1、乙型肝炎病毒cccDNA检测方法一、几个相关问题简介什么是HBV cccDNA? 即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒的复制过程我们为什么要关注HBV cccDNA? cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池” 目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA 的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原
2、因之一 肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源 还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?研究和开发该检测技术的时间不长检测技术上的难度较大前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，不能满足临床检验的需求现有技术灵敏度不高，检测低限104 copy /ml左右分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足，存在缺陷多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、 rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必须有 效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA如何进一步解决特异性的问题？如何解决灵敏度不高的问题（细
3、胞内cccDNA 含量的较低），血清中含量？如何简化检测步骤？建立cccDNA检测技术必须克服的难点cccDNAcccDNArcDNArcDNA核酸一级结构核酸一级结构完整的双链完整的双链两条链均不完整两条链均不完整核酸空间结构核酸空间结构闭合环状，超螺旋闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合是否与蛋白质结合不结合不结合共价结合共价结合对某些核酸酶抗性对某些核酸酶抗性强，不容易被降解强，不容易被降解弱，容易被降解弱，容易被降解分离cccDNA和rcDNA的分子基础分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异二、HBV cccDNA检测技术1.选择性PCR(
4、普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invader assaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介现有的几种cccDNA检测技术简介选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invader assaay）3.嵌合引物荧光PCR法设计一对特殊引物：跨双缺口引物 正义引物P1 ：与负链互补结合，位于正 链缺口上游 反义引物P2 ：与正链互补结合，位于负 链缺口下游目的：rcDNA不被扩增1.选择性PCR选择性PCR：rcDNA不被扩增选择性PCR：cccDNA能被扩增PCR产物自身退火（self annealing）“选择性”P
5、CR：并非万无一失 rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠 Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC） World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清)l Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copy Hepatology 1996;23:405-413 血清HBV rcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性“选择性”PCR：并非万无一失 与定性法比较增加了一个荧光探与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口针，探针位于扩增片段区（负链缺口
6、下游），与下游），与cccDNAcccDNA的负链互补。的负链互补。选择性实时荧光定量PCR检测cccDNArcDNA不能被扩增无荧光信号EcoR I5+P1 P2 3200(1)53159031820P118201590+ 3200（1）EcoR I P2cccDNA能被扩增检测到荧光信号选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的原理l 标准曲线方程标准曲线方程Y YCtCt= 42.0827-3.5554logX= 42.0827-3.5554logXcopycopyl 相关指数：相关指数： R R2 2=0.995=0.9
7、95l 灵敏度至少可以达到灵敏度至少可以达到10103 3copy/ml copy/ml 结果 ： 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA 非特异性扩增的问题由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普 通PCR更高缺陷：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA质粒标准品107copy/ml3.5108copy/ml携带者血清质粒标准品105copy/ml105107copy/ml携带者血清选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA解决方案l 特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法l 酶切纯化cccDNA 采用绿豆
8、核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)侵入者探针法（Invader assaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介2.侵入者探针法(Invader assay)两个体系： 两种特殊的探针：invader probe和primary probe，后者含与待测模板无关的5侧翼的碱基片段。 荧 光 共 振 能 量 转 移 系 统 ： 被 核 酸 内 切 酶 (cleavase,裂解酶)特异地切割5侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC
9、）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。特点：一个模板可以重复使用，每“结合裂解结合裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点优点：线性信号放大，特异性比荧光 PCR法强缺点：灵敏度低：104copy/ml1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者分析法（Invader assaay）嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介3. 嵌合引物荧光PCR法Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52+PNN：与HBVDNA非同源片段5N
10、533p+rcDNAcccDNAPNNP253533. 嵌合引物荧光PCR法 嵌合引物荧光PCR的优缺点 优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高 缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNA被非特异性扩增 无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。三、影响cccDNA池的因素1.cccDNA池的自身恒定 cccDNA池：感染肝细胞核内HBV cccDNA的 含量在无外来干扰的情况下保 持恒定(550copy/cell) 病毒自身调节：关于病毒的进化 关于
11、病毒的“思维” 病毒自身的调节 外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果2.抗病毒药物对cccDNA的影响l现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNAl细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性3.肝外组织也是cccDNA的储存池？肝外组织细胞中HBV标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺 等组织或细胞中均检测到HBV的标志物HBV吸附？暂居？建立感染状态？ 依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA， 但必须解决检测技术问题(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题 “血清中rcDNA含量越高，cccDNA阳性率 越高和含量越高”的现象，使我们对方法 学提出质疑肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放 cccDNA入血细胞坏死后，cccDNA释放入血是必然的， 但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少 时间？
