1、基因工程原理动物细胞的基因转移幻灯片Introduction 动物细胞的基因转移已应用了40多年 研究基因功能和调控或者生产大量的重组蛋白 哺乳动物细胞系，杆状病毒表达系统 体内基因治疗 不同于转基因动物动物细胞基因转移的策略 直接DNA转移 显微注射， 基因枪 转染技术 利用化学和物理技术诱导细胞从外界环境摄取DNA 病毒介导转导 细菌介导细菌感染转染技术 化学方法 （不同的方法有相似的原理） DNA/磷酸钙共沉淀法 其他化学方法 脂质体转染 物理方法 （有多样的机制） 电穿孔，显微注射，基因枪DNA/磷酸钙共沉淀法 HPRT缺陷型的细胞 DNA/磷酸钙共沉淀为复合物，积累到细胞膜上，然后再
2、由细胞摄取到内部，并转运到细胞核，DNA释放并得到表达 沉淀物要现用现配 沉淀物必须包裹细胞，只适用于单层生长的细胞，而不适用悬浮或成团生长的细胞 转染效率低其他的化学转染方法 二乙氨乙基葡聚糖 (DEAE-dextran) 可溶性聚阳离子糖类，可以促进DNA与胞吞相互作用 瞬时转染效率很高，但不能形成稳定转化的细胞系脂质体转染脂质体转染 Lipofection (liposome transfection) 将DNA包装到一个磷脂泡囊中，泡囊可以与靶细胞的细胞膜相互作用，促进DNA摄取。 适用于多种细胞类型，包括悬浮细胞 可以转染大片段DNA，比较温和 转染效率高达90% 可用于基因治疗Li
3、pofection电穿孔法 细胞置于短暂的电脉冲中使细胞膜上形成瞬时的纳米大小的孔，DNA通过这些孔进入细胞并转运到核。 适用于多种类型的细胞 确定电脉冲的强度和持续时间 参数确定后，具有高重复性 需要的细胞量比较大，容易引起死亡单细胞转染新技术：纳米钢笔探针电穿孔直接转化的方法 显微注射 基因枪瞬时转染和稳定转染 瞬时转染：转入的DNA不能被细胞所整合，DNA在核中保持外源染色体状态，也不包含在宿主细胞中可以发挥功能的复制起始位点，那么它只能保留很短的时间就会稀释或者降解。 稳定转染：DNA整合到基因组中，形成新的遗传位点，并遗传给所有的无性繁殖后代。共转染和稳定转染的筛选动物细胞的选择标记
4、 内源选择标记 （依赖突变体） 共转染 显性选择标记TK可用作内源选择标记常用的内源选择标记基因共转染 物理上不相连的DNA进行转染，都会整合到基因组中。 利用了解清楚的质粒与目的基因共转染，已知的筛选标记筛选，Southern鉴定目的基因。 不相连的供体DNA片段在整合之前发生了融合。显性选择标记 内源标记的缺陷：只能用于那些对应基因不具有功能的突变细胞系。 显性选择标记所提供的表现型对于细胞来说是全新的，因此可以用于任何类型的细胞。选择标记和转化基因的扩增 添加药物筛选后，少数个别细胞会自发产生抗药性突变而存活 氨甲喋呤，DHFR，dhfr “假阳性”的去除：强启动子驱动dhfr，引入第二
5、个选择标记DNA介导的基因转移质粒载体质粒载体进行转染的优点 质粒载体的方便性得以在动物细胞中应用 质粒上的调控序列可以驱动目的基因的表达 质粒上的选择标记和目的基因会一起整合到基因组，不需要与其他基因共转染 穿梭载体的使用，使载体保持为游离的复制子用于瞬时转化的非复制型质粒载体 瞬时转化时经常使用质粒载体 目的就是利用染色体外DNA的短期存在性 基因表达的瞬时测定和重组蛋白的适量回收 在大多数动物细胞中共价闭合环状DNA只能保持12天。复制子载体的转染 失控的多瘤病毒复制子 BK和BPV复制子的稳定转化 EBV复制子的稳定转化失控的多瘤病毒复制子 多瘤病毒会造成溶解感染，即病毒基因组复制出非
6、常高的拷贝数，从而使细胞裂解，释放出成千上万的子代病毒颗粒。 利用其复制起点和启动子构建克隆载体，瞬时转染，大量生产重组蛋白SV40病毒载体 SV40有约5kb的环状双链DNA基因组 最初的SV40载体是病毒载体 病毒外壳最大只能插入2.5kb的外源DNASV40质粒载体 携带有SV40复制起点的质粒与病毒本身具有同样的作用 将SV40复制起点克隆到大肠杆菌载体上 T抗原编码区 整合鼠多瘤病毒复制起始位点 人巨细胞病毒启动子BK和BPV复制子的稳定转染 BK病毒和EBV病毒会导致潜伏性感染，病毒基因组保持在低或中等的拷贝数，从而不会影响宿主细胞的生长。 稳定转染效率等于普通瞬时转染的效率 提供
7、BKT抗原后，含有BK复制起点的质粒载体就会像病毒一样进行复制 引入neo等选择标记后，逐步提高培养基中抗生素的浓度，就可以筛选高拷贝的细胞BPV载体EBP载体腺病毒 DNA病毒，基因组大约36kb 6个早期转录子，1个主要的后期转录子 稳定性、外源DNA高容量、宿主范围广、高滴度后代腺病毒相关载体 AAV 单链DNA病毒 对异源辅助病毒有依赖性 AAV载体已用于将基因高效转入许多类型的细胞杆状病毒 杆状病毒具有杆状的衣壳和大的dsDNA基因组 感染许多节肢动物，特别是昆虫。 主要用于在昆虫和昆虫细胞内的高水平瞬时蛋白表达 AcMNPV和BmNPV sf9，sf21 家蚕活体动物细胞中高水平表达外源基因的载体设计 强组成型启动子的使用 包含内含子 包含poly A 去掉冗余的非翻译序列 提高外源基因翻译效率 整合一个靶信号
