1、原代神经细胞培养原代神经细胞培养原代培养细胞的生命归宿l原代培养期原代培养期l传代期传代期l衰退期衰退期u贴附生长型细胞贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。稳定形态的细胞。见于各种实体瘤细胞见于各种实体瘤细胞u悬浮生长型细胞悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各见于各种造血系统肿瘤细胞种造血系统肿瘤细胞 培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生长方式及类型贴附生
2、长型细胞贴附生长型细胞细胞培养常用的培养瓶、细胞培养常用的培养瓶、培养皿、培养皿、6孔板、孔板、96孔板孔板+ + + + + + + + + + +细胞的贴附过程细胞的贴附过程贴附物质带正电荷贴附物质带正电荷细胞带负电荷细胞带负电荷悬浮生长型细胞悬浮生长型细胞 每代贴附生长细胞的生长过程l游离期游离期l贴壁期贴壁期l潜伏期潜伏期l对数生长期对数生长期l停止期（平台期）停止期（平台期）游离期：游离期：l细胞接种后在培养液中呈悬浮细胞接种后在培养液中呈悬浮 状状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。体呈圆球形。l 10分钟一分钟一4小时小时贴壁期：贴壁期：l
3、细胞附着于底物上，游离期 结束。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等l血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白先吸附于底物上，悬浮细胞再与底物附着。l进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。 对数生长期：对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：停止期（平台期）：l细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂分裂l机制：接触抑制、密度
4、依赖性机制：接触抑制、密度依赖性原代神经细胞培养操作步骤原代神经细胞培养操作步骤1. 超净台紫外灯照射消毒，至少超净台紫外灯照射消毒，至少30分钟，开恒温水浴箱至分钟，开恒温水浴箱至372. 取出高糖取出高糖DMEM、FBS、胰蛋白酶复温。、胰蛋白酶复温。3. 取新生鼠取新生鼠1只，只，0.5%的碘伏消毒，断头，取整脑于含的碘伏消毒，断头，取整脑于含5ml的的DMEM液培养皿中，分离大脑皮质于含液培养皿中，分离大脑皮质于含1ml DMEM液液的另一培养皿（培养皿均置于冰盒上的另一培养皿（培养皿均置于冰盒上)。4. 弯头剪刀尽可能剪碎组织。弯头剪刀尽可能剪碎组织。5. 向剪碎的组织中另加向剪碎的
5、组织中另加DMEM4ml，全部吸入离心管，加，全部吸入离心管，加5ml胰蛋白酶。胰蛋白酶。6. 置置37水浴中水浴中15分钟。分钟。7. 加含加含10%FBS的的DMEM10ml，吸管轻匀吹打，吸管轻匀吹打，尽量使组织分散。尽量使组织分散。8. 离心离心1500rpn，5分钟。分钟。9. 弃上清，加弃上清，加10mlDMEM10%FBS，吸管轻匀吹，吸管轻匀吹打，打，200目滤网过滤，取少量滤液镜下细胞计数。目滤网过滤，取少量滤液镜下细胞计数。10. 以以105的接种于培养瓶中，标记后置的接种于培养瓶中，标记后置37，含，含5%CO2培养箱培养。培养箱培养。11. 12-24小时后，换液观察。
6、小时后，换液观察。 细胞计数细胞计数 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。胞数表示。l血细胞计数器：手工计数细胞血细胞计数器：手工计数细胞lCoulter计数仪：人工计数计数仪：人工计数计数原则：计上不计下，计左不计右。计数原则：计上不计下，计左不计右。细胞数（细胞数（ml）4大格细胞总数大格细胞总数/ 410000注意：镜下由两个以上细胞组成的细胞团应按单个细胞计算注意：镜下由两个以上细胞组成的细胞团应按单个细胞计算 在细胞群体中总有一些因
7、各种原因而死亡的细胞，总在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。而可以区分死细胞与活细胞。注意事项：注意事项：l无菌操作原则培养细胞生长的条件u细胞的营养需要（细
8、胞的营养需要（培养基，血清，添加因子等培养基，血清，添加因子等）u细胞的生存环境细胞的生存环境 温度温度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压渗透压u无污染无污染u无毒无毒无无 毒毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与无毒是培养细胞的必需条件。凡与 细胞直接或间接接触的东西都必须细胞直接或间接接触的东西都必须 是无毒的。是无毒的。无污染无污染微生物的污染微生物的污染不同细胞类型的交叉污染不同细胞类型的交叉污染细菌细菌霉菌霉菌支原体等支原体等细菌污染细菌污染 能改变培养液的pH值，使培养液变混浊。 细菌生长迅速，能消耗营养液
9、和产生毒素。 抑制细胞的生长，毒性大的细菌可很快导致细胞崩解死亡。细 菌 污 染霉霉 菌菌 污污 染染荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体染色法，附于胞质上黑点为支原体扫描电镜法显示支原体扫描电镜法显示支原体附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体细胞传代培养细胞传代培养 培养细胞的生长过程 单个细胞的生长过程单个细胞的生长过程 细胞系的生长过程细胞系的生长过程n 细胞周期间期间期M期（期（有丝分裂期）G1期（ DNA合成前期） S期（ DNA合成期 ）G2期（ DNA合成后期）n 细胞系的生长过程细胞系
10、的生长过程原代培原代培养期养期传代期传代期衰退期衰退期为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期至第一次传代的时期原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，此时应将原代细胞分开接种至此时应将原代细胞分开接种至2个或更多的个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，然存活，但增殖已很缓慢并逐
11、渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。进而细胞发生衰退死亡。传传 代代 培培 养养 当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养。传代培养的累积次数就是细胞的代数，一般细胞的代数为50代。 细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。种。 1 悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（1000转转/分分）去上清，沉淀物加新培养液）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除直
12、接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3 贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法1.吸光培养瓶中的培养液。吸光培养瓶中的培养液。2. 用无钙镁
13、离子的用无钙镁离子的PBS清洗细胞清洗细胞3遍遍.3 . 加入加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置瓶底为准），静置1-2 min（显微镜下动态监测）。（显微镜下动态监测）。4. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。吸去胰蛋白酶液，加入培养液。5. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。胞悬液。6. 吸取吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。细胞悬液，接种于新的培养瓶内。7. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶
14、内。8. 将后者放入培养箱中培养。将后者放入培养箱中培养。细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏细胞冻存和复苏l细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。l细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。细胞冻存方法1.预先配制冻存液：预先配制冻存液： 含含20%血清培养基血清培养基 10% DMSO 2. 取对数生长期细胞，取对数生长期细胞，PBS清洗清洗3遍遍3. 胰酶消化，离心弃上清，胰酶消化，离心弃上清，加入适量冻存液加入适量冻存液, 用吸管吹用吸管吹打制
15、成细胞悬液（打制成细胞悬液（1106 5 106细胞细胞/ml)3 .加入加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。称和冷冻日期。 4年后，存活率可达年后，存活率可达80100。 DMSO液用培养液提前配好，液用培养液提前配好， 避免因临时配制避免因临时配制产热而伤害细胞。产热而伤害细胞。冻存和复苏的原则：慢冻快融u当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 u如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，
16、细胞内不致产生大的如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大。大结晶会造成细胞膜、细胞器的损冰晶；相反结晶就大。大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。伤和破裂。u复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶（让冰晶快速升华）。的重结晶（让冰晶快速升华）。慢冻程序标准程序：标准程序：l当温度在-25 以上时， 12 /minl当温度达-25 以下时， 510 /minl当温度达-100时，可迅速放入液氮中l细胞冻存器简易程序：简易程序：l 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布
17、袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。低温保护剂的应用l在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。存效果。l常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（水浴中，使其融化（1分钟左右）。分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。倍以上。（3）低速离心）低速离心10分钟。分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
