内代谢物个胞内代谢物11 111*1122 23212*2233 3323*3344 434*4(1)11(2)11(3)1(4)1inhibsrk essKKsrk esssKKKsrk essKKsrk epsKK30PPT课件*11122212*33322223*33334433411
33、11/(1/)00(1/)/00/(1/)0inhibs KKKsKaaEKsKs KKaass KKKp KKsaa*1111*21222*32333*43444(1/)(1/)(1/)(1/)asKsKasKsKasKsKasKsK123SSSSP11110.140.960.390.270.90.5000.240.270.690.4800.20.700.070.081.230.1401.00.50.50.550.610.150.89ECFCCsr1r2r3r4S1 S2 S331PPT课件 中间产物中间产物s s3 3浓度的增加将阻碍第二步反应（浓度的增加将阻碍第二步反应（s s1 1转化
34、为转化为s s2 2）因）因此增加处于反馈控制的酶此增加处于反馈控制的酶E E2 2的浓度的方法的浓度的方法并不是提高通量的并不是提高通量的最佳方法最佳方法 123SSSSP11110.140.960.390.270.90.5000.240.270.690.4800.20.700.070.081.230.1401.00.50.50.550.610.150.89ECFCCsr1r2r3r4S1 S2 S3从浓度控制系数可以看出：当最后一个酶的活性提高时，从浓度控制系数可以看出：当最后一个酶的活性提高时，最后一个中间产物最后一个中间产物s s3 3及第一个中间产物及第一个中间产物s s1 1的浓度
35、迅速降的浓度迅速降低然而同时第二个中间产物低然而同时第二个中间产物s s2 2的浓度增加的浓度增加 在引入在引入FCCs的概念之前，一个调节酶经常意味着一的概念之前，一个调节酶经常意味着一个限速步骤，但在引入个限速步骤，但在引入FCCs的概念后发现这并不是的概念后发现这并不是实情。实情。MCA理论表明限速步骤这一概念是毫无道理理论表明限速步骤这一概念是毫无道理的，取而代之的应是的，取而代之的应是FCCs值和限速程度！值和限速程度！ 32PPT课件123SSSSP如果反馈抑制能被解除，即如果反馈抑制能被解除，即 32320 0，则可计算出控制系，则可计算出控制系数矩阵：数矩阵： 0.270.82
36、0.750.520.470.521.340.940.130.151.050.270.130.151.041.73CS1 S2 S3r1r2r3 r4此时速率控制步骤现在为酶促反应中的第二个酶。因此它为此时速率控制步骤现在为酶促反应中的第二个酶。因此它为潜在的速率控制酶，即：如果抑制被去除或大量减少时，第潜在的速率控制酶，即：如果抑制被去除或大量减少时，第二个反应将控制总体通量二个反应将控制总体通量 当反馈抑制去除后，最后一行的所有三个浓度系数成为负值。当反馈抑制去除后，最后一行的所有三个浓度系数成为负值。增加最后一个酶的活性将降低所有中间产物的浓度。增加最后一个酶的活性将降低所有中间产物的浓度
37、。 上游代谢物上游代谢物（底物）为负（底物）为负值，下游代谢值，下游代谢物（产物）为物（产物）为正值正值33PPT课件 假设构建一个新菌株，该菌株拥有一与假设构建一个新菌株，该菌株拥有一与E E2 2相似的酶但是相似的酶但是弹性系数不同。第二步酶促反应的弹性系数为：弹性系数不同。第二步酶促反应的弹性系数为：s s3 3的反馈抑制减小并且的反馈抑制减小并且 变小。具有细微差别变小。具有细微差别E E2 2的的生产菌株代替了原始菌株，控制系数矩阵变为：生产菌株代替了原始菌株，控制系数矩阵变为：1222321.00.60.3 0.250.830.720.500.230.250.650.450.190
38、.220.880.390.330.360.491.34C*22/KK采用新酶后最后一个酶的通量控制能力减少，每种酶的通采用新酶后最后一个酶的通量控制能力减少，每种酶的通量控制系数都接近平均值量控制系数都接近平均值0.250.25。通量控制分散，因此没有。通量控制分散，因此没有酶在酶促反应的通量控制中占优势酶在酶促反应的通量控制中占优势 0.50.21.034PPT课件 上面的讨论没有包括操作条件对细胞特性的影响，需要注意上面的讨论没有包括操作条件对细胞特性的影响，需要注意的是通量控制系数可能随着操作条件的变化发生巨大变化的是通量控制系数可能随着操作条件的变化发生巨大变化 当对具有大的通量控制系
39、数的反应（酶）进行操作后，通量当对具有大的通量控制系数的反应（酶）进行操作后，通量控制系数的值大小变得差不多，但是这并不一定表明经由途控制系数的值大小变得差不多，但是这并不一定表明经由途径的通量要比原始菌株的通量高很多。进一步改进需要继续径的通量要比原始菌株的通量高很多。进一步改进需要继续增加途径中所有酶的剂量增加途径中所有酶的剂量 当知道当知道s s、p p及动力学方程时，可通过计算得到所有胞内代谢及动力学方程时，可通过计算得到所有胞内代谢物浓度。并计算出弹性系数（物浓度。并计算出弹性系数（s si i的复杂函数），最后求出控的复杂函数），最后求出控制系数矩阵制系数矩阵C(C(包括通量控制和
40、浓度控制系数）包括通量控制和浓度控制系数） 在对酶进行修饰前（动力学参数的改变）必须最优化当前反在对酶进行修饰前（动力学参数的改变）必须最优化当前反应网络：通过模拟在不同应网络：通过模拟在不同s s及及p p值下的通量实现通量最大化。值下的通量实现通量最大化。 胞内代谢物浓度的变化较小的原则胞内代谢物浓度的变化较小的原则35PPT课件（2） FCCs的确定方法的确定方法 直接法：直接法：通过对通量和酶活的测量来直接确定控制系数通过对通量和酶活的测量来直接确定控制系数的值，活力的变化很小但并不是无穷小的值，活力的变化很小但并不是无穷小 间接法间接法：确定弹性系数的值，随后通过确定弹性系数的值，随
41、后通过 MCAMCA定理计算得定理计算得出控制系数出控制系数 瞬时代谢物浓度法瞬时代谢物浓度法 大偏差理论：大偏差理论：通过测量由酶活的大范围波动所导致的通通过测量由酶活的大范围波动所导致的通量变化来计算量变化来计算FCCsFCCs的方法的方法 linlog kinetics method36PPT课件直接法 在某一酶活处的在某一酶活处的FCCFCC值等于曲线中该酶活值等于曲线中该酶活处切线的斜率用相应处切线的斜率用相应的通量酶活比的通量酶活比J/EJ/E归一归一化化 基因工程方法基因工程方法: :构建大量的突变株，这些突变株中某个构建大量的突变株，这些突变株中某个酶的表达量不同（或酶活不同）
42、，测定所有突变株在酶的表达量不同（或酶活不同），测定所有突变株在同同一操作条件下一操作条件下的通量的通量: :得到得到J-EJ-E关系图关系图 滴定法：滴定法：纯化酶纯化酶提高酶活或专一性提高酶活或专一性抑制剂抑制剂降低酶活，检降低酶活，检测产物或底物变化得到通量测产物或底物变化得到通量/(6.33)/JiiiiiEJ JJCEEJE37PPT课件1.The perturbations should be very small - because the steady state moves when the perturbations are finite, there is an erro
43、r associated with large perturbations (the larger they are, the bigger the error. To minimize this error the perturbations should be small, something like 1% would be ideal. However, the effects of small perturbations are usually also small and so are very difficult to detect. More often perturbatio
44、ns of over 10% are used, even though they imply some error in the results. 2.Inhibitors must be specific - if we want to perturb the rate of one reaction by adding an inhibitor, this must only affect that reaction alone, not any of the others in the system. It is often difficult to fulfil this requi
45、rement.3.The rate of reaction must change linearly with the enzyme concentration, if we want to use the enzyme concentration as the parameter to perturb. If the relation between rate and enzyme concentration is not linear, then the resulting control coefficients will not conform to the summation the
46、orems. Several problems associated with these approaches: 38PPT课件 这种方法有两个重要的前提条件：这种方法有两个重要的前提条件：v 代谢系统中的所有反应和有关的调节作用都被充分的描述代谢系统中的所有反应和有关的调节作用都被充分的描述v 系统处于稳态，初始底物和最后产物的浓度是定值系统处于稳态，初始底物和最后产物的浓度是定值 为了确保这些条件得到满足，最好至少直接测定系统的一为了确保这些条件得到满足，最好至少直接测定系统的一个控制系数来对结果进行检验。个控制系数来对结果进行检验。 测定弹性系数的方法：测定弹性系数的方法： a. a.
47、 通过动力学模型计算弹性系数通过动力学模型计算弹性系数 胞内酶动力学是否正确描述了胞内酶的功能？胞内酶动力学是否正确描述了胞内酶的功能？ 大多数酶动力学的研究是基于对初始反应速度的测量，而此时反大多数酶动力学的研究是基于对初始反应速度的测量，而此时反应产物并不存在，显然这并不代表胞内的真实情况应产物并不存在，显然这并不代表胞内的真实情况 胞内环境的复杂性，包括很多可能是效应物的代谢物，而体外实胞内环境的复杂性，包括很多可能是效应物的代谢物，而体外实验可能会遗漏某些重要效应物。验可能会遗漏某些重要效应物。 间接法39PPT课件b.b.双调法双调法此反应的速度依赖于式中所示化合物的浓度，即此反应的
48、速度依赖于式中所示化合物的浓度，即r r= =f f( (c cA A, ,c cB B) )。 在稳态下在稳态下J= J= r r ，因此有：，因此有： rAB /lnlnlnlnABABABAAABBBrrrrAABBAABBrrr rrr rrdJdcdcdcdcccccccccrdcdcJdcdc测定稳态时两个代谢物的浓度和通量，然后引入很小的测定稳态时两个代谢物的浓度和通量，然后引入很小的一个扰动，例如改变细胞外底物的浓度，来产生一组新一个扰动，例如改变细胞外底物的浓度，来产生一组新的通量和代谢物浓度的测量值。通过用有穷差异来对上的通量和代谢物浓度的测量值。通过用有穷差异来对上式的微
49、分进行近似化，这个干扰实验就产生了一个方程。式的微分进行近似化，这个干扰实验就产生了一个方程。换一种干扰，例如改变产物浓度产生了第二个方程。两换一种干扰，例如改变产物浓度产生了第二个方程。两个干扰实验就可以求得两个弹性系数。个干扰实验就可以求得两个弹性系数。两组干扰产生的两组干扰产生的数据不能线性相关数据不能线性相关 ！干扰实验的数目取决于！干扰实验的数目取决于函数函数f !f !40PPT课件 如果知道其中一个弹性系数，则另一个可通过单调节实如果知道其中一个弹性系数，则另一个可通过单调节实验获得验获得 这种方法的优点是可以应用几个同类型的但调节幅度不这种方法的优点是可以应用几个同类型的但调节
50、幅度不同的调节，并且可用作图法来确定方程中的微分部分同的调节，并且可用作图法来确定方程中的微分部分 c. 单调法单调法d. Top-down：自上向下法：自上向下法PXSGroupGroup21在许多情况下，并不需要知道所有的在许多情况下，并不需要知道所有的FCCsFCCs值，最重要的是知值，最重要的是知道那些（个）反应具有最大的控制系数道那些（个）反应具有最大的控制系数v分割代谢途径，通过双调法实验或单调法实验确定组弹性分割代谢途径，通过双调法实验或单调法实验确定组弹性系数，求出系数，求出Group FCCsGroup FCCsv重新分割，直到找到对通量实行主要控制的反应或反应组重新分割，直
