1、实验一实验一外周血淋巴细胞外周血淋巴细胞的分离的分离nPBMC: peripherial blood mononuclear cell (T cell, B cell and monocyte)原原 理理n外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液淋巴细胞分层液（Ficoll）作作密度梯度离心密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。从而将各种血细胞加以分离。 原原 理理外周血外周血红细胞红细胞粒细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板血小板淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞1.09
2、31.0301.0351.0751.090Ficoll：1.0770.001 (PBMC)1.0921500rpm, 20 , 30minPBMC红细胞红细胞粒细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、稀释的血浆、血小板血小板实验步骤实验步骤n1.采血，稀释采血，稀释 （外周血：稀释液外周血：稀释液=1：2）n2.在离心管中加入在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血：稀释血=1：2）实验步骤实验步骤n3.18，1500r/min，离心离心30minn4. 轻轻吸取轻轻吸取PBMC层移入另一试管中层移入
3、另一试管中n5.加足量稀释液加足量稀释液充分洗涤充分洗涤，1800 r/min离心离心5min ，弃上清。，弃上清。注意事项注意事项n每毫升外周血液大约可获每毫升外周血液大约可获1106单个核细胞单个核细胞 nFicoll应适量，外周血应充分稀释应适量，外周血应充分稀释 n温度直接影响到温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果的比重和分离效果 n在在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面免冲散界面 n吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染清液或分层液而导致血小板污染细胞计数细胞计
4、数n1、准备计数板、准备计数板：n2、制备细胞悬液、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞：收集细胞，制成单个细胞悬液悬液n3、加样、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，胞悬液，n4、计数、计数：在显微镜下，用：在显微镜下，用10物镜观察计数物镜观察计数板四角大方格中的细胞数板四角大方格中的细胞数 实验步骤5、计算计算：细胞数细胞数/毫升毫升=（4大格细胞数之和大格细胞数之和/4）104注意事项n1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液取样计数前，应充分混匀细胞悬液 n2.加样量不要
5、溢出盖玻片，也不要过少或带加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡气泡n3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 n4.本法要求细胞密度不低于本法要求细胞密度不低于104细胞细胞/mln5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数释不当，需重新制备细胞悬液、计数Enzyme-linked immunoabsobant assays (ELISA)酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验n原理 : antigen + antibodyn必需条件: specificity visibility Ag-Ab
6、complex使用抗体的诊断检测技术使用抗体的诊断检测技术目的原理目的原理 本法是指用酶标记抗体进行抗原抗体反应，从而将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断实验结果，可经酶标测定仪作定量分析，灵敏度可达微微克（pg）水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP），它们与抗体结合不影响抗体活性，这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。 酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,
7、 ELISA），简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术。基本的方法有三类，即间接法、双抗夹心法和抗原竞争法。Enzyme-linked immunoabsobant assays双抗夹心法双抗夹心法1st AbsubstratesColored products Enzyme2nd AbAg1st Abcapture antibodylabeled /detective Ab实验步骤 1.1. 包被：包被：取羊抗鼠IgG包被单抗20ug,用0.01M Tris-HCl稀释至10ml,加入96孔板中,每孔100ul,4过夜； 2.2. 封闭：封闭：用洗涤液(含0.01%Tween-20的
8、0.01M PBS)洗涤两次,然后加入封闭液(含15%小牛血清的0.01M PBS),每孔300ul,37,孵育2h； 3.3.加样品：加样品：洗涤两次, 加入标准品鼠IgG 1ug/ml, 每孔100ul, 37,孵育2h； 4. 4. 加羊抗鼠加羊抗鼠IgG-Fc-HRPIgG-Fc-HRP: : 洗涤两次,加羊抗鼠IgG-Fc-HRP每孔100ul(5ug/ml),37孵育1h； 5. 5. 加底物显色：加底物显色：洗涤两次，加底物OPD反应液每孔100ul，置于室温510min； 6. 6. 终止：终止：加终止液2M H2SO4 50ul每孔； 7.7.检测及绘制标准曲线：检测及绘制标
9、准曲线：于490nm处检测OD值，标准曲线的斜率：bXY/X2,标准曲线YbX (其中，X：浓度（标准品）；Y：比色OD值的均值)。 . .绘制标准曲线后，通过各孔的OD值在标准曲线上相应位置计算出相应浓度实验目的 1、熟悉酶联免疫检测手段的原理。 2、掌握双抗夹心ELISA的试验操作。 B淋巴细胞杂交淋巴细胞杂交实验四实验四 杂交瘤的目的杂交瘤的目的 - 制备单克隆抗体制备单克隆抗体 杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理具有分泌具有分泌抗体功能的抗体功能的B B细胞难以在体外长期存活。细胞难以在体外长期存活。利用细胞融合技术，将免疫后的利用细胞融合技术，将免疫后的B B细胞与在体外能细胞
10、与在体外能长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养经过选择培养获取杂交细胞获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞. .（HybridomaHybridoma）该细胞的特点：该细胞的特点： 选择动物选择动物The mouse is usually the animal of choice. Suitable mouse myeloma cell lines are widely available, and grown of hybridomas in mice is usually no problem. All of the curren
11、tly available mouse myeloma lines, which are suitable for fusion, are of BALB/C origin, 6-8 week, female mouse is usually used . 1wk 抗原抗原50g/只，溶于只，溶于300l 生理盐水中，加入等量福氏完全生理盐水中，加入等量福氏完全 佐剂（佐剂（CFA）充分乳化，分颈、部皮下多点及腹腔注射；）充分乳化，分颈、部皮下多点及腹腔注射；3wk 抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐改为半佐（抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐改为半佐（IFA）；）；5wk 抗原抗原50g
12、/只，溶于只，溶于300l 生理盐水中，腹腔注射；生理盐水中，腹腔注射；加强加强 融合前融合前35天，抗原天，抗原2030g /只，溶于只，溶于50l 生理盐水中生理盐水中 小鼠尾静脉注射以加强免疫小鼠尾静脉注射以加强免疫（抗原冲击）（抗原冲击）动物免疫动物免疫一、可溶性抗原一、可溶性抗原1wk 细胞数量细胞数量8106/只，洗涤三遍，用只，洗涤三遍，用0.30.4ml的生理的生理 盐水重悬，腹腔注射；盐水重悬，腹腔注射；3wk 细胞数量细胞数量6106/只，细胞的预处理及注射的部位同上；只，细胞的预处理及注射的部位同上；5wk 细胞数量细胞数量5106/只，细胞的预处理及注射的部位同上；只，
13、细胞的预处理及注射的部位同上；加强加强 融合前的融合前的45天，细胞数量天，细胞数量3106 /只，加强免疫只，加强免疫 在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿瘤在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿瘤而死亡，故用丝裂霉素（而死亡，故用丝裂霉素（MMC）处理免疫原细胞，抑制其生长繁）处理免疫原细胞，抑制其生长繁殖以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经殖以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经MMC处理。处理。 二、细胞抗原二、细胞抗原动物免疫动物免疫 PEG： 亲水性，使细胞表面极性降低，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞融合。 分子量：1500-2000
14、融合剂融合剂 HAT: 次黄嘌呤（次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基碟呤（氨基碟呤（aminopterin，A） 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（thymidine, T）细胞的细胞的DNA生物合成有两条途径：生物合成有两条途径：HAT选择性培养选择性培养TK H、THGPRT脾细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞类型脾细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞类型 未发生融合骨髓瘤细胞及其同核融合体：其未发生融合骨髓瘤细胞及其同核融合体：其DNA合成的主合成的主要途径被要途径被A阻断后，由于缺乏阻断后，由于缺乏HGPRT而不能利用培养液中而不能利用培养液中的的H，虽，虽TK可利用可利用T，但不能完成完整的，但不能
15、完成完整的DNA合成过程；合成过程； 未发生融合的脾细胞及其同核融合体：培养液中不能长期未发生融合的脾细胞及其同核融合体：培养液中不能长期生长，生长，7天左右即死亡天左右即死亡 脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞杂交瘤细胞，既从既从脾细胞获得了脾细胞获得了HGPRT和和TK，从而利用培养液中的，从而利用培养液中的H和和T合合成成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能，因此能在在HAT选择培养液中生存下来。选择培养液中生存下来。 处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔
16、，取出脾脏。置置于于120目的钢丝网中目的钢丝网中，将网移入盛有，将网移入盛有20ml生理盐水的生理盐水的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬液，吸取液，吸取1ml细胞悬液（约细胞悬液（约5106细胞）细胞）, 与骨髓瘤与骨髓瘤细胞细胞SP2/0（5105细胞）混合，离心后弃上清细胞）混合，离心后弃上清骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞:脾细胞为脾细胞为1:10一个脾脏可获约一个脾脏可获约108个细胞个细胞实验步骤：免疫脾细胞的制备实验步骤：免疫脾细胞的制备 1、取、取 PEG溶液溶液1.0ml 缓慢加入混合细胞中缓慢加入混合细胞中,边加边加边搅拌；边
17、搅拌；2、静止、静止1分钟；分钟；3、加、加HAT培养基培养基4ml；4、取融合细胞悬液、取融合细胞悬液1ml,滴加在滴加在96孔培养板中，孔培养板中，每孔每孔1滴（约滴（约50l）；）；5、显微镜下观察融合细胞的状态、显微镜下观察融合细胞的状态实验步骤：细胞的融合实验步骤：细胞的融合实验目的：实验目的： 1、了解细胞杂交及单抗制备的基本原理；、了解细胞杂交及单抗制备的基本原理； 2、掌握细胞融合的基本操作。、掌握细胞融合的基本操作。 实验结束后，将实验小鼠放入垃圾袋，使用过的实验结束后，将实验小鼠放入垃圾袋，使用过的 剪刀、镊子、试管及培养板等冲洗干净，放回原剪刀、镊子、试管及培养板等冲洗干
18、净，放回原 处，谢谢合作！处，谢谢合作！ 免疫学实验免疫学实验2-2-免疫荧光技术免疫荧光技术 n原理 : antigen + antibodyn必需条件: specificity visibility Ag-Ab complex使用抗体的诊断检测技术使用抗体的诊断检测技术 一、原理一、原理 免疫荧光技术（免疫荧光技术（ImmunofluorescenceImmunofluorescence techniquetechnique）-将抗体（或抗原）经荧光将抗体（或抗原）经荧光素标记，然后再与相应的抗原（或抗体）结合，素标记，然后再与相应的抗原（或抗体）结合，在一定波长光波的照射下，被标记的荧光
19、素放在一定波长光波的照射下，被标记的荧光素放出可见光（称为荧光），借助荧光显微镜或流出可见光（称为荧光），借助荧光显微镜或流式细胞仪可对待测抗体或抗原进行定性和定量式细胞仪可对待测抗体或抗原进行定性和定量分析。分析。 目前用于免疫荧光分析的荧光素目前用于免疫荧光分析的荧光素异硫氢酸荧光素（异硫氢酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate, FITC)；藻红蛋白（藻红蛋白（R-PE）由于这些荧光素经激发光照射后可发射出不同由于这些荧光素经激发光照射后可发射出不同波长的荧光，因而可对细胞的一种或多种蛋白波长的荧光，因而可对细胞的一种或多种蛋白进行示踪。进行示踪。免疫荧光技术主要用
20、于分析的标本有：免疫荧光技术主要用于分析的标本有：外周血外周血新鲜细胞、培养细胞、组织切片等新鲜细胞、培养细胞、组织切片等 二、二、 用于抗原分析的免疫荧光法用于抗原分析的免疫荧光法 1 1、直接法、直接法-将荧光素标记在单抗后将荧光素标记在单抗后直接对抗原进行分析的方法；直接对抗原进行分析的方法； 第一抗体第一抗体激发激发检测相应抗原检测相应抗原2 2、间接法、间接法-将荧光素标记在第二抗体将荧光素标记在第二抗体 ( (抗抗体，通常为抗鼠抗抗体，通常为抗鼠IgIg) )的分析方法。的分析方法。 第一抗体（鼠抗人）第一抗体（鼠抗人）第二抗体（羊抗鼠）第二抗体（羊抗鼠）特异性高、敏感性低特异性高
21、、敏感性低特异性低特异性低敏感性高敏感性高直接免疫荧光染色直接免疫荧光染色1.1.取分离好的待测细胞，调整细胞浓度到1106/50l每管；2. 再加10l FITC标记的鼠抗人CD40单克隆抗体（1g），震荡使之充分混匀，同时设阴性对照管，加入10l PBS或Hanks；3. 置于430分钟，每10分钟混匀；4 . 加 入 2 m l P B S （ 含 2 % F C S ） 混 匀 ，1500rpm/5min, 4离心，弃上清；5. 重复步骤4；6.加入0.5ml PBS，上荧光显微镜观察。Principle of flow cytometry实验目的实验目的 通过此实验，初步掌握免疫荧光通过此实验，初步掌握免疫荧光技术的原理、一般操作步骤及结果的观技术的原理、一般操作步骤及结果的观察方法。察方法。
