1、病毒性脑炎检测王环宇中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒性脑炎室Department of Viral EncephalitisInstitute for Viral Disease Control and Prevention China CDC 是指病毒感染引起的脑实质炎症，常表现为发热，头痛，抽搐，意识障碍和脑膜刺激症状等，并可有中枢神经系统局灶性损害，预后不佳，死亡率较高，存活者可出现后遗症，如 乙型脑炎病人的后遗症可达30。病毒性脑炎病毒性脑炎Viral encephalitisViral encephalitis 全世界大约有100余种病毒可以引起中枢神经系统急性感染，患病率约
2、为 3.5-7.4/10万人，粗略估计每年大约有 15-30 万病毒性脑炎 病毒性脑炎可分为流行性和散在性两种 具有传播媒介的病毒性脑炎：如乙型脑炎、东方、西方和委内瑞拉马脑炎或呼吸道传播的脑炎等 散在型脑炎：疱疹或风疹病毒等引起 我国近年也发现多起肠道病毒性脑炎的流行 此外国际间发现多种引发脑炎的新病毒,如尼帕病毒（Nipha virus）性脑炎等新发传染病(Emergening diseases），还有一些以前从不引起脑炎的病毒如登革热病毒也出现脑炎的症状病毒性脑炎病毒性脑炎Viral encephalitisViral encephalitis 由于受检测技术的限制，能够作出病原诊断的只
3、有40左右，大部分病例依靠临床诊断 病毒性脑炎检测病毒性脑炎检测Laboratory confirmation for Viral encephalitis血清、脑脊液血清、脑脊液Serum, CSF蚊虫、组织标本蚊虫、组织标本Mosquito pools, Tissues病原体检测病原体检测IgM ELISA IgG ELISA中和实验中和实验 PRNT补体结合实验补体结合实验 CF血凝抑止实验血凝抑止实验 HI间接免疫荧光法间接免疫荧光法 IFA病毒分离（细胞、乳鼠）病毒分离（细胞、乳鼠）Virus isolation (cell culture, mice)间接免疫荧光法间接免疫荧光法I
4、FA逆转录逆转录PCR/PCR/序列测定序列测定RT-PCR / sequencing适时荧光适时荧光 PCR 法法TaqMan RT-PCR病毒性脑炎的检测方法病毒性脑炎的检测方法Diagnostic Assays for Viral encephalitis血清学实验血清学实验检测抗体检测抗体SerologicalAssays for AntibodiesVirus DetectionAssays 患者诊断患者诊断 Human Diagnosis 急性期血清、脑脊液中IgM抗体检测 Acute Antibody (IgM) in serum/csf 恢复期血清标本的中和抗体检测 IgG a
5、nd/or neutralizing antibody (seroconversion) 病毒分离 Occasionally virus in serum/csf and/or in tissues/fatal cases 周围环境的监测周围环境的监测 Environmental Surveillance 自然界蚊虫媒介中病毒分离 Virus in mosquito vectors 扩增宿主中病毒分离 Virus in hosts 扩增宿主中抗体监测 Antibody in hostsBHK-24hBHK-48hBHK-P3-24hBHK-72hBHK-P3-48hBHK-P3-72hBHK-
6、LN02-104-48hBHK-LN02-104-72hBHK-LN02-104-24hC6/36-24hC6/36-48hC6/36-P3-24hC6/36-72hC6/36-P3-48hC6/36-P3-72hC6/36-LN02-104-48hC6/36-LN02-104-72hC6/36-LN02-104-24h 病毒分离 BHK-21 细胞 C6/36 细胞 乳鼠3-4天，发病死亡病毒分离及鉴定病毒分离及鉴定Methods for Isolation and Identification血清学检测血清学检测 SerologyELISA检测IFA检测 ( 40)ABCD采用 3 种抗体
7、用ELISA方法 乙脑病毒多克隆抗体 甲病毒多克隆抗体 布尼亚病毒多克隆抗体 选择其它的IgM ELISA 试剂盒检测 包括：巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、带状疱疹病毒、 人类疱疹病毒6、腮腺炎病毒、麻疹病毒、 科萨奇病毒、艾柯病毒 The other IgM ELISA kits for non-JEV Including CMV, HSV, EBV, VZV, HHV-6, Mumps, Measles, COX, Eco. 血清学检测血清学检测 Serology 感染诊断，为治疗提供依据； 病毒载量（预后、治疗效果）； 难以培养的病毒检测（例如引起脑炎的CMV很难从CSF中培养出
8、来，可用PCR检测，通过PCR定量，可以区分是CNS感染或无症状感染前期）； 监测鉴定病毒，帮助制定控制蚊子的措施； 分子流行病学调查； 发现未知病毒病毒分子生物学检测病毒分子生物学检测披膜病毒科甲病毒属（Alphavirus） 黄病毒科（Flaviridae） 布尼亚病毒科（Bunyaviridae）呼肠孤病毒科（Reoviridae）分子生物学鉴定的基础分子生物学鉴定的基础病毒特有的基因组序列病毒特有的基因组序列黄病毒科 与疾病相关的黄病毒与疾病相关的黄病毒：乙型脑炎病毒，登革热病毒，蜱传脑炎 (TBE)，西尼罗热病毒，圣路易脑炎，Rocio脑炎 黄病毒科病毒中的虫媒病毒有多种与脑炎相关黄
9、病毒科病毒中的虫媒病毒有多种与脑炎相关 以乙脑病毒为例，单股正链的RNA分子，约由11000个核苷酸组成4个部分：5NTR，病毒结构蛋白编码区，非结构蛋白编码区，3NTR病毒RNA分子5 末端有型帽子结构（M7G(5)ppp(5)ApUp)，3末端不含多聚腺苷酸（poly A）尾 黄病毒之间也存在着明显的血清学交叉反应。CPrMENS1NS3NS2bNS2aNS4aNS4bNS55UTR3UTR乙脑病毒基因组结构披膜病毒科甲病毒属An5UTR3UTRnsP1CapPE2nsP2nsP3nsP46KE1Sg P甲病毒基因组结构 披膜病毒科（Togaviridae）甲属病毒（Alphavirus）
10、主要为蚊传病毒，目前发现30种甲病毒，其中14种可引起人畜疾病。 甲病毒基因组为长约12 K的单股正链RNA，具感染性。病毒RNA 具有真核 mRNA 的典型特征，序列的两端彼此互补，因而病毒 RNA能形成环状分子（与病毒复制和包装有关） 甲病毒属内存在着血清学交叉，影响病毒的血清学精确鉴定 与脑炎相关的甲病毒：与脑炎相关的甲病毒：东方马脑炎病毒，西方马脑炎病毒，委内瑞拉马脑炎病毒布尼亚病毒科48621100.5KbBunyavirus Phlebovirus Nairovirus Uukuniemi布尼亚病毒布尼亚病毒RNA节段大小节段大小 布尼亚病毒科是目前数量最多的一组虫媒病毒，其中约有
11、40多种病毒对人畜致病。5个属：布尼亚病毒属（Bunyavirus），白蛉热病毒属（Phlebovirus），内罗毕病毒属（Nairovirus），乌库病毒属（Uukuniemi），类布尼亚病毒属 (Bunyavirus-like) 布尼亚病毒科病毒基因 (白蛉热病毒属为例) 组由3个单股负链RNA片段组成：大(Large, L, 6.5-8.5kb)，中(Medium, M, 3.2-4.3 kb)，小(Small, S, 1.7-1.9 kb) S 片段编码核蛋白(nucloeprotein, N)和非结构蛋白NSs M 片段先翻译出前体多聚蛋白，而后裂解和糖基化形成糖蛋白Gl和G2 L
12、片段包含一个与病毒序列互补的ORF，编码L蛋白，为RNA聚合酶。每种方法各有优势，依据病毒及目的来定检测策略分子生物学检测方法分子生物学检测方法蚊虫标本血清CSF尸检组织标本PCRRT-PCR / sequencing TaqMan RT-PCRDNA microarrayNASBALAMP灵敏、特异、快速等特点样品样品(RNA反转录反转录)分子检测技术PCR/RT-PCR RT-PCR 是将 RNA 的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 实验目标基因区段的选择实验目标基因区段的选择
13、1.保守性保守性2.特异性特异性3.代表性代表性以乙型脑炎病毒的基因分型为例：以乙型脑炎病毒的基因分型为例：目标基因区核苷酸位置（目标基因区核苷酸位置（PreM）：）：456695；240 个核苷酸长度的序列中的差异一般发生于核苷酸密码子的第三位，个核苷酸长度的序列中的差异一般发生于核苷酸密码子的第三位，即突变的位点多以沉默突变的形式存在；表明病毒基因在这一区域所受即突变的位点多以沉默突变的形式存在；表明病毒基因在这一区域所受的进化选择压力小，该区域较能反应病毒的自然进化状况的进化选择压力小，该区域较能反应病毒的自然进化状况 ；基因分型的基因分型的cut-off 值定为值定为12%的差异度的差
14、异度 。4. 可根据文献进行目标区段选择可根据文献进行目标区段选择分子检测技术PCR/RT-PCRPCRPCR结果可以通过琼脂糖凝结果可以通过琼脂糖凝胶电泳观察胶电泳观察 定性结果定性结果分子检测技术PCR/RT-PCR PCR/RT-PCR 方法的优点方法的优点方便、快速，一个工作日内就可完成；灵敏、特异，对病毒检测灵敏度可达 5 pfu/mlPCR 除了对单一致病因子的检测外，还可进行复合检测，即在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段，可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体 PCR/RT-PCR 方法的局限性：方法的局限性：逆转录效率受限制，导致灵敏度有所降
15、低，PCR容易污染而导致假阳性，使特异性降底另外一些问题，如标准化等问题还没有解决分子检测技术PCR/RT-PCR实时荧光实时荧光PCRReal-time PCR 在同一个密闭反应管加入荧光标记探针或荧光染料到PCR扩增反应体系，通过荧光信号反映体系的扩增情况，运用一种特殊的装配有荷电偶联装置（荷电偶联装置（Charge coupled device CCD）的PCR仪,在每个循环的采集荧光信号动态监测PCR全过程的一种体外扩增检测模式称为实时荧光PCR。TaqMan PCR 一种实时荧光核酸扩增检测技术一种实时荧光核酸扩增检测技术TaqMan PCR 是一种基于是一种基于荧光共振能量转移（荧
16、光共振能量转移（FRET)原理原理的实的实时荧光时荧光PCR方法，通过检测荧光强度的动态变化得到扩增曲线方法，通过检测荧光强度的动态变化得到扩增曲线和循环阈值（和循环阈值（Ct），），对待检样品进行定性、定量分析的核酸扩对待检样品进行定性、定量分析的核酸扩增检测技术。增检测技术。1.探针探针：两端标记荧光素的探针两端标记荧光素的探针 （5FAM 3TAMRA) 2. PCR仪仪：装配有装配有荷电偶联装置荷电偶联装置（Charge coupled device CCD）的的PCR仪仪,CCD能够按照一定的时间周能够按照一定的时间周期检测收集荧光信号，由此将扩增期检测收集荧光信号，由此将扩增与检测
17、结合在一起。与检测结合在一起。 ABI 7000/7900 Roche Light CyclerTaqMan PCRRealtime PCR与传统与传统PCR比较比较与普通与普通PCR检测相比，实时荧光检测相比，实时荧光PCR具备几个方面的优势：具备几个方面的优势： 由于实时荧光由于实时荧光PCR采用封闭的检测模式，因此扩增产物采用封闭的检测模式，因此扩增产物导致污染的可能性比普通导致污染的可能性比普通PCR要小得多要小得多 实时荧光实时荧光PCR检测模式功能强大，具备定性、定量、突检测模式功能强大，具备定性、定量、突变、多项目等检测功能。而普通变、多项目等检测功能。而普通PCR要完成上述项目
18、需要完成上述项目需采用不同的技术平台采用不同的技术平台 由于扩增产物的检测在由于扩增产物的检测在PCR扩增过程中同时进行，并且扩增过程中同时进行，并且数据的采集、分析全部由仪器自动完成，因此整个检测数据的采集、分析全部由仪器自动完成，因此整个检测所需的时间比普通所需的时间比普通PCR要节省许多要节省许多 实时荧光实时荧光PCR进行定量检测时，其定量线性范围（进行定量检测时，其定量线性范围（5-6 logs）比普通比普通PCR（2-3 logs）要宽得多要宽得多其它的分子检测技术 DNA 芯片(DNA microarry) 滚环复制扩增技术 (Rolling Circle Amplificati
19、on, RCA) 连环恒温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) DNA芯片于上世纪80年代开始开发（美国，俄罗斯），1989年，AFFYMETRIX 公司制造出了世界上第一块原位合成基因芯片，目前这个公司是世界上芯片做的最好的，已通过欧盟CE认证和美国FDA认证(临床)。 Gene chip or DNA Microarray 是指将大量靶基因或寡核苷酸片段有序的高密度地排列在固定于玻片、硅片等固相载体上，然后与待测的标记样品的基因按碱基互补配对原理进行杂交，通过激光共聚焦荧光监测系统等对芯片进行扫描，再经计算机软件处理，从而获
20、取大量信息DNA 芯片 DNA Microarray滚环复制扩增技术 Rolling Circle Amplification(RCA)RCARCA，噬菌体感染细菌后进行自我复制的一种普片机制，这种复制机制可在同温下对环状单链DNA序列进行相对无限的单链扩增。基于滚环只有在单链闭合状态下并有相应引物存在的条件下才能同温聚合滚动复制的特点。首先设计一个单链寡核苷酸，在此单链的3和5端各有一段序列可与所检测基因上一段连续的靶序列互补。当检测的DNA或RNA样品中包含检测的靶序列时，这段单链两端所拥有的特异互补序列将与之结合形成局部双链。形成挂锁式拓扑结构，并在连接酶的作用下将之连接成环状。此时预先
21、设计的扩增引物便以该环为模版进行滚环复制，形成滚环的单链重复体。然后另一条相应引物再结合到经滚环复制后这种重复拷贝的单链产物上进行扩增，这个扩增序列又可成为最初与滚环结合的引物模版而进行新一轮扩增，将这种扩增形式也称作支链放大。 DNA Microarray技术的优势技术的优势：高通量，发现未知病原体，例如确定SARS- CoV应用了DNA Microarray技术（A Novel Cornoavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome. The New England Journal of Medicine, May 15,
22、 2003, 348(20)）。 DNA Microarray 目前的不足：目前的不足：费用高，周期长，步骤复杂，重复性差，标准化也不理想，但是很有前景。 目前用于脑炎相关病毒检测的芯片不多，如West Nile, Japanese encephalitis (JE), dengue 1-4 viruses（J Med Virol. 2005）, Alphavirus 例如：甲病毒属基因检测芯片：Designed oligo microarray by analyzing all alphavirus sequences. Designed consensus amplification pr
23、imers within NSP4. Printed 12,000 unique & consensus oligos (35mers) within this region on a standard slide array.DNA 芯片 DNA MicroarrayLAMP技术技术，是一种特殊的等温核酸扩增技术，2000年初由日本人发明（Nucleic Acids Res. 2000 June 15; 28(12): e63.），实验中通过设计一对特殊的引物和一对普通引物，该对特殊的引物在特异扩增中可与产物形成一个回文环，这对引物又可以与形成的回文环核酸产物在同温状态下进行相对无限的置换扩
24、增。最终，扩增产物在核酸电泳胶上形成连续的梯状条带 这项技术与其它常规的核酸扩增技术相比，具有特异性强、灵敏度高、检测快速方便，硬件设施要求低等特点。 检测时间可缩短到两小时内，灵敏度可达到检测10个以下拷贝的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外对硬件设施基本无特殊要求，在普通的生物学实验室就可以完成。 在实验实施过程中只需要一步就可以完成操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。连环恒温扩增技术 Loop-mediated isothermal amplification, LAMPD2 Strains, Biting midge, 2002, G32 Strains, Ae.ve
25、xans, 2002, G31 Strain, Human brain, 1950s, G31 Strain, Human brain, 1960s, G31 Strain, Culex modestus, 2002, G11 Strain, Culex pipiens pallens, 2002,G1 1 Strain, Human brain, 1971, G32 Strains, Human brain, 1949, G3Beijing-1 and P31 Strain, Human brain, 1960s, G31 Strain, Mosquito pool, 1960, G3Vac
26、cine - SA14-14-23 Strains, Culex, 2004, G17 Strains, Culex tritaeniorhynchus, 2001, G19 Strains, Culex tritaeniorhynchus, 2003, G13 Strains, Culex tritaeniorhynchus, 2004, G31 Strain, Culex tritaeniorhynchus, 2005, G11 Strain, Human brain, 1987, G35 Strains, Culex, 1 Strain, Armigeres, 2004, G11 Str
27、ain, Human brain, 1957, G33 Strains, Culex, 2 strains, Armigeres, 2004, G32 strains, Armigeres, 2004, G31 strain, Mosquito pool, 2 strains, Human brain, 1954, G34 strains, Human brain, 1strain, Human blood, 1955, G31 strain, Human brain, 1957, G35 strains, Human blood, 1 strain, Human CSF, 2002, G31
28、1strains, Human blood, 2003, G31 strain, Human brain, 1954, G3 8 strains, 1979, 1980s, G11 strain, Mosquito pool, 1998, G312 strains, Mosquito pools, 2004, G320 strains, Culex tritaeniorhynchus, 2005, G1 3 strains, Armigeres, 2005, G1 2 strains, Culex tritaeniorhynchus, 2006, G13 strains, Culex trit
29、aeniorhynchus, 2005, G12 strains, Culex tritaeniorhynchus, 2006, G1HeilongjiangJilinLiaoningNeimengguShandongHebeiBeijingTianjinShanxiShaanxiHenanSichuanHubeiHunanGuizhouNingxiaJiangxiFujianJiangsuZhejiangGuangdongTaiwanHainanGuangxiYunnanXinjiangQinghaiXizangShanghaiAnhuiGansuNo JE virusNewly speci
30、mens collected locationsOld specimens collected locationsOnly genotype 3 Only genotype 1Co-circulation of genotype 1 and 3No JEV areaDistribution of two genotype (1 and 3) of JEV in China捕获法ELISA的原理一级信号放大三级信号放大二级信号放大四级信号放大试验仪器和器材病毒性脑炎的监测工作 我国地域辽阔，地理景观丰富，传播媒介众多，可能存在多种虫媒病毒性脑炎 除乙型脑炎外，每年仍然有数万例病毒性脑炎，但由于受检测技术的限制，能够作出病原诊断的只有40左右，大部分病例还只有临床诊断 在我国开展不明原因病毒性脑炎的监测，了解不明原因病毒性脑炎的病原分类、流行现状等非常必要，以便能采取相应的控制措施，确保人民健康 病毒性脑炎的监测工作 了解全国不明原因病毒性脑炎的发病现状、疫情 动态和流行规律 了解我国病毒性脑炎病原学型别、分布及变异情况 为防治不明原因病毒性脑炎提供科学依据 谢谢 谢谢 大大 家家王环宇中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒性脑炎实验室电话：010-63581301手机：13621199546E-mail：
