1、从药学的观点评价血凝酶从药学的观点评价血凝酶 蛇毒中除含有神经毒性多肽生物活性物质和蛋白质外，蛇毒尚含有多种影响凝血过程蛋白水解酶。这些蛋白水解酶参与体外凝血，存在于多种蛇毒中，本质属于丝氨酸蛋白酶是一种结构至少部分与凝血酶相似的多功能蛋白酶。在凝血过程中发挥重要作用（包括凝血与抗栓），故被命名为蛇毒类凝血酶。 现有40余种类凝血酶被分离与鉴定 具有相同活性部位序列模序 57位组氨酸 102位天东氨酸 195位丝氨酸 与蛇毒类凝血酶相对应的哺乳动物的相似物为胰蛋白酶。 影响止血过程的多个环节 凝血因子活化 血小板聚集的诱导 与神经以及补体系统功能相关 主要来源于响尾蛇亚科 分布于下列科属 蝮蛇
2、属 响尾蛇属 黄颌蝮蛇属 具窍蝮蛇属 叶林蝮蛇属 亚洲腹属对凝血过程的影响（一） 体外具有与凝血酶类似活性使血液凝固，所以称之为类凝血酶（Thrombin-Like Enzeme简称TLE)。 机制：催化纤维蛋白原分子特定部位Arg-Gly的裂介释放出血纤肽导致纤维蛋白单位首尾聚合物而凝固。对凝血过程的影响（二） 体内表现为抗凝作用 机制：体内不激活凝血因子可不通过体内各种凝血因子，直接使纤维蛋白原凝聚，生成纤维蛋白凝块，不产生侧链交联，易被网状内皮系统或正常纤溶作用清除，故表现为抗凝作用。对凝血过程的影响（三） 由于蛇毒类凝血酶对凝血过程作用多样性，故根据蛇毒类凝血酶特性，分为下列二大类：
3、作用 促凝作用 抗凝、溶栓作用 分类 血凝酶巴曲酶 降纤、溶血作用类凝血酶 1936年奥地利学者Klobusitzky和Konig首次从巴西矛头蝮蛇酶（Bothropsatnox）分离得到一种具有促凝特性的类凝血酶，先命名为凝酶，后由世界卫生组织命名为巴曲酶（Batroxobin）。 国际血栓形成与止血委员会确定血凝酶（Hemocoagulase）专指从巴西矛头蝮蛇蛇毒内分离提取的巴曲酶和微量FXA组成的复方制剂，在体内发挥止血作用。血凝酶 商品名：巴曲亭或立止 血 定义：是指从巴西矛头蝮蛇蛇毒内分离提取的巴曲酶制剂，含微量的磷脂依赖性凝血因子X激活物（FXA） 止血特点：是止血的经验性首选药
4、物, 止血安全、迅速白眉蛇毒血凝酶 原名：注射用白眉蛇毒凝血酶 商品名：邦亭 原料来源：长白山白眉蝮蛇的毒液 组成成分：含有类凝血酶和类凝血激酶的复合制剂 二者对比分析 组成成分 质量标准 作用机制组成成分血凝酶 巴曲酶和微量的FXA 巴曲酶的相对分子质量为3900043000，由17种氨基酸组成，总氨基酸数为231个，纯度在90以上，5g电泳呈一条带，是一种单链糖蛋白 FXA纯度为0.5%，相对分子质量为790005000组成成分白眉蛇毒血凝酶组成成分白眉蛇毒血凝酶 SDSPAGE电泳检测含有3 种组分 ,由类凝血酶、类凝血激酶和未知成分组成 相对分子质量分别为 540005000，3400
5、05000 和150003 000 ,相对百分含量为 7.0% 12.0%，76.0% 82.0 %和 7.0 % 12.0 % ,但并未明确指类凝血酶或类凝血激酶所对应的组分，也未见有类凝血激酶的相关报道组成成分白眉蛇毒血凝酶组成成分白眉蛇毒血凝酶 长白山白眉蝮蛇长白山白眉蝮蛇 Agkistrodon halysAgkistrodon halys(pallas) (pallas) 蛇毒中存蛇毒中存在在 2 2 种与凝血相关物质种与凝血相关物质 其一为类凝血酶其一为类凝血酶 ( thrombin like) ,( thrombin like) ,是单链糖蛋白是单链糖蛋白 , ,相对分相对分子子
6、 质量为质量为43000,43000,总氨基酸数为总氨基酸数为236 236 个个 另一种为凝血酶原激活物另一种为凝血酶原激活物 ( prothrombin activator) , ( prothrombin activator) , 相相对分子质量为对分子质量为6300063000 两者有着不同于矛头蝮蛇中相应成分的酶学性质两者有着不同于矛头蝮蛇中相应成分的酶学性质 特别是类凝血酶特别是类凝血酶 , ,对纤维蛋白原的降解机制与巴曲酶是截然不对纤维蛋白原的降解机制与巴曲酶是截然不同的同的 。N N 末端氨基酸末端氨基酸 巴曲酶：巴曲酶：V IGGD ECD IN EH PFLA FM YYS
7、PR V IGGD ECD IN EH PFLA FM YYSPR YFCGM TLYFCGM TL 白眉蝮蛇类凝血酶：白眉蝮蛇类凝血酶： MV IGGD EC N IN EHR MV IGGD EC N IN EHR FLVAL YTSR TL FCGGTFLVAL YTSR TL FCGGT 二者有一定程度的同源性，二者有一定程度的同源性，6868 但是从根本上说两者是完全不同的但是从根本上说两者是完全不同的2 2种物质种物质 作用机制血凝酶作用机制血凝酶 血凝酶中的巴曲酶能使纤维蛋白原血凝酶中的巴曲酶能使纤维蛋白原 A a A a 链上的链上的 Arg16Arg16Gly17 Gly17
8、 处降解处降解 , ,释放出纤维蛋白肽释放出纤维蛋白肽 A , A , 生成不稳定的可溶性的纤维生成不稳定的可溶性的纤维蛋白蛋白 I I单体单体 , ,在血管破损处的可溶性纤维蛋白在血管破损处的可溶性纤维蛋白 I I单体聚合成纤单体聚合成纤维蛋白维蛋白I I多聚体多聚体 , ,纤维蛋白纤维蛋白I I多聚体能促进血管破损处的血小板多聚体能促进血管破损处的血小板聚集聚集 , ,加速血小板止血栓形成加速血小板止血栓形成 , ,并在血管破损处生理性止血过并在血管破损处生理性止血过程形成的凝血酶作用下纤维蛋白程形成的凝血酶作用下纤维蛋白I I迅速降解释放出纤维蛋白肽迅速降解释放出纤维蛋白肽B ,B ,从
9、而生成可溶性纤维蛋白从而生成可溶性纤维蛋白IIII单体单体 , ,后者在凝血因子后者在凝血因子XIIIa XIIIa 及及Ca2 + Ca2 + 作用下交作用下交 联聚合成难溶性纤维蛋白联聚合成难溶性纤维蛋白 ( F)( F)丝丝 , ,交织成交织成网网 , ,网罗血浆血细胞等网罗血浆血细胞等 , ,起止血作用。起止血作用。 血凝酶内的血凝酶内的FXA FXA 在血管破损处可激活凝血在血管破损处可激活凝血X X因子为有活性的凝因子为有活性的凝血因子血因子X,X,从而间接促进凝血酶原转变为凝血酶达到迅从而间接促进凝血酶原转变为凝血酶达到迅 速止血速止血效应。效应。 作用机制血凝酶作用机制血凝酶作
10、用机制白眉蛇毒血凝酶作用机制白眉蛇毒血凝酶 其说明书中没有说明白眉蛇毒血凝酶其中的类凝血酶是其说明书中没有说明白眉蛇毒血凝酶其中的类凝血酶是如何作用于纤维蛋白原的如何作用于纤维蛋白原的 实际上大部分蛇毒类凝血酶仅裂解纤维蛋白肽实际上大部分蛇毒类凝血酶仅裂解纤维蛋白肽 A ,A ,部分部分蛇毒类凝血酶不但裂解纤维蛋白肽蛇毒类凝血酶不但裂解纤维蛋白肽 A ,A ,同时还裂解纤维同时还裂解纤维蛋白肽蛋白肽B B。优先裂解纤维蛋白肽。优先裂解纤维蛋白肽 A ,A ,随后释放纤维蛋白肽随后释放纤维蛋白肽 B B的类凝血酶与凝血酶非常相似的类凝血酶与凝血酶非常相似 白眉蛇毒血凝酶内的类凝血酶虽然具有和巴曲
11、酶同样的白眉蛇毒血凝酶内的类凝血酶虽然具有和巴曲酶同样的体外凝结血浆作用体外凝结血浆作用 , ,但是但是2 2 种酶在这一点上的机制却是种酶在这一点上的机制却是相反的相反的 作用机制白眉蛇毒血凝酶作用机制白眉蛇毒血凝酶 血流动力学分析显示血流动力学分析显示 , ,白眉蛇毒血凝酶中的类凝血白眉蛇毒血凝酶中的类凝血酶作用纤维蛋白原优先释放纤维蛋白肽酶作用纤维蛋白原优先释放纤维蛋白肽B ,B ,经过一段经过一段延滞期后才是纤维蛋白肽延滞期后才是纤维蛋白肽A A的释放。失去了纤维蛋白的释放。失去了纤维蛋白肽肽B B的纤维蛋白的纤维蛋白 , ,其释放纤维蛋白肽其释放纤维蛋白肽A A的速度降低的速度降低
12、, , 从而影响纤维蛋白单体的聚合从而影响纤维蛋白单体的聚合 , , 使形成的凝块更为使形成的凝块更为脆弱。脆弱。 随之产生的凝血机制与巴曲酶势必是不同的随之产生的凝血机制与巴曲酶势必是不同的 。作用机制白眉蛇毒血凝酶作用机制白眉蛇毒血凝酶 其内的类凝血激酶是能够促进凝血酶原激活为凝血其内的类凝血激酶是能够促进凝血酶原激活为凝血酶酶 , ,从而促进血液凝固的一类酶从而促进血液凝固的一类酶 它是一种金属蛋白酶它是一种金属蛋白酶 , ,很容易被乙二很容易被乙二 胺四乙酸胺四乙酸 ( ED TA )( ED TA )所抑制所抑制 纯化后的纯化后的“类凝血激酶类凝血激酶”不能作用于其他凝血因子不能作用
13、于其他凝血因子 , ,如凝血因子如凝血因子 X,X,也不能水解纤维蛋白原也不能水解纤维蛋白原 质量标准鉴别项血凝酶质量标准鉴别项血凝酶 根据蛇毒血凝酶质量标准根据蛇毒血凝酶质量标准 WS-349(X-317) - WS-349(X-317) -2001 , 2001 , 血凝酶的鉴别项规定血凝酶的鉴别项规定 : : 每支加水每支加水0.5 mL0.5 mL溶解后溶解后 , , 取取0.1mL0.1mL加加0.3mL0.3mL人枸人枸橼酸血浆橼酸血浆 , ,应在应在30s30s内凝固内凝固 。 质量标准鉴别项白眉蛇毒血凝酶质量标准鉴别项白眉蛇毒血凝酶 注射用白眉蛇毒凝血酶质量标准注射用白眉蛇毒凝
14、血酶质量标准WS-447 (X-398)-2001WS-447 (X-398)-2001中白眉蛇毒血凝酶的鉴别项规定中白眉蛇毒血凝酶的鉴别项规定: : 取本品取本品1 1支支 , ,加水加水1mL1mL溶解溶解 , ,取取 0.2 mL0.2 mL加入加入0.2 mL 0.2 mL 人血人血浆浆 , , 置于置于3737水浴中应在水浴中应在1min1min内凝固内凝固 , ,加入加入5moL.L -15moL.L -1尿素溶液尿素溶液1mL ,1mL ,振摇振摇 , ,凝块应在凝块应在3min3min内溶解内溶解 此种鉴别的方法与降纤酶质量标准此种鉴别的方法与降纤酶质量标准 WS1-XG-03
15、1-2000WS1-XG-031-2000中降纤酶的鉴别项原理和方法基本相同中降纤酶的鉴别项原理和方法基本相同 质量标准控制关键性指标质量标准控制关键性指标 血凝酶的纯度测定项规定应出现血凝酶的纯度测定项规定应出现 1 1条电泳带条电泳带 , ,相相对分子质量为对分子质量为360003600050005000 白眉蛇毒血凝酶的纯度测定项规定应出现白眉蛇毒血凝酶的纯度测定项规定应出现3 3条电条电泳带泳带 , ,相对分子质量分别为相对分子质量分别为 54000 540005000 , 5000 , 34000 34000 50005000和和15000150003 000 3 000 结结 论论
16、 综上提示白眉蛇毒血凝酶与血凝酶不是同一种药品综上提示白眉蛇毒血凝酶与血凝酶不是同一种药品 , ,而而是另外一种从蛇毒提取的含有类凝血酶和类凝血激酶的是另外一种从蛇毒提取的含有类凝血酶和类凝血激酶的具有止血作用的多种组分复合制剂具有止血作用的多种组分复合制剂 , ,其临床疗效和全性其临床疗效和全性需进一步研究和大量实验证明需进一步研究和大量实验证明 。 据有关报道据有关报道 , ,白眉蛇毒提取物可激活凝血因子白眉蛇毒提取物可激活凝血因子XIII,XIII,有导有导致弥漫性血管内凝血致弥漫性血管内凝血(DIC)(DIC)的危险。因此，为了保证广大的危险。因此，为了保证广大人民用药安全人民用药安全
17、 , ,有关白眉蛇毒血凝酶的使用问题不能简有关白眉蛇毒血凝酶的使用问题不能简单只根据它的名称认为其为单只根据它的名称认为其为“血凝酶血凝酶 ” ”。血凝酶的酶学特征血凝酶的酶学特征 血凝酶为单链糖蛋白，由血凝酶为单链糖蛋白，由1717种氨基酸组成，种氨基酸组成，总氨基酸数为总氨基酸数为231231个，它的分子量为个，它的分子量为43000(SDS-43000(SDS-PAGE),PAGE),等电点在等电点在6 67 7之间，分子中含之间，分子中含6 6个二硫键、个二硫键、27%27%的碳水化合物，碳水化合物由己糖、葡萄糖的碳水化合物，碳水化合物由己糖、葡萄糖胺和唾液酸组成，糖蛋白由胺和唾液酸组
18、成，糖蛋白由1717种氨基酸组成。种氨基酸组成。血凝酶的稳定性与活性血凝酶的稳定性与活性 血凝酶在血凝酶在2020时，时，pHpH为为2.5 9 2.5 9 的水溶液中数小时的水溶液中数小时仍很稳定；在仍很稳定；在100100甘油中加热一小时，其活性仍无变化；甘油中加热一小时，其活性仍无变化；血凝酶制剂的冻干品在血凝酶制剂的冻干品在2525以下，可以长期保存。以下，可以长期保存。 每支血凝酶（巴曲亭）含量为每支血凝酶（巴曲亭）含量为1 1克氏单位。克氏单位。1 1单位的巴单位的巴曲亭冻干粉注射剂是指在曲亭冻干粉注射剂是指在3737下，其溶液下，其溶液1ml1ml能使能使1ml1ml含含枸橼酸的
19、标准人体血浆在枸橼酸的标准人体血浆在6060秒发生凝结的酶活性量。秒发生凝结的酶活性量。血凝酶药效学血凝酶药效学 注射用血凝酶对家兔全血凝固时间的影响注射用血凝酶对家兔全血凝固时间的影响组别组别n n 家兔血小板数家兔血小板数量量（10109 9/L/L） 给药前给药前 给药后给药后1 1小时小时给药后给药后3 3小时小时血凝酶毒理研究血凝酶毒理研究 对小鼠进行急性毒性试验未能测出对小鼠进行急性毒性试验未能测出LD50LD50。给血凝酶的最大。给血凝酶的最大浓度浓度40ku/kg40ku/kg，最大给药容积为，最大给药容积为0.44ml/0.44ml/只只 ，相当人体剂量的，相当人体剂量的倍数
20、倍数2000 2000 ，给药后小鼠活动减少，或闭目思睡状，给药后小鼠活动减少，或闭目思睡状，10151015分分钟逐渐恢复正常活动，连续观察钟逐渐恢复正常活动，连续观察7 7日，小鼠活动、饮食、毛色日，小鼠活动、饮食、毛色光泽均恢复正常。光泽均恢复正常。 用灵长类动物黄狒狒作亚急性或慢性毒性试验，每天每用灵长类动物黄狒狒作亚急性或慢性毒性试验，每天每公斤体重静脉注射公斤体重静脉注射0.030.03、0.30.3、3ku,3ku,共三个月试验，一切正常，共三个月试验，一切正常，对尿常规、血常规及血液生化的检查，均未见有任何变化。说对尿常规、血常规及血液生化的检查，均未见有任何变化。说明血凝酶制
21、剂亚急性或慢性毒性也非常小。明血凝酶制剂亚急性或慢性毒性也非常小。血凝酶药代动力学血凝酶药代动力学 血液中的血凝酶能与血浆血液中的血凝酶能与血浆2-2-巨球蛋白结合成无活性的复合物，巨球蛋白结合成无活性的复合物，迅速从血液循环中清除而被肝、脾、肾中的单核巨嗜细胞系统迅速从血液循环中清除而被肝、脾、肾中的单核巨嗜细胞系统摄取、代谢，其代谢产物由肾脏排泄，摄取、代谢，其代谢产物由肾脏排泄，3-43-4天后全部消除。动天后全部消除。动物实验（狗）表明巴曲亭的半衰期物实验（狗）表明巴曲亭的半衰期3-103-10小时，无蓄积作用（中小时，无蓄积作用（中国药房国药房 19961996，7 7：137-13
22、8137-138）。）。 巴曲亭在体内的起效和作用维持时间取决于给药途径。巴曲亭在体内的起效和作用维持时间取决于给药途径。 给药途径给药途径 起效时间起效时间 峰值出现时间峰值出现时间 峰值维持时间峰值维持时间 作用消失时间作用消失时间 静脉注射静脉注射 5-10min 20-30min 2h 24h5-10min 20-30min 2h 24h 肌肉注射肌肉注射 20-30min 45min 24h 36-72h20-30min 45min 24h 36-72h 巴曲亭作用机理（一）巴曲亭作用机理（一）巴曲亭作用机理（二）巴曲亭作用机理（二）纤维蛋白原纤维蛋白原FImFIIm纤维蛋白凝块纤维
23、蛋白凝块去A肽去B肽XIII凝凝血血酶酶立立止止血血纤维蛋白原纤维蛋白原FImFIIm纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块去A肽去B肽XIII凝凝血血酶酶巴巴曲曲亭亭凝凝血血酶酶矛头蝮蛇矛头蝮蛇巴曲酶巴曲酶FXA纤维蛋白原纤维蛋白原FImFIIm纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块去A肽去B肽XIII凝凝血血酶酶立立止止血血纤维蛋白原纤维蛋白原FImFIIm纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块去去 肽去B肽XIII凝凝血血酶酶巴巴曲曲亭亭凝凝血血酶酶矛头蝮蛇矛头蝮蛇巴曲酶巴曲酶FXA血凝酶不会在正常血管系统内形成血栓血凝酶不会在正常血管系统内形成血栓 由于没有凝血酶的产生，纤维蛋白由于没有凝血酶的产生，纤维蛋白单体不会生成纤维蛋
24、白单体不会生成纤维蛋白单单体，也不会有纤维蛋白体，也不会有纤维蛋白多聚体及难溶性纤维蛋白丝的产生多聚体及难溶性纤维蛋白丝的产生 血凝酶的凝血作用只有在生成的血凝酶的凝血作用只有在生成的FImFIm与与FgFg的比例大于的比例大于1:51:5时才会出时才会出现。在血管损伤处由于血小板聚集而使血流减弱现。在血管损伤处由于血小板聚集而使血流减弱,Fg,Fg数量因此减少数量因此减少, ,而巴曲酶能使而巴曲酶能使FgFg裂解出裂解出FImFIm又进一步使其减少又进一步使其减少, ,在它的持续作用下在它的持续作用下,Fg,Fg不断减少不断减少,FIm,FIm不断增加并最终使不断增加并最终使FImFIm与与
25、FgFg的比例大于的比例大于1:51:5而产生血凝而产生血凝块。块。 纤维蛋白纤维蛋白多聚体可被内皮网状系统吞噬，并诱导多聚体可被内皮网状系统吞噬，并诱导t-PAt-PA激活纤激活纤溶酶原形成纤溶酶，被纤溶酶裂解为降解产物（溶酶原形成纤溶酶，被纤溶酶裂解为降解产物（FDPFDP），从而预防血），从而预防血管内凝血。管内凝血。 不释放凝血因子不释放凝血因子，无血小板磷脂反应表面暴露，凝血因子，无血小板磷脂反应表面暴露，凝血因子不会被激活，不会生成凝血酶不会被激活，不会生成凝血酶 处方管理办法（中华人民共和国卫生部令第处方管理办法（中华人民共和国卫生部令第53号）号） 2007214 处方常用药品
26、通用名目录处方常用药品通用名目录 2007316 卫生部关于印发处方常用药品通用名目录的通知卫生部关于印发处方常用药品通用名目录的通知 2007326 国家基本药物国家基本药物 新编药物学（新编药物学（1616版）版） 马丁代尔马丁代尔大药典大药典 中国药品通用名称中国药品通用名称 国际非专利药品名（国际非专利药品名（INNINN）新编药物学 16版 568页 血凝酶【基】血凝酶【基】Hemocoagulase 血凝酶是以从巴西矛头蛇（血凝酶是以从巴西矛头蛇（Bothrops atrox,又称大具窍又称大具窍蝮蛇）的毒液中分离、精制所得的一种巴曲酶蝮蛇）的毒液中分离、精制所得的一种巴曲酶（Ba
27、troxobin(1)）制成的制剂）制成的制剂.它是一种单链糖蛋白，它是一种单链糖蛋白，由由17种氨基酸组成，总氨基酸数为种氨基酸组成，总氨基酸数为231个，分子量个，分子量3900043000。 其他名称蛇凝血素酶、巴曲酶、其他名称蛇凝血素酶、巴曲酶、巴曲亭巴曲亭、Batroxobin、立芷雪、立止血、立芷雪、立止血、REPTILASE。新编药物学 16版 568页巴曲酶（巴曲酶（Batroxobin）是世界卫生组织（）是世界卫生组织（WHO）对毒蛇）对毒蛇Bothrops atrox(枪蝰枪蝰 、大具窍蝮蛇、矛头蛇、大具窍蝮蛇、矛头蛇)蛇毒中所含的纤维蛋蛇毒中所含的纤维蛋白原促凝蛋白酶（白
28、原促凝蛋白酶（fibrinogen coagulant proteinase）所命名的通）所命名的通用名（用名（INN）。）。经过一步研究发现经过一步研究发现Bothrops atrox有有5个亚种，有一种亚种个亚种，有一种亚种Bothrops moojeni蛇毒中所含的巴曲酶与来自蛇毒中所含的巴曲酶与来自B.atrox者在理化性质者在理化性质（分子量、电泳特性）、生化特点、作用等方面均不相同。由（分子量、电泳特性）、生化特点、作用等方面均不相同。由B.atrox蛇毒中分离到的巴曲酶具有促凝血特性，名为血凝酶，其商蛇毒中分离到的巴曲酶具有促凝血特性，名为血凝酶，其商品（专利）名为立芷雪（立止血
29、，品（专利）名为立芷雪（立止血，Reptilase）,而由而由B.moojeni蛇毒分离到的巴曲酶具有去纤维蛋白原作用，名为去蛇毒分离到的巴曲酶具有去纤维蛋白原作用，名为去纤酶（纤酶（defibrase）,如日本东菱药厂生产的东菱精纯克栓酶，二者如日本东菱药厂生产的东菱精纯克栓酶，二者的作用及应用各异，的作用及应用各异，而二者均曾简称为巴曲酶，欠妥，且易混淆，而二者均曾简称为巴曲酶，欠妥，且易混淆，宜注意。宜注意。SFDA目前批准并公布的药品通用名： “注射用血凝酶” “蛇毒血凝酶注射液” （立芷雪、巴曲亭） SFDA目前批准并公布的药品通用名： “注射用血凝酶“ “注射用白眉蛇毒血凝酶”（巴曲亭、立芷雪） （邦亭）SFDA目前批准并公布的药品通用名： “注射用血凝酶” “巴曲酶”（立芷雪、巴曲亭） （东菱迪芙）
