1、（优选）细胞培养技术与应用细胞培养细胞培养：将组织分散成单细胞，使其：将组织分散成单细胞，使其在类似于体内生存环境、适宜的体外条件在类似于体内生存环境、适宜的体外条件下的生存、生长并维持其结构与功能的技下的生存、生长并维持其结构与功能的技术。术。u培养过程中细胞不再形成培养过程中细胞不再形成组织。组织。u培养对象（培养物）是单培养对象（培养物）是单个细胞（群）。个细胞（群）。（1）概念类似、内涵相近）概念类似、内涵相近（2）培养对象、培养物的差异）培养对象、培养物的差异（3）二者无严格的界限，可以相互转化）二者无严格的界限，可以相互转化动物细胞培养动物细胞培养 植物细胞培养植物细胞培养（1）技
2、术的难度）技术的难度（2）专业的切合角度）专业的切合角度（3）关注热度和应用价值）关注热度和应用价值课程内课程内容容微生物细胞培养微生物细胞培养营养要求复杂、培养条件严格营养要求复杂、培养条件严格培养的细胞容易发生变化培养的细胞容易发生变化培养与真实的生存环境有差异培养与真实的生存环境有差异简化生长环境、方便控制因素简化生长环境、方便控制因素细胞群均一性好、大量、成本低细胞群均一性好、大量、成本低大规模生产生物制品大规模生产生物制品细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程细胞工程是现代生细胞工程是现代生物技术各环节中物技术各环节中承承上启下上启下的纽带。的纽带。细胞培养
3、细胞培养细胞工程细胞工程细胞培养技术是细细胞培养技术是细胞工程的胞工程的最基础、最基础、最核心最核心的技术。的技术。细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程用细胞生物学和分子生物学的用细胞生物学和分子生物学的理论方法，按照人们的设计，理论方法，按照人们的设计，通过通过细胞水平上的操作细胞水平上的操作，定向，定向改造细胞或生物体、创造新种、改造细胞或生物体、创造新种、加速繁育、获得产物。加速繁育、获得产物。细胞培养细胞培养细胞融合细胞融合 细胞器细胞器/核移植核移植基因转移基因转移染色体操作染色体操作细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程通过人工培养获通过人工培养获得细胞或细胞代得细胞或细胞代谢产物谢产物细胞
4、培养细胞培养细胞工程细胞工程获得具有新遗传特获得具有新遗传特性或特定属性的产性或特定属性的产物、组织或生物体物、组织或生物体细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程细胞工程是现代生细胞工程是现代生物技术各环节中物技术各环节中承承上启下上启下的纽带。的纽带。核移植、细胞培养、细胞核移植、细胞培养、细胞融合、胚胎发育综合应用融合、胚胎发育综合应用细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程无限细胞系、细胞融合、无限细胞系、细胞融合、细胞免疫的综合应用细胞免疫的综合应用细胞培养细胞培养细胞工程细胞工程染色体技术、细胞培养的染色体技术、细胞培养的综合应用综合应用多多倍倍体体育育种种1907年：哈里森（年：哈里森（Harr
5、ison），蛙胚神经组），蛙胚神经组织，单玻片悬滴培养法织，单玻片悬滴培养法创始人。创始人。1923年，卡雷尔（年，卡雷尔（Carrel），卡氏瓶培养法，），卡氏瓶培养法，细胞组织生存空间的细胞组织生存空间的开拓者开拓者。1951年，年， 厄尔（厄尔（Eagle） ，体外培养动物细，体外培养动物细胞的人工合成培养基胞的人工合成培养基开发者开发者。 波米拉（波米拉（Pomerat），悬浮培养。），悬浮培养。1957年，杜尔贝科（年，杜尔贝科（Dulbecco），胰蛋白酶），胰蛋白酶消化单层细胞培养法消化单层细胞培养法先行者先行者。医学诊断与治疗医学诊断与治疗（1）疾病诊断）疾病诊断（2）细胞植入
6、治疗）细胞植入治疗羊膜穿刺术羊膜穿刺术 地中海贫血地中海贫血骨髓细胞骨髓细胞（3）药物效应检测）药物效应检测动物筛选动物筛选细胞筛选细胞筛选高效、经济、特异性高效、经济、特异性检测有毒物质检测有毒物质,把致癌、致畸形把致癌、致畸形的物质加入培养液的物质加入培养液，对培养出对培养出的细胞进行染色体的检验的细胞进行染色体的检验,进而进而推断物质的毒性；推断物质的毒性；生物制品的生产生物制品的生产疫苗疫苗激素激素干扰素干扰素单克隆抗体单克隆抗体这些都已经成为现实这些都已经成为现实动物细胞作为表达宿主，可生产蛋白质类的生物制品，病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 ；n鱼类鱼类病毒学：病毒学：病毒的分离、鉴定
7、以及病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备病毒疫苗的制备n鱼类细胞毒理学：鱼类细胞毒理学：评价样品对鱼类细评价样品对鱼类细胞的毒性胞的毒性等等n水产生物基础理论水产生物基础理论n鱼类免疫学鱼类免疫学 英国科学家胡克英国科学家胡克（R.Hook,1635-1703),27岁成为英国皇家学会领岁成为英国皇家学会领导成员导成员, 发表对木栓的观发表对木栓的观察，命名察，命名Cell。荷兰人列文虎克（荷兰人列文虎克（Antoni von Leeuwenhoek,1623-1723）用自磨镜片做成显）用自磨镜片做成显微镜第一次观察了活的细微镜第一次观察了活的细菌和原生动物。菌和原生动物。19世纪中期世纪中期
8、细胞学说细胞学说建立建立施莱登施莱登施旺施旺19世纪中期世纪中期细胞学说细胞学说建立建立施莱登施莱登施旺施旺细胞学说的要点：细胞学说的要点：1、生物体都是由细胞构成；、生物体都是由细胞构成；2、细胞由分裂产生新细胞；、细胞由分裂产生新细胞；3、细胞是生物体结构和功能、细胞是生物体结构和功能（生命活动）的基本单位。（生命活动）的基本单位。非细胞结构非细胞结构:细胞结构：细胞结构：病毒：病毒：HIV 、SARS、流感病毒、噬菌体等流感病毒、噬菌体等原核细胞：原核细胞：真核细胞：真核细胞：蓝藻蓝藻细菌细菌 放线菌放线菌支原体支原体 衣原体衣原体 立克次氏体立克次氏体所有动物所有动物除蓝藻外除蓝藻外的
9、植物的植物真菌：如蘑菇、真菌：如蘑菇、酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌生物生物原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞原核细胞与真核细胞的本质差异原核细胞与真核细胞的本质差异原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞无以核膜为界限无以核膜为界限的细胞核的细胞核有以核膜为界限有以核膜为界限的细胞核的细胞核较小较小较大较大只有核糖体一种只有核糖体一种细胞器细胞器多种复杂的细胞器多种复杂的细胞器无染色体，有无染色体，有DNADNA分子分子有染色体（有染色体（DNADNA和蛋和蛋白质构成）白质构成）原核细胞与真核细胞的本质差异原核细胞与真核细胞的本质差异圆球形、圆球形、 多面体形、多面体形、 纺纺锤形、长梭形、锤形、长梭形、
10、管状、管状、 长柱形、长柱形、 分枝状、分枝状、 不规不规则性则性 。细胞的多样性细胞的多样性支原体支原体巨型乌贼巨型乌贼神经细胞神经细胞蕨藻蕨藻鸵鸟卵鸵鸟卵卵细胞卵细胞细胞质细胞质内质网内质网核膜核膜细胞核细胞核核仁核仁线粒体线粒体高尔基体高尔基体核糖体核糖体细胞膜细胞膜溶酶体溶酶体中心体中心体叶绿体叶绿体 细胞壁细胞壁液泡液泡动物细胞与植物细胞的比较动物细胞与植物细胞的比较 细胞器细胞器动物细胞动物细胞植物细胞植物细胞 细胞壁细胞壁无无有有 叶绿体叶绿体无无有有 液泡液泡无无有有 溶酶体溶酶体有有无无 圆球体圆球体无无有有 营养方式营养方式异养异养自养自养 通讯连接方式通讯连接方式间隙连接
11、间隙连接胞间连丝胞间连丝 中心体中心体有有无无 胞质分裂方式胞质分裂方式收缩环收缩环细胞板细胞板细胞的分裂细胞的分裂细胞细胞分裂分裂受精卵受精卵两个子细胞两个子细胞四个子细胞四个子细胞细胞团细胞团细胞分裂的意义？细胞分裂的意义？单细胞生物单细胞生物个体数目增多个体数目增多细胞数目增多细胞数目增多多细胞生物多细胞生物子细胞从周围吸收营养，合成自身的组成物质、不断地长大的过程。生长的生长的结果？结果？生长生长产生了各种不同形态、功能的细胞，它们构成了生物体的各种结构，以适应环境。细胞分化的结果：细胞分化的结果：在个体发育中，由在个体发育中，由一个或一种一个或一种细胞细胞增殖产生增殖产生的后代的后代
12、，在，在形态形态、结构结构、生理功能生理功能上发生上发生稳定稳定差异差异的过程，叫细胞分化。的过程，叫细胞分化。12345细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂细细胞胞分分化化细胞生长细胞生长细胞分裂、生长、分化的结果细胞分裂、生长、分化的结果分裂：使细胞分裂：使细胞生长：使细胞生长：使细胞分化：使细胞分化：使细胞细 胞 有 寿 命 吗细 胞 有 寿 命 吗 ? ?细胞能无限制的分裂吗细胞能无限制的分裂吗? ?细胞的衰老：细胞的衰老： 一般指复制衰老，即体外培养的一般指复制衰老，即体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停正常细胞经过有限次数的分裂后，停止分裂，细胞形态和生理代谢活动发止分裂，细胞形
13、态和生理代谢活动发生显著改变的现象。生显著改变的现象。形态：形态：细胞水分减少导致细胞萎缩，细胞水分减少导致细胞萎缩， 体积变体积变小小。结构：结构：核增核增大大，色素积累，色素积累， 染色质固缩。染色质固缩。功能：功能：新陈代谢速度减慢新陈代谢速度减慢， 呼吸速度减慢呼吸速度减慢 （线粒体功能退化、形变）（线粒体功能退化、形变） 有些酶的活性降低有些酶的活性降低 （酪氨酸酶）（酪氨酸酶） 细胞膜通透性功能改变。细胞膜通透性功能改变。 衰老细胞的主要特征衰老细胞的主要特征细胞死亡细胞死亡自动死亡自动死亡被动死亡被动死亡( (细胞凋亡细胞凋亡) )( (细胞坏死细胞坏死) )遗传物质控制遗传物质
14、控制外界因素外界因素 最主要的一种方式，受最主要的一种方式，受Bcl-2Bcl-2家族、家族、caspasecaspase家家族等族等基因控制基因控制的主动的的主动的生理性细胞自杀行为。生理性细胞自杀行为。凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着色质固缩，形成新月形帽状结构等形态
15、，沿着核膜分布。核膜分布。凋亡小体形成：核染色质断裂为大小不等的片凋亡小体形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生许多泡状或的细胞质膜所包围。细胞表面产生许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个凋亡小体。芽状突起，逐渐形成单个凋亡小体。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。细胞凋亡过程细胞凋亡过程动物个体内不同类型和寿命的细胞动物个体内不同类型和寿命的细胞I.接近于动物的整体寿命的细胞接近于动物的整体寿命的细胞，如，如神经元和肌神经元和肌肉细胞肉细胞等。等。在胚胎发育
16、终了时，这些细胞不再增加数在胚胎发育终了时，这些细胞不再增加数量，在个体的生长期中它们可增长细胞体积，以使其与量，在个体的生长期中它们可增长细胞体积，以使其与躯体成比例。它们随着个体衰老而衰老，或者由于这些躯体成比例。它们随着个体衰老而衰老，或者由于这些细胞的衰老、死亡引起个体死亡。细胞的衰老、死亡引起个体死亡。II. 缓慢更新的细胞缓慢更新的细胞，它们的寿命短于动物的平均，它们的寿命短于动物的平均寿命，如肝细胞，胃壁细胞等。寿命，如肝细胞，胃壁细胞等。III.快速更新的细胞快速更新的细胞，如皮肤的表皮细胞、红细胞，如皮肤的表皮细胞、红细胞和白细胞等。和白细胞等。 细胞（至少是培养的细细胞（至
17、少是培养的细胞），不是不死的、而胞），不是不死的、而是有一定寿命的。它们是有一定寿命的。它们的增殖能力不是无限的，的增殖能力不是无限的，而是有一定界限的。而是有一定界限的。Leonard Hayflick (1928 )正在检查他培养的正在检查他培养的WI-38细胞细胞 体外培养细胞增殖与个体寿命的关系体外培养细胞增殖与个体寿命的关系龟龟 9090-125 175125 175水貂水貂 3030-34 1034 10鸡鸡 1515-35 3035 30小鼠小鼠 1414-28 3.528 3.5人人 胚胎胚胎 40-60 110 40-60 110 出生至出生至1515岁岁 20-40 20-
18、40 1515岁以上岁以上 10-30 10-30 早老病患者早老病患者 2-10 10-202-10 10-20细胞的无限增殖与癌变细胞的无限增殖与癌变癌癌 Cancer基因控制基因控制无限增殖无限增殖衰老死亡衰老死亡梅艳芳梅艳芳 宫颈癌宫颈癌马三立马三立 膀胱癌膀胱癌文兴宇文兴宇 肺癌肺癌罗京罗京 淋巴癌淋巴癌陈晓旭陈晓旭 乳腺癌乳腺癌肿瘤细肿瘤细胞胞正常细胞为什么会转化成癌细胞？正常细胞为什么会转化成癌细胞？癌细胞癌细胞正常细胞正常细胞原癌基因原癌基因抑癌基因抑癌基因突变突变突变突变癌基因癌基因失去抑制作用失去抑制作用不能控制不能控制（致癌因子的作用）（致癌因子的作用）不受控制，恶性增殖
19、不受控制，恶性增殖原癌基因原癌基因抑癌基因抑癌基因癌基因癌基因（1 1）物理致癌因子：）物理致癌因子：辐射（紫外线、辐射（紫外线、X射线、电离辐射等）射线、电离辐射等）致癌的外界因素致癌的外界因素（2）化学致癌因子：）化学致癌因子：无机物无机物如石棉、砷化物、铬化物、镉化物等；如石棉、砷化物、铬化物、镉化物等；有机物有机物如黄曲霉素、亚硝胺、尼古丁、甲醛、如黄曲霉素、亚硝胺、尼古丁、甲醛、 苯、联苯胺、煤焦油、苯并芘等苯、联苯胺、煤焦油、苯并芘等（3）病毒致癌因子：）病毒致癌因子： 感染人的细胞，将其基因整合进入人的基因组，感染人的细胞，将其基因整合进入人的基因组，诱发癌变诱发癌变如：如：感染
20、感染乙肝病毒乙肝病毒可诱发可诱发肝癌；肝癌； 感染感染人乳头状病毒人乳头状病毒可诱发可诱发宫颈癌；宫颈癌； EB病毒病毒是一种疱疹病毒，使儿童患是一种疱疹病毒，使儿童患淋巴癌淋巴癌、成人、成人 患患鼻咽癌。鼻咽癌。如何预防癌症？如何预防癌症？ 在多细胞生物中，每个个体细胞在多细胞生物中，每个个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因，的细胞核具有个体发育的全部基因，只要条件许可只要条件许可，细胞都可发育成完，细胞都可发育成完整的个体。细胞经分裂和分化后仍整的个体。细胞经分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性。具有形成完整有机体的潜能或特性。细胞的全能性细胞的全能性高度分化的高度分化的植物体细
21、胞植物体细胞具有全能性，离体植物细具有全能性，离体植物细胞在一定营养的物质、激素和其他适宜的外界条胞在一定营养的物质、激素和其他适宜的外界条件下，能表现其全能性。件下，能表现其全能性。高度分化的动物体细胞高度分化的动物体细胞也具有全能性吗？也具有全能性吗？ 诱导多功能干细胞（诱导多功能干细胞（iPScell）创始人之一。）创始人之一。 2006年山中伸弥等科学家把年山中伸弥等科学家把4个转录因子通过个转录因子通过逆转录逆转录病毒载病毒载体转入小鼠的成纤维细胞，使其变成多功能体转入小鼠的成纤维细胞，使其变成多功能干细胞干细胞。这意味着未成熟的细胞能够发展成所有类型的细胞。这意味着未成熟的细胞能够
22、发展成所有类型的细胞。 2007年，他所在的研究团队通过对小鼠的实验，发现年，他所在的研究团队通过对小鼠的实验，发现诱导人体表皮细胞使之具有胚胎干细胞活动特征的方诱导人体表皮细胞使之具有胚胎干细胞活动特征的方法。此方法诱导出的干细胞可转变为法。此方法诱导出的干细胞可转变为心脏和神经细胞，心脏和神经细胞，为研究治疗多种心血管绝症提供了巨大助力，这一研为研究治疗多种心血管绝症提供了巨大助力，这一研究成果在全世界被广泛应用。究成果在全世界被广泛应用。山中伸弥山中伸弥京都大学京都大学IPS细胞研究所所长细胞研究所所长2012年，获得诺贝尔生理或医学奖年，获得诺贝尔生理或医学奖 细胞全能性高低与细胞分化
23、程度有细胞全能性高低与细胞分化程度有关，分化程度越高，细胞全能性越低，关，分化程度越高，细胞全能性越低，全能性表达越困难。全能性表达越困难。胚胎干细胞胚胎干细胞成体干细胞成体干细胞多能干细胞多能干细胞全能干细胞全能干细胞专能干细胞专能干细胞干细胞干细胞动物细胞核的全能性动物细胞核的全能性 细胞培养细胞培养是以第一流的技术为基础是以第一流的技术为基础的，没有其它可接受的标准。高深的理论的，没有其它可接受的标准。高深的理论知识本身不能产生良好的培养。我相信有知识本身不能产生良好的培养。我相信有了实践了实践才能产生满意的结果。才能产生满意的结果。动物组织培养动物组织培养 英国，华斯莱英国，华斯莱实操
24、实操理论理论动物细胞培养的难点动物细胞培养的难点1 1、营养要求复杂；、营养要求复杂；2 2、动物细胞无细胞壁，机械强度低，对、动物细胞无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感；剪切力敏感；3 3、适应环境能力差，对环境（、适应环境能力差，对环境（pHpH、溶解、溶解氧、温度、剪切力）敏感；氧、温度、剪切力）敏感；4 4、倍增时间长，生长缓慢，易受微生物、倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染。污染。动物细胞培养的基本条件动物细胞培养的基本条件（1 1）无菌条件）无菌条件无菌条件是细胞体无菌条件是细胞体外培养最基本的条外培养最基本的条件。件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞当细胞放置于体外培养时
25、，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。生存的基本条件。蒸汽灭菌蒸汽灭菌过滤除菌过滤除菌化学灭菌化学灭菌辐射灭菌辐射灭菌火焰灭菌火焰灭菌抗生素抗生素无菌室无菌室（十万级）（十万级）无菌操作台无菌操作台（百级）（百级）着装着装视频资料视频资料污染难污染难100%避免避免及时确认污染及时确认污染采取必要措施
26、采取必要措施看看 检检及时确认发生的微生物污染及时确认发生的微生物污染n最常发生的是霉菌和细菌污染最常发生的是霉菌和细菌污染。q霉菌污染霉菌污染易于发现，如培养液中长出了各种菌落，易于发现，如培养液中长出了各种菌落，肉眼可见，不难确认肉眼可见，不难确认细菌感染细菌感染时，有的引起培养时，有的引起培养液混浊，镜下可见大量细菌，有的培养液无明显液混浊，镜下可见大量细菌，有的培养液无明显改变如怀疑污染，必要时可向肉汤或琼脂培养基改变如怀疑污染，必要时可向肉汤或琼脂培养基里滴少量培养物，置里滴少量培养物，置37温箱培养数日，观察有温箱培养数日，观察有无菌落形成，以验证是否污染。无菌落形成，以验证是否污
27、染。n经常发生和难以发现的是支原体污染经常发生和难以发现的是支原体污染。PPLO体体积小，只有积小，只有0.25 1 m大小，且无细胞壁。大小，且无细胞壁。 PPLO污染后的细胞仍然能生存，甚至无明显变污染后的细胞仍然能生存，甚至无明显变化，有时导致培养细胞发生不同程度的病理改变。化，有时导致培养细胞发生不同程度的病理改变。（2 2）营养条件）营养条件 动物细胞培养动物细胞培养对营养要求非常严对营养要求非常严格，除氨基酸、维格，除氨基酸、维生素、无机盐、葡生素、无机盐、葡萄糖、核酸外，还萄糖、核酸外，还需要血清。需要血清。培养液是细胞营养的直接来源。培养液是细胞营养的直接来源。碳水化合物：碳水
28、化合物：提供碳骨架和能量提供碳骨架和能量氨基酸：氨基酸：12种基本氨基酸（精氨酸、胱氨酸、异亮氨种基本氨基酸（精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸）和谷氨酰胺色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸）和谷氨酰胺维生素：维生素：常用的有烟酰胺、叶酸、核黄素、维生常用的有烟酰胺、叶酸、核黄素、维生素素B12、泛酸、吡哆醇及维生素、泛酸、吡哆醇及维生素C，维持细胞生长，维持细胞生长生长因子：生长因子：包括激素类物质和促生长因子，如胰岛素、包括激素类物质和促生长因子，如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、
29、神经生长因子、血小板生长因转铁蛋白、表皮生长因子、神经生长因子、血小板生长因子、内皮细胞生长因子、生长调节素等子、内皮细胞生长因子、生长调节素等无机盐：无机盐：钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素外，也钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如铁、锌、硒等需微量元素，如铁、锌、硒等血清成分：血清成分：激素激素生长因子生长因子结合蛋白结合蛋白贴壁扩展因子贴壁扩展因子微量元素如硒微量元素如硒缺点：价格贵、质量不稳定缺点：价格贵、质量不稳定（3 3）理化条件）理化条件温度温度pH渗透压渗透压气分压气分压体外体外体内体内 温度温度维持细胞旺盛生长须有恒定维持细胞旺盛生长须有恒定适宜的温度。细胞代
30、谢强度适宜的温度。细胞代谢强度与温度成正比，低温下会使与温度成正比，低温下会使细胞代谢速率降低。温度过细胞代谢速率降低。温度过高导致细胞死亡，这主要是高导致细胞死亡，这主要是由酶和蛋白质所需要的最适由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。如人体细胞最温度决定的。如人体细胞最适温度为适温度为36.536.50.50.5，偏，偏离这一温度范围，细胞的正离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死常代谢会受到影响，甚至死亡。亡。恒温培养箱恒温培养箱 鱼类是鱼类是变温动物，变温动物，耐温 范 围耐温 范 围较广 ， 因较广 ， 因此鱼 类 细此鱼 类 细胞培 养 对胞培 养 对温度 的 要温度 的 要
31、求没 有 哺求没 有 哺乳动 物 细乳动 物 细胞培 养 那胞培 养 那么严 格 。么严 格 。牙鲆鳃细胞系牙鲆鳃细胞系大西洋鳕大西洋鳕前肾巨噬细胞前肾巨噬细胞对虾肌肉对虾肌肉组织细胞组织细胞草鱼草鱼细胞细胞水生哺水生哺乳动物乳动物2）pH值：值：n动物细胞生长动物细胞生长大多需要轻微大多需要轻微碱性环境，最碱性环境，最佳为佳为7.27.过酸（低于过酸（低于6）或过碱（高于）或过碱（高于7.6）可导致）可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。膜的结构受损有关。耐受性强耐受性强 耐受性差耐受性差3）气体）气体二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱气体
32、是细胞生长代谢的必需条气体是细胞生长代谢的必需条件，主要包括件，主要包括氧气氧气和和二氧化碳二氧化碳。氧气氧气参与参与三羧酸循环三羧酸循环(TCA)，产，产生细胞生长增殖所需的能量和生细胞生长增殖所需的能量和合成细胞生长所需用的各种成合成细胞生长所需用的各种成分。分。二氧化碳二氧化碳主要具有调节主要具有调节pH的作的作用。供给的体积分数一般为用。供给的体积分数一般为5%。4）渗透压）渗透压 用平衡盐溶液配制各种试用平衡盐溶液配制各种试剂、洗涤，主要含无机盐和剂、洗涤，主要含无机盐和葡萄糖。鱼类细胞可耐受的葡萄糖。鱼类细胞可耐受的渗透压范围更广。某些海水渗透压范围更广。某些海水鱼，需要添加鱼，需
33、要添加1.5%1.5%的氯化钠的氯化钠调节渗透压。调节渗透压。海洋节肢动物细胞培养海洋节肢动物细胞培养（4 4）常用培养器）常用培养器培养板培养板培养皿培养皿疫苗、激素生产疫苗、激素生产培养瓶培养瓶贴壁型细贴壁型细胞胞悬浮型细悬浮型细胞胞(非贴壁型非贴壁型)兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞：种类较少种类较少成纤维细成纤维细胞胞型型上皮细上皮细胞胞型型不规则多角形不规则多角形放射状放射状梭形火焰形梭形火焰形球形球形游走型、多形型游走型、多形型密度高、适用大规模培养密度高、适用大规模培养三大类三大类培养细胞的生长特点培养细胞的生长特点a)贴附生长贴附生长b)接触抑制接触抑制c)密度依赖性密度依赖性 细胞细
34、胞贴壁是一个非常贴壁是一个非常复杂的多因素相关过程，复杂的多因素相关过程，支持物表面的支持物表面的清洁程度清洁程度、所带所带电荷电荷以及培养基中的以及培养基中的一些蛋白、激素、多肽类一些蛋白、激素、多肽类物质物质都会影响，血清促进都会影响，血清促进细胞贴壁主要是糖蛋白起细胞贴壁主要是糖蛋白起的作用。的作用。三大特点三大特点 粘附粘附是大多数有机体是大多数有机体细胞细胞在体内在体内生存生存和和生长发育生长发育的的基本存在方式基本存在方式 粘附粘附是大多数有机体是大多数有机体细胞细胞在体内在体内生存生存和和生长发育生长发育的的基本存在方式基本存在方式含义：含义：有两有两方面方面结果结果：基于粘附特
35、性，使细胞与细胞之间相：基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须必须粘附粘附于一于一固相表面固相表面才能才能生存生存和和生长生长。培养细胞的贴附、伸展培养细胞的贴附、伸展1234接触抑制：接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量增加，形成一个单层，此时细胞间相互裂，数量增加，形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。50代以后代以后失去接触抑失去接触抑制制接触抑制接触抑制1.培养的细胞之间培养的细胞之间仍有在形态和机能上
36、的相互依仍有在形态和机能上的相互依存关系。在结构上，如：上皮存关系。在结构上，如：上皮细胞仍见有桥粒在生理活动上，细胞仍见有桥粒在生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖单个细胞虽能生长繁殖, 但不但不如群体细胞能力强，当相邻细如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止，细胞接触，便导致运动停止，细胞相互沟通生物信息的结果。胞相互沟通生物信息的结果。 2.培养的细胞和基质之间培养的细胞和基质之间 对细胞外基质仍有依存性对细胞外基质仍有依存性 去分化去分化(脱分化):各种分化细胞，逐渐各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能失去各自的形态与功能“个个性性”，表现出某种，表现出某种趋同性趋同性 如如:
37、培养的培养的成纤维细胞成纤维细胞 在在适当刺激适当刺激下，可下，可分化分化为为 其它结缔组织细胞其它结缔组织细胞和和肌组织细胞肌组织细胞，表现出，表现出类似未类似未分化分化的间充质细胞的特性，的间充质细胞的特性，返祖返祖 。1. 去分化去分化并不并不意味着意味着完全返回完全返回胚胎时期的原胚胎时期的原始细胞状态始细胞状态如如:高度分化高度分化的的神经细胞神经细胞和和心肌细心肌细已经丧失已经丧失的的增生活性不可能恢复增生活性不可能恢复 但已经具备的但已经具备的生生物电活动特性不会完全失去物电活动特性不会完全失去 2. 再分化：再分化：可可重新表现重新表现出出分化特点分化特点 如：如：把把表皮细胞
38、表皮细胞放在放在气液界面上气液界面上培养，可培养，可分化分化成含大量角蛋白丝的成含大量角蛋白丝的角质细胞角质细胞 、内皮细胞，、内皮细胞，但，这种但，这种能力能力会会随着培养时间延长随着培养时间延长 逐渐丧逐渐丧失。失。总之，体外培养总之，体外培养,使细胞使细胞结构结构与与功能上功能上的的“可塑性可塑性”增大增大1、取材、取材无菌无菌器械锋利器械锋利及时培养及时培养剔除无关成分剔除无关成分营养丰富营养丰富记录保存信息资料记录保存信息资料视频视频 原代培养也称初代培养，是从供体取原代培养也称初代培养，是从供体取出组织或分离细胞接种培养后至第一次传出组织或分离细胞接种培养后至第一次传代之前的细胞培
39、养阶段。代之前的细胞培养阶段。选取原则：个体健壮、无病，无外伤，选取原则：个体健壮、无病，无外伤，避免选用某些携带内源性病菌的鱼类。避免选用某些携带内源性病菌的鱼类。个体越年轻，其细胞一般保持较强的分个体越年轻，其细胞一般保持较强的分裂能力，体外培养成功的可能性就越大。裂能力，体外培养成功的可能性就越大。因此，胚胎或幼体应该是细胞传代的很因此，胚胎或幼体应该是细胞传代的很好材料。好材料。水生无脊椎动物：主要包括甲壳类、贝水生无脊椎动物：主要包括甲壳类、贝类、海绵等。类、海绵等。水生脊椎动物，主要是鱼类。水生脊椎动物，主要是鱼类。 供培养的组织材料要经过严格的擦供培养的组织材料要经过严格的擦洗、
40、消毒与多次冲洗。海洋动物的组织洗、消毒与多次冲洗。海洋动物的组织还需用还需用75%酒精、稀高锰酸钾溶液或二酒精、稀高锰酸钾溶液或二氯化汞、双氯苯双胍己烷溶液等再处理，氯化汞、双氯苯双胍己烷溶液等再处理，以杀灭海洋中一些弧菌类有机体。再用以杀灭海洋中一些弧菌类有机体。再用维持液反复冲掉多余消毒剂，这样处理维持液反复冲掉多余消毒剂，这样处理既能杀死细菌又能维持细胞活性。既能杀死细菌又能维持细胞活性。组织材料的清洗消毒组织材料的清洗消毒弧菌是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革弧菌是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性菌。如霍乱弧菌。弧菌属广泛分布于河口、兰氏阴性菌。如霍乱弧菌。弧菌属广
41、泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。目前弧菌海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。目前弧菌有有91种。主要鱼贝类致菌为：溶藻弧菌、鳗弧菌、种。主要鱼贝类致菌为：溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌等副溶血弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌等细胞悬液的分离：细胞悬液的分离：组织材料的分离组织材料的分离组织块的分离：组织块的分离： 机械分散法机械分散法（多级筛网）（多级筛网）剪切分离法剪切分离法酶消化法酶消化法离心法离心法血液、羊水、胸腔水、腹水血液、羊水、胸腔水、腹水胰蛋白酶胰蛋白酶胶原蛋白水解酶胶原蛋白水解酶 2 2、培养方法、培养方法常用，操作简便；成功率较高常用，操作简便；成功率
42、较高适合组织量少；适合组织量少；生长较慢、耗时长生长较慢、耗时长注意事项：轻拿轻放，及时更换培养液注意事项：轻拿轻放，及时更换培养液将组织剪切成小块后，接种于将组织剪切成小块后，接种于培养瓶中培养。培养瓶中培养。组织块培养法组织块培养法消化培养法消化培养法步骤繁琐、易污染、成本高；步骤繁琐、易污染、成本高；适用大量组织、耗时短、效率高；适用大量组织、耗时短、效率高； 应用消化分散法将组织细胞间质（基应用消化分散法将组织细胞间质（基质、纤维）除去，使细胞分散，然后接种质、纤维）除去，使细胞分散，然后接种培养。培养。酶消化酶消化酶消化法酶消化法 采用较为广泛的方法，适用于绝大多数采用较为广泛的方法
43、，适用于绝大多数组织，并且在贴壁细胞传代时也多用此种方组织，并且在贴壁细胞传代时也多用此种方法。经常采用的消化酶有胰蛋白酶、胶原酶法。经常采用的消化酶有胰蛋白酶、胶原酶等。利用消化法得到的细胞量大，均一性好，等。利用消化法得到的细胞量大，均一性好，细胞贴壁后可迅速形成单层。要注意不同组细胞贴壁后可迅速形成单层。要注意不同组织需不同的消化酶浓度以及消化时间，否则织需不同的消化酶浓度以及消化时间，否则会因消化过度而对细胞产生损伤。会因消化过度而对细胞产生损伤。胰酶胰酶-EDTA消化液消化液能与细胞间钙离子、镁离子结合能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散而使细胞连接松散冷消化冷消化热消化热消
44、化a、贴壁培养法、贴壁培养法b、悬浮培养法、悬浮培养法少数动物细胞属于悬浮生长型，如少数动物细胞属于悬浮生长型，如淋巴细胞和肿瘤细胞。悬浮生长的淋巴细胞和肿瘤细胞。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。传细胞其培养和传代都十分简便。传代时不需要再分散，此法细胞增殖代时不需要再分散，此法细胞增殖快、产量高。快、产量高。多数细胞属于贴壁生长型，使分散多数细胞属于贴壁生长型，使分散的单细胞先贴附在瓶壁或支撑物上的单细胞先贴附在瓶壁或支撑物上后，再进行培养的方法。最终在附后，再进行培养的方法。最终在附着表面扩展成单层。有接触抑制的着表面扩展成单层。有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层特性，一旦细胞形成单
45、层, ,生长就会生长就会受到抑制，细胞产量有限。受到抑制，细胞产量有限。nn（1）组织块固定法n当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块, 按一定比例将组织块贴在瓶壁上, 至少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养。n （2）机械分散法n此法适用于细胞间连接较松散的组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约一立方毫米耐的小块, 放入底部有一铜网的注射器内, 用手的压力将组织挤出网孔, 最后将分散的组织吹打后加人营养液分装培养。n（3）络合剂分散法n目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸, 它能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散, 经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚
46、细胞培养及上皮型细胞系的传代。n（4）酶消化法n该法是目前采用极为广泛的方法, 适用于绝大多数组织器官。所用的酶主要是胰酶, 常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同, 又可进一步分为冷消化法及热消化法。n（5）冷消化法n此法是将组织剪成约刀的小块, 然后置一倍体积的胰酶中, 四摄氏度培养。草鱼肝脏组织细胞的原代培养：草鱼肝脏组织细胞的原代培养：1鱼体用鱼体用0.01%高锰酸钾溶液浸泡消毒半小时。高锰酸钾溶液浸泡消毒半小时。2用用70%酒精棉花擦洗解剖部位。酒精棉花擦洗解剖部位。3剖开腹腔，取出剖开腹腔，取出0.5cm3的组织，除去粘膜和的组织，除去粘膜和血块等，小烧杯中用小剪刀剪碎，用血
47、块等，小烧杯中用小剪刀剪碎，用Hanks液洗液洗34次。次。4转入三角瓶，加转入三角瓶，加0.25%胰酶胰酶20消化消化30分钟。分钟。5消化完毕，加少许消化完毕，加少许Hanks液，离心液，离心6倒去消化液，用倒去消化液，用Hanks液重悬液重悬12次。次。7用含有小牛血清的生长液重悬。用含有小牛血清的生长液重悬。8计数，分装培养。计数，分装培养。实例实例视频资料视频资料 细胞由原培养瓶内分离稀释后，传到细胞由原培养瓶内分离稀释后，传到新的培养瓶进行培养的过程。进行一次分新的培养瓶进行培养的过程。进行一次分离再培养称之为传一代。离再培养称之为传一代。需要进行传代培养的原因？需要进行传代培养的
48、原因？ 初次传代的注意点：初次传代的注意点：（1）充分生长；充分生长；（2）消化时间的控制；（）消化时间的控制；（3）接种量大一）接种量大一些。细胞浓度应在些。细胞浓度应在200万个细胞万个细胞/毫升以上，毫升以上，接种量太少不容易传代成功。接种量太少不容易传代成功。三、动物细胞的传代培养三、动物细胞的传代培养1 1 悬浮细胞的传代悬浮细胞的传代 直接传代：使悬浮细胞沉底，吸掉约直接传代：使悬浮细胞沉底，吸掉约2/3上清，悬浮细胞，然后分别接种两只或多上清，悬浮细胞，然后分别接种两只或多只培养瓶。只培养瓶。 离心传代：将培养液于离心传代：将培养液于1000rpm离心，离心，弃去上清，加入新的生
49、长液，吹打悬浮细弃去上清，加入新的生长液，吹打悬浮细胞，然后分别接种两只或多只培养瓶。胞，然后分别接种两只或多只培养瓶。2 2 贴壁细胞的传代贴壁细胞的传代 确认细胞有无污染，吸出培养瓶内旧培养液；确认细胞有无污染，吸出培养瓶内旧培养液； 消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度；消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度； 消化时间不宜过久，一般在室温下静置消化时间不宜过久，一般在室温下静置2 25min,5min,当当见细胞间隙变大，细胞层出现麻布样网孔、细胞质见细胞间隙变大，细胞层出现麻布样网孔、细胞质回缩现象，即可终止消化。回缩现象，即可终止消化。 终止消化要先倒去消化液，然后加入有
50、血清的培养终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养基。基。 用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度。后记录其浓度。 接种培养。接种培养。消化传代消化传代视频资料视频资料1待细胞长成单层后，倒去培养液，加待细胞长成单层后，倒去培养液，加胰酶胰酶-EDTA消化液，当单层细胞呈白色一消化液，当单层细胞呈白色一片，而且细胞间出现针孔状空隙时，停止片，而且细胞间出现针孔状空隙时，停止消化，再倒去消化液。消化，再倒去消化液。2加入细胞生长液，吹打分散加入细胞生长液，吹打分散3分装培养，一般一瓶传二瓶，有的细分装培养，一般一瓶传二瓶，有的细胞
