1、 Gen-Probe分枝杆菌快速检测仪分枝杆菌快速检测仪样本样本显微镜显微镜 (Ziehl.)敏感性低敏感性低敏感性高敏感性高2 到到8 周周改良罗氏培养基改良罗氏培养基 Coletsos液态培养基液态培养基(MGIT, Bactec, BacT Alert.)生化检测生化检测实验条件苛刻实验条件苛刻, 需数天需数天(Reference center)目视检测目视检测准确低准确低MTD2.5小时小时敏感性高敏感性高 特异性强特异性强Accuprobe 1 小时小时简单简单- 准确准确Gen-Probe检测分枝杆菌试剂类型检测分枝杆菌试剂类型l扩增扩增+杂交检测结核分枝杆菌复合菌杂交检测结核分枝
2、杆菌复合菌: AMPLIFIED MTD ( Gen-Probe) 临床痰标本临床痰标本(涂阳或涂阴涂阳或涂阴)l杂交检测分枝杆菌杂交检测分枝杆菌: ACCUPROBE Gen-Probe 培养阳性标本培养阳性标本 (菌落或肉汤菌落或肉汤)MTD (AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct) 检测检测M.tuberculosisM.tuberculosis 结核分枝杆菌结核分枝杆菌M.bovisM.bovis 牛分枝杆菌牛分枝杆菌 M.bovisM.bovis BCG BCG 牛分枝杆菌牛分枝杆菌BCGBCGM.africanumM.african
3、um 非洲分枝杆菌非洲分枝杆菌 M.microtiM.microti 田鼠分枝杆菌田鼠分枝杆菌 M.canettiM.canetti 卡氏分枝杆菌卡氏分枝杆菌Gen-Probe MTD检测检测4以以16S rRNA 为靶核酸为靶核酸4TMA ：转录介导扩增：转录介导扩增4 HPA：杂交保护分析：杂交保护分析RNA与与 DNAl DNA非常稳定，在死亡生物内也可存在非常稳定，在死亡生物内也可存在双链结构双链结构l RNA只存在于活细胞只存在于活细胞非常脆弱非常脆弱 (RNA容易受破坏容易受破坏)单链结构单链结构结核菌核酸结核菌核酸lRNARNA是是DNADNA的的4-54-5倍倍lrRNArRN
4、A占占80%80%Gen-Probe 扩增扩增 释放释放 rRNA rRNA 扩增物扩增物 超声波裂解超声波裂解样品样品细胞溶解细胞溶解目标目标 rRNA 释放释放TMA转录介导扩增转录介导扩增l2条引物：条引物： l2种酶：种酶： *逆转录酶逆转录酶(双功能双功能:逆转录和逆转录和RNAse H酶酶) (RNAse H：一种核糖核酸内切酶，特异性水解一种核糖核酸内切酶，特异性水解DNADNA：RNARNA杂交链上杂交链上RNARNA链的磷酸二链的磷酸二酯键，产生酯键，产生55核苷酸，该酶对单链核酸、双链核苷酸，该酶对单链核酸、双链DNADNA或双链或双链RNARNA没有作用没有作用) ) *
5、RNA聚合酶聚合酶l等温扩增：等温扩增：42RTRTRTRNA 合成酶RTRTTMA原理原理敏敏 感感 10 000 拷贝拷贝rRNACA TATA TG CG CA TT AA TCGT AG CG CG CA TATG CT AC GT ADNA扩增产物检测：扩增产物检测：HPA技术技术lHPA：杂交保护分析技术：杂交保护分析技术 标记标记AEHPA 步骤步骤杂杂 交交AE杂交杂交rRNA探针探针AEAEAEAEAEAEAE杂交温度的影响杂交温度的影响AEAEAE选选 择择AEAEAEAEAEAEAEAECH3N+OORH2O2 / OH-light检检 测测敏敏 感感 度度 比比 较较化
6、学发光化学发光10-19 mole辐射同位素辐射同位素 10-18 mole荧光荧光 10-12 mole比色比色 10-9 mole总总 结结l 靶核酸靶核酸: rRNAl 等温扩增，等温扩增，2种酶是关键（逆转录酶种酶是关键（逆转录酶(RNAse H)、RNA 聚合酶）聚合酶）l 扩增原理：扩增原理：TMA（转录介导扩增）（转录介导扩增）l 液相杂交：液相杂交：HPA（杂交保护分析）（杂交保护分析）l 化学发光法：检测杂交信号化学发光法：检测杂交信号MTD 方法方法STEP1：标本预处理：标本预处理 超声波降解标本超声波降解标本STEP2：扩增：扩增 (TMA) 扩增试剂扩增试剂, 石腊油
7、，经过预处理的标本石腊油，经过预处理的标本-消化消化 95 , 15 分钟，水浴分钟，水浴 42 , 5 分钟分钟-加入酶试剂，扩增加入酶试剂，扩增 42 , 30 分钟分钟STEP3：探测：探测 ( HPA) 加入探针试剂加入探针试剂-杂交杂交 60, 15 分钟分钟-选择选择 60 , 15 分钟分钟-在发光仪读数在发光仪读数扩增试剂扩增试剂, 石腊油石腊油 经过预处理的标本经过预处理的标本 95 , 15 分钟分钟 42 , 5 分钟分钟42 , 30 分钟分钟准备并（超）声波降解标本准备并（超）声波降解标本加入探针试剂加入探针试剂60, 15 分钟分钟选择选择 60 , 15 分钟分钟在发光仪读数在发光仪读数
