1、 x x x中山大学蛋白质组学研究中心中山大学蛋白质组学研究中心中山大学基础医学院药理教研室中山大学基础医学院药理教研室l选题l撰写申请书l答辩l好心情、好身体 边想边写 3h /天l读指南、读通知 注意截止期l读标书、读高手、读同行l读自己 卖点！？选题 创新性 工作基础 l想法变文字 一气呵成 “立项依据”l沟通 科研科87330567、医科处 87333055 1. 1. 基础：继续和深入基础：继续和深入 发表和未发表发表和未发表 创新创新2. 2. 问题问题 中肯中肯 3. 3. 预实验预实验 针对针对“问题问题”的预实验结果的预实验结果4. 4. 假设假设 思想性、创新性思想性、创新
2、性5. 5. 方法方法 可靠性第一可靠性第一 先进性第二先进性第二6. 6. 目标目标 明确、具体明确、具体7. 7. 意义意义 理论性和应用性理论性和应用性2. 2. 要求：充分的理由和意义要求：充分的理由和意义 思想性思想性 与摘要呼应与摘要呼应 3. 3. 自己的工作为依据自己的工作为依据 图文并茂图文并茂 规范规范 4. 4. 参考文献参考文献 时效性时效性 自己的文章自己的文章 规范化规范化5. 5. 深入浅出深入浅出 内行、外行读得懂内行、外行读得懂 6. 6. 人文文化人文文化 素质素质 精神精神 动人的故事动人的故事 细胞凋亡细胞凋亡 时时SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bi
3、m的转录调控的转录调控神经元凋亡时神经元凋亡时 BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控神经元凋亡时神经元凋亡时SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的的 调控调控 SP1对对BH3-only蛋白蛋白Bim的转录调控的转录调控 SP1对神经元凋亡的调控作用对神经元凋亡的调控作用l关键词关键词：SP1/Bim /基因调控基因调控/信号转导信号转导/神经元凋亡神经元凋亡 l获得获得SP1SP1直接调控直接调控bimbim基因表达的可靠证据，阐基因表达的可靠证据，阐明促凋亡蛋白明促凋亡蛋白BimBim由由SP1SP1转录调控的新机制，为转录调控的新机制，为确立确立SP1SP1作为神经退行
4、性疾病治疗的新靶点提作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。供更充分的科学依据。明确、具体明确、具体 解决学术问题解决学术问题 与题目相呼应与题目相呼应 （紧紧围绕研究目标）（紧紧围绕研究目标） 1. 证明证明bim启动子核心区的启动子核心区的SP1结合序列是否介导了结合序列是否介导了bim基因的基因的上调上调 为了证实bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调，将其中的SP1结合序列进行点突变，使其不能结合SP1；确定这一突变是否能够消除bim启动子的撤钾反应。 2. 分析分析SP1 是否能够与是否能够与bim启动子核心区的启动子核心区的SP1结合序列结合结合序
5、列结合 应用EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)技术，证实bim启动子核心区的SP1 结合序列是否能够与SP1结合；进一步采用CHIP(Chromatin immunoprecipitation)方法，获得SP1与bim启动子核心区在细胞内结合的证据。 3. 从从 bim 的的mRNA 和蛋白质水平，观察负显性和蛋白质水平，观察负显性SP1是否能够抑是否能够抑制撤钾诱导的制撤钾诱导的bim基因的上调基因的上调 质粒转染CGNs的转染率只能达到0.1-1.0 %，腺病毒的感染率可达7080%1。 因此，构建dnSP1的腺病毒载体Ad-dnSP1，
6、感染CGNs才能达到可靠分析bim的mRNA和蛋白质表达水平改变的目的。 4. 4. 分析分析SP1诱导诱导Bim这一机制对神经元凋亡的调控作用这一机制对神经元凋亡的调控作用 确立SP1转录激活bim这一机制后，进一步分析这一机制对神经元凋亡的调控作用。 获得获得SP1SP1直接调控直接调控bimbim基因表达的可靠依据。基因表达的可靠依据。 研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究内容或因素。 为达到预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。找出关键问题，问题清晰，分析透彻， 合理的解决方法。 项目需求为前提；项目需求为前提；可靠性第一，先进性第二；可靠性第一，先进性第二；参考文献；参考文
7、献；突出关键技术的描述；突出关键技术的描述；不主张使用流程图，建议开头：不主张使用流程图，建议开头：“有关方法、技术路有关方法、技术路线、试线、试 验手段、关键技术综述如下验手段、关键技术综述如下”。 1. 工作基础工作基础 （学术思想）（学术思想） 2. 科研梯队科研梯队 3. 实验条件实验条件 4. 实验技术实验技术 5. 交流与合作（国内、国外）交流与合作（国内、国外） 对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。 原始创新：原始创新： 填补空白或修改传统的理论；填补空白或修改传统的理论； 新技术、新方法的发明创造。新技术、新方法的发明创造。
8、跟踪创新：跟踪创新： 在前人工作基础上补充、完善现有理论；在前人工作基础上补充、完善现有理论； 对原有技术、方法进行修改后产生对原有技术、方法进行修改后产生1 11 12 2的效果。的效果。申请人首次报道了神经元凋亡时促凋亡蛋白Bim上调是不依赖于JNK/c-Jun通路(Leyu Shi,et al, Neurosci Lett. 2005)一观察之后，又以可靠的实验结果证明PI3K/Akt/FKHRL1信号通路也不参与bim的上调（见立项依据）。 bim上调的转录机制是什么？我们率先对bim启动子进行了5末端序列续减分析，确立了诱导bim表达的启动子核心区， 进而发现一个典型的转录因子SP1
9、结合序列位于其中。进一步实验显示：神经元凋亡时SP1被激活；负显性SP1突变体和SP1-DNA结合抑制剂mithramycin A可抑制bim的上调。根据以上生物信息学分析和实验观察，我们首次提出了SP1介导bim上调这一新的bim转录机制：神经元凋亡时转录因子SP1被激活，激活的SP1与bim启动子核心区的SP1结合序列结合，从而转录激活bim的表达。 本项目拟进一步采用负显性SP1突变体的腺病毒表达技术以及启动子点突变、EMSA和CHIP方法，旨在获得SP1直接调控bim基因的可靠证据，为阐明SP1对促凋亡蛋白Bim的调控作用和机制并进一步确立SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分
10、的科学依据。 ( (对于自由申请项目，着重对于自由申请项目，着重填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累和近五年的主要研究业绩和近五年的主要研究业绩) ) ( (包括利用国家重点实验室包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况和部门开放实验室的计划与落实情况) ) 在国家自然科学基金在国家自然科学基金(已结题三项、正进行一项已结题三项、正进行一项)的资助下，的资助下，近五年有如下工作积累和成绩：近五年有如下工作积累和成绩： 1. SCI论文论文 近
11、五年发表了近五年发表了14篇篇SCI论文；其中与神经元凋亡的信号论文；其中与神经元凋亡的信号转导和基因调控有关的论文，作为第一作者的有转导和基因调控有关的论文，作为第一作者的有2篇，作为通讯作者的篇，作为通讯作者的有有4篇篇(见后见后)，作为共同作者的有，作为共同作者的有8篇篇。 2. Bim转录机制的前期工作转录机制的前期工作 我们首次报道了神经元凋亡时我们首次报道了神经元凋亡时JNK/c-Jun不参与不参与bim的上调的上调1，随后，我们又以可靠的证据揭示了，随后，我们又以可靠的证据揭示了PI3K/Akt/ FKHRL1也不介导也不介导bim的上调的上调(未发表资料未发表资料)。这些研究工
12、作改变了以往。这些研究工作改变了以往的观点的观点,也是本项目重要的立项依据之一。也是本项目重要的立项依据之一。 3. Bim启动子核心区确立启动子核心区确立 启动子启动子5末端序列续减分析确立了诱导末端序列续减分析确立了诱导Bim表达的启动子核表达的启动子核 心区，并发现一个典型的转录因子心区，并发现一个典型的转录因子SP1结合序列位于其结合序列位于其中。进一步实验显示：神经元凋亡时中。进一步实验显示：神经元凋亡时SP1被激活；负显性被激活；负显性SP1突变体和突变体和SP1-DNA结合抑制剂均可抑制结合抑制剂均可抑制Bim的上调。这些实验资料揭示了的上调。这些实验资料揭示了SP1介导介导 b
13、im转转录调控的新机制，也为本项目申请提供了最根本的实验依据。录调控的新机制，也为本项目申请提供了最根本的实验依据。 4. 转录因子调控神经元凋亡的工作基础转录因子调控神经元凋亡的工作基础 另一项转录因子另一项转录因子MEF2抗抗神经元凋亡的工作也显示了申请人与本项目相关的较扎实的研究工作积累。神经元凋亡的工作也显示了申请人与本项目相关的较扎实的研究工作积累。本人首次报道本人首次报道(Mingtao Li, et al, J of Neurosci. 2001, 21:6544-6552 )、随后被、随后被他人证实他人证实(Shu-ichi Okamoto, et al, PNAS 2002,
14、 99:3974-3979)，神经元凋亡时，神经元凋亡时转录因子转录因子MEF2A和和MEF2D不仅活性降低和失去抗凋亡作用，而且被凋亡杀不仅活性降低和失去抗凋亡作用，而且被凋亡杀手手caspase 剪切，其剪切，其N-末端产物反而具有促凋亡活性。这一末端产物反而具有促凋亡活性。这一MEF2调控凋亡机调控凋亡机制的发现，不仅对于我们理解神经元存活或凋亡具有重要的意义，而且也为制的发现，不仅对于我们理解神经元存活或凋亡具有重要的意义，而且也为神经系统的发育和分化的研究开拓了一条崭新的思路，具有创新性。神经系统的发育和分化的研究开拓了一条崭新的思路，具有创新性。 5. 信号转导的工作基础信号转导的
15、工作基础 较早的一项对较早的一项对cAMP / PKA 抗神经元凋亡机制抗神经元凋亡机制的研究也反映了本人在神经元凋亡信号转导的研究方面有较厚实的工作积累的研究也反映了本人在神经元凋亡信号转导的研究方面有较厚实的工作积累。申请者首次发现促凋亡激酶。申请者首次发现促凋亡激酶 GSK-3 和和GSK- 3是是PKA的天然底物；阐明的天然底物；阐明cAMP/PKA 通过磷酸化并抑制通过磷酸化并抑制GSK-3发挥其促神经元存活的作用，此内容发挥其促神经元存活的作用，此内容发表在发表在分子细胞生物学分子细胞生物学( Mingtao Li, et al, Mol Cell Biol. 2000, 20:
16、9356-9363)。 6. JNK/c-Jun通路的工作基础通路的工作基础 我们首次以我们首次以JNK/c-Jun为直接靶点、用为直接靶点、用小分子小分子JNK抑制剂抑制剂(SP600125)治疗帕金森病动物，证实治疗帕金森病动物，证实JNK是有效的治疗靶是有效的治疗靶点。此工作发表后点。此工作发表后 (Neuroscience Research, 2004; 48:195-202)，得到了国际，得到了国际同行的认可。同行的认可。SCI期刊期刊Drug News Perspectives邀请本人撰写了有关邀请本人撰写了有关“以以JNK为靶点治疗帕金森病为靶点治疗帕金森病”的专题综述的专题综述
17、“JNK Inhibition as a Potential Strategy in Treating Parkinsons Disease”(Drug News Perspect. 2004; 17:646-54)。 1. Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu, Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and Mingtao Li(通讯作者). Activity de
18、privation-dependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375：712. 2. Wenya Wang, Chi Ma, Zixu Mao and Mingtao Li. (通讯作者). JNK inhibition as a potential strategy in treating Parki
19、nsonss disease. Drug News Perspect, 2004, 17(10):646-54. 3. Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenming Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yifan Han and Mingtao Li. (通讯作者). SP600125, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkins
20、ons disease. Neurosci Res 2004；48:195-202 4. Yuanbin Xie, Yanling Liu, Chi Ma, Zhongmin Yuan, Wenya Wang, Zhenyu Zhu, , Guoquan Gao, Xianguo Liu, Hengxin Yuan, Ruzhu Chen, Shoujian Huang, Xuelan Wang, Xiaonan Zhu, Xuemin Wang, Zixu Mao and Mingtao Li (通讯作者). Indirubin-3-oxime inhibits c-Jun NH2-term
21、inal kinase: anti-apoptotic effect in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2004, 367:355-359. 5. Rongbiao Pi, Wenming Li Nelson T.K.Lee, Hugh H.N.Chan, Yongmei Pu, Ling Nga Chan, Nikolaus J.Sucher, Doanld C. Chang, Mingtao Li and Yifan Han. Minocycline prevents glutamate-induced apoptosis of c
22、erebellar granule neurons by differential regulation of p38 and Akt pathways. J Neurochem. 2004, 91:1212-1230. Wenya Wang, Chi Ma, Zixu Mao and Mingtao Li. (通讯作者). JNK inhibition as a potential strategy in treating Parkinsonss disease. Drug News Perspect, 2004, 17(10):646-54. 6. Wenming Li, Rongbiao
23、 Pi, Hugh H. N. Chan, Hongjun Fu, Nelson T. K. Lee, Hing Wai Tsang, Yongmei Pu, Donald C. Chang, Chaoying Li, Jialie Luo, Keming Xiong, Zhiwang Li, Hong Xue, Paul R. Carlier, Yuanping Pang, Karl W. K. Tsim, Mingtao Li and Yifan Han. Novel dimeric AChE inhibitor Bis(7)-tacrine, but not Donepezil, pre
24、vents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking NMDA receptors. J Biol Chem. 2005, 280(18):18179-88. 7. Xuemin Wang, Xiaoli Tang, Mingtao Li, John Marshall, Zixu Mao. Regulation of neuroprotective activity of myocyte enhancer factor 2 by cAMP-PKA signaling pathway in neuronal survival. J Biol
25、 Chem. 2005, 280(17):16705-13. 8. Marcus Wiedmann, Xuemin Wang, X.iaoli Tang, Mingtao Li, Zixu Mao. PI3K/Akt-dependent regulation of the transcription factor myocyte enhancer factor-2 in insulin-like growth factor-1- and membrane depolarization-mediated survival of cerebellar granule neurons. J Neur
26、osci Res. 2005 2005 81(2):226-234. 9. Mingtao Li，Xiaomin Wang，Mary Kay Meintzer，Tracey Laessig，Morris J. Birnbaum and Kim A. Heidenreich. Cyclic AMP promotes neuronal survival by phosphorylation of glycogen synthase kinase 3. Mol Cell Biol. 2000, 20（24）：9356-9363. 10. Mingtao Li，Daniel A. Linsenman，
27、Melissa P.Allen，Mary Kay Meintzer， Xiaomin Wang，Tracey Laessig，Margaret E. Wierman & Kim A. Heidenreich. MEF2A and MEF2D undergo phosphorylation and caspase-mediated degradation during apoptosis of rat cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 2001; 21(17):6544-6552. 11. Daniel A. Linseman, Christoph
28、er M. Bartley, Shoshona S. Le, Tracey A. Laessig, Ron J. Bouchard, Mary Kay Meintzer, Mingtao Li and Kim A. Heidenreich . Inactivation of the Myocyte Enhancer Factor-2 Repressor Histone Deacetylase-5 by Endogenous Ca2/Calmodulin-dependent Kinase II Promotes Depolarization-mediated Cerebellar Granule
29、 Neuron Survival. J Biol Chem 2003, 278:4147241481. 12. Jing-Ping Yun, Choong-Tsek Liew, Eng Ching Chew, Xiao-Yu Yin, Paul Bo San Lai, Yam Hin Fai, H.K. Richard Li, Mei-Lin Jin, Ming-Xiao Ding, Mingtao Li, Han-Liang Lin, and Wan Yee Lau. Nuclear Matrix Protein Expressions in Hepatocytes of Normal an
30、d Cirrhotic Rat Livers Under Normal and Regenerating Conditions. J Cell Biochem. 2004, 91:12691279. 13. Hongwei Yang, Xiaodong Hu, Hongmei Zhang, Wenjun Xin, Mingtao Li, Tong Zhang, Lijun Zhou and Xianguo Liu. Roles of CaMKII, PKA, and PKC in the induction and mainternance of LTP of C-fiber-evoked f
31、ield potentials in rat spinal dorsal horn. J Neurophysiol. 2004, 91: 1122-1133.14 . Nengwei Hu, Hongmei Zhang, Xiaodong Hu , Mingtao Li, Tong Zhang, Lijun Zhou and Xianguo Liu. Protein Synthesis Inhibition Blocks the Late-Phase LTP of C-Fiber Evoked Field Potentials in Rat Spinal Dorsal Horn. J Neur
32、ophysiol, 2003;89:2354- 235915 . Juan Sun, Mingtao Li, Jiahuai Han and Jun Gu. Sensitization of differentiated PC12 cells to apoptosis by presenilin-2 is mediated by p38. Biochem. Biophy. Res. Commun., 2001, 287: 536-541. 16. Weibin Cai, Jianfang Ma , Chaoyang Li, Zhonghan Yang, Xia Yang, Wei Liu ,
33、Zuguo Liu , Mingtao Li, Guoquan Gao. Enhanced anti-angiogenic effect of a deletion mutant of plasminogen kringle 5 on neovascularization. J Cell Biochem. 2005 Sep 15;(in press).17. Ming YANG, Cun-you WAGN, Feng ZHOU, Jing TAO, Tao LIU, Hai-yan WEI, Wei LIU, Ming-tao Li, Xian-song FENG. Proteomic Ana
34、lysis in the Early Process of Pancreatic Regeneration in the Pancreatectomized Rat. Acta Pharmacologica Sinica 2005 (in press) 2001年回国，获得211基金180万元，组建了一流的分子、细胞生物学实验室。2002年，作为负责人获得一期985学科建设经费700万元，筹建了一流的蛋白质组学实验室并正在主持开展蛋白质科学的前沿性工作。近三年，培养和汇聚了一支从事分子神经生物学和蛋白质组学研究的科研队伍。 这些建设性工作为解决细胞信号转导、基因调控以及本项目的核心问题奠定了扎
35、实的基础。 项目负责人黎明涛所在单位中山大学基础医学院药理教研室是211项目资助学科和国家重点学科。人才济济，科研装备精良。近三年，药理教研室获得学科建设资金3000万元，已购置大型仪器如质谱仪、激光共聚焦显微镜、超速离心机、流式细胞仪、高效液相和蛋白质分离纯化系统等。这是申请者视为非常可贵的研究工作环境。 申请者和项目组主要成员申请者和项目组主要成员 l学历l研究工作简历l近期已发表与本项目有关的文章目录l获得学术奖励情况l在本项目中承担的任务。 黎明涛(Li Mingtao) 项目负责人，中山大学基础医学院药理教研室教授，博士生导师，中山医学院蛋白质组学实验室主任。于1984年、1989年
36、和1996年分别获得医学学士、硕士和博士学位。 主要研究领域是神经元凋亡的信号转导、基因调控和蛋白质组学。在美国Department of Pharmacology, University of Colorado Health Sciences Center从事两年博士后研究（1999-2001），主攻凋亡的信号转导、基因调控和蛋白质组学。 近五年发表了14篇SCI论文，其中：作为第一作者，在国际核心杂志Molecular and Cellular Biology(Impact Factor, 10.03)和 Journal of Neuroscience(IF, 8.4)发表了具有创新性的文
37、章；作为通讯作者，最近在Neurosci Res(IF, 2.4) 和Neurosci Lett（IF，2.2）等期刊上发表了开拓性的文章。近五年（19982004）作为第一主持人获得13项基金，包括：4项国家自然科学基金；5项省自然科学基金；3项市基金；1项教育部基金。 发表的相关论文发表的相关论文 1. Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu, Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Z
38、ixu Mao, and Mingtao Li(通讯作者). Activity deprivation-dependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375:712. 2. 3. 皮荣标皮荣标(Pi Rongbiao) 33岁，博士学位，讲师。2002年毕业于中山大学，获神经药理学博士。同年赴香港科技大学生
39、物化学系从事博士后研究，现在中山大学药学院任讲师。主要研究兴趣涉及神经保护药物的作用及其机制的研究。曾负责或参加包括国家自然科学基金等多项研究。已发表或待发表论著近20篇，其中SCI论文5篇。 皮博士与本人合作达11年，有共同的研究趣向，作为共同作者发表多篇SCI论文。他掌握了本项目涉及的大部分实验方法和技术，尤其在腺病毒载体构建方面积累了经验（见文章）。主要负责腺病毒载体构建等工作。 发表的相关论文发表的相关论文 1. Rongbiao Pi, Wenming Li, Nelson T.K.Lee, Hugh H.N.Chan, Yongmei Pu, Ling Nga Chan, Niko
40、laus J. Sucher, Doanld C. Chang, Mingtao Li and Yifan Han. Minocycline prevents glutamate-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by differential regulation of p38 and Akt pathways. J Neurochem. 2004, 91:1212-1230. 2. 3. xxx先生：先生： 您好！您申请的项目经专家投票表决，同意资助。您好！您申请的项目经专家投票表决，同意资助。关于你的项目的同行评议意见如下：
41、1. 本项目在小脑颗粒细胞撤钾的离体凋亡模型中，发现了一种直接调节Bim的新转录因子SP1，申请人试图采用腺病毒转染技术、基因突变以及分子生物学方法进一步论证SP1是直接调控bim基因的这一假说。立项具有前言性，申请人工作基础好，并与美国Emory大学、香港大学有长期的合作条件，完全能够完成本项课题。建议优先资助。 2. 本项课题的立项依据较为充分，具有一定的学术创新及科学意义。研究内容明确、技术路线清晰、研究方法和方案可行。申请者有较高的学术水平，以及多次主持国家自然科学基金课题的经验。同时，申请者所在单位又有比较好的实验室及条件。建议给予资助。 3. 课题研究具有较好的工作基础，研究具有较
42、高的学术价值，建议资助。 4. 同意资助。理由：该项目立论依据充分，其重要的意义表现在澄清撤钾诱导神经元凋亡时，Bim上调的细胞内信号转导机制。申请者有较好的研究基础和研究能力，项目的内容设置合适，重点突出，总体方案合理，技术路线可行，可资助。 5. This is a nicely writen proposal with a clear aim and practical approaches. Further, the group has published results related to the current proposal, indicating the ability of the group to perform the experiments. l工作基础好l学术创新性及学术价值l立项依据充分l研究内容明确l技术路线清晰l重点突出、方案合理l国际合作l充满自信、激情 l仪表和体语 l特点： 专家心理？按提前结束做准备！l准备充分 幻灯 小道具l口头表达 准确性、情感性、可信性和简明性l开门见山、突出主题 做什么？为什么？怎样做？l突出特色和创新
