1、http:/ 第六节第六节 染菌的防治染菌的防治什么是染菌？什么是染菌？发酵过程中除了生产菌以外，还有其发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖它菌生长繁殖 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 1、发酵染菌对不同品种的影响、发酵染菌对不同品种的影响放线菌由于生长的最适放线菌由于生长的最适pH为为7左右，因此左右，因此染细菌为多，而霉菌生长染细菌为多，而霉菌生长pH为为5左右，因左右，因此染酵母菌为多。此染酵母菌为多。青霉素发酵染菌青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被
2、青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。都能使青霉素迅速破坏。不同菌不同产品 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 2、污染不同种类和性质的微生物的影响、污染不同种类和性质的微生物的影响（1）污染噬菌体）污染噬菌体 噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较难防治，故危害极大。污染噬菌体后，较难防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断可使发酵产量大幅度下降，严重的造
3、成断种，被迫停产种，被迫停产。 染菌的防治http:/ 有些杂菌会使生产菌有些杂菌会使生产菌自溶自溶产生大量泡沫，产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下下降降，使不耐酸的产品破坏。，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。反复染菌。 染菌的防治http:/ 3、不同时间染菌对发酵的影响、不同时间染菌对发酵的影响污染时间是指用无菌检测方
4、法确准的污染时间，污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有一定的生长、繁殖的时杂菌进入培养液后，需有一定的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。菌量少，显现染菌的时间就长。 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 发酵前期菌量不很多，发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞与杂菌没有竞争优势；争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生且还未合成产物（
5、抗生素）或产生很少，很少，抵御杂菌能力弱。抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌措施染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。接种再用。 染菌的防治http:/ 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液培养液pH下
6、降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。制杂菌。 染菌的防治http:/ 染菌的防治http
7、:/ 1、发酵染菌对过滤的影响、发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难过滤困难。即使采取加热、冷却、添加助滤剂。即使采取加热、冷却、添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想。等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想。 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，对造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，对绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚的，但在实
8、际绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚的，但在实际生产中发酵染菌率仍比较高，可以说产生这种现象生产中发酵染菌率仍比较高，可以说产生这种现象大多数是由于工作中大多数是由于工作中“明知故犯明知故犯”“”“不负责任不负责任”和和“侥幸心理侥幸心理”所造成的。例如，灭菌的蒸汽压不足所造成的。例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂菌而告终。现将我们收集到的国内外几家以污染杂菌而告终。现将我们收集到的国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下：抗生
9、素工厂发酵染菌原因列于下： 染菌的防治http:/ 项目项目 百分率百分率%种子带菌或怀疑种子带菌种子带菌或怀疑种子带菌 9.64接种时罐压跌零接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透培养基灭菌不透 0.79总空气系统有菌总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶泡沫冒顶 0.48夹套穿孔夹套穿孔 12.36盘管穿孔盘管穿孔 5.89接种管穿孔接种管穿孔 0.39阀门渗漏阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏罐盖漏 1.54其它设备渗漏其它设备渗漏 10.13操作原因操作原因 10.15 原因不明原因不明 24.94 染菌的防治http:/ 项目项目 百分率百分率%种子带菌种子带
10、菌 14.15盘管穿孔盘管穿孔 14.20阀门渗漏阀门渗漏 23.30空气系统有菌空气系统有菌 10.0管理不善管理不善 25.80其它其它 7.49原因不明原因不明 5.78 染菌的防治http:/ 项目项目 百分率百分率%进罐前未做设备严密度检查进罐前未做设备严密度检查 25.8接种违反操作规程接种违反操作规程 25.8检修质量缺乏验收制度检修质量缺乏验收制度 19.35操作不熟练操作不熟练 19.35配料违反工艺规程配料违反工艺规程 6.45调度不当调度不当 3.25 染菌的防治http:/ 项目项目 百分率百分率%外界带入杂菌（取样、补料）外界带入杂菌（取样、补料） 8.20设备穿孔设
11、备穿孔 7.60空气系统有菌空气系统有菌 26.00停电罐压跌零停电罐压跌零 1.60接种接种 11.00蒸汽压力不足或蒸汽量不足蒸汽压力不足或蒸汽量不足 0.60管理问题管理问题 7.80 操作违反规程操作违反规程 1.60种子带菌种子带菌 0.60原因不明原因不明 35.00 染菌的防治http:/ 1、设备渗漏、设备渗漏 设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染
12、菌占现，这类染菌占33.85，上海三厂的分析这类染，上海三厂的分析这类染菌为菌为37.5。所以说加强设备本身及附属零部件的。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。要的。 染菌的防治http:/ 2、空气带菌、空气带菌从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为带菌而造成的染菌分别为19.96和和 26%。国。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌有使染菌率降低到理想的程度
13、。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。气除菌失败。 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 4、灭菌不彻底、灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系l蒸汽通入培养基，蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间升温快慢、保温时间产生产生过多泡沫过多泡沫l蒸汽总压是否达到要求标准蒸汽总压是否达到要求标准l环境中的环境中的杂菌数量因季节而有很大差别杂菌数量因季节而有很大差别。如上海。如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至连续灭菌预热至
14、800C的培养基采样培养，可发现的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发现养中，则仅发现23个芽孢杆菌。故染菌率因季个芽孢杆菌。故染菌率因季节不同而发生明显变化。节不同而发生明显变化。 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 5、技术管理不善、技术管理不善技术管理就是要对发酵每个环节严格控技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理不能有侥幸心理而放松管理 染菌的防治http:/ 1、环境无菌的检查、环境无菌的检查尘埃粒子检测
15、尘埃粒子检测无菌平板检测无菌平板检测 染菌的防治http:/ 2、种子及发酵液无菌状况检测、种子及发酵液无菌状况检测酚红肉汤培养基检测酚红肉汤培养基检测平板划线平板划线显微镜观察显微镜观察 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 1、防止种子带菌、防止种子带菌l制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。l沙土制备时要多次间歇灭菌沙土制备时要多次间歇灭菌l注意接种时的无菌操作注意接种时的无菌操作l子瓶、母瓶的移种和培养子瓶、母瓶的移种和培养l无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒无菌室和摇床间都要保持
16、清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。学药品灭菌。 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 2、防止设备渗漏、防止设备渗漏发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。致设备及附件渗漏。设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵
17、套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。发酵罐而造成染菌。设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的理；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现试漏方法才能发现 。 染菌的防治http:/ 阀门渗漏可以用阀门渗漏可以用集气桶集气桶来试漏。方法是先在集气桶来试漏。方法是先在集气桶中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵罐中通入空气，中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵罐中通入空
18、气，使罐压上升到要求压力，一般一公斤以上。由于集气使罐压上升到要求压力，一般一公斤以上。由于集气桶连通各管道，观察哪根管子冒泡，即这根管子的阀桶连通各管道，观察哪根管子冒泡，即这根管子的阀门漏气。门漏气。 染菌的防治http:/ 3、防止培养基灭菌不彻底、防止培养基灭菌不彻底培养基灭菌方法培养基灭菌方法高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌分批灭菌分批灭菌 1210C，30分钟分钟连续灭菌连续灭菌 罐温罐温1251300C，3045分钟分钟 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 消消 塔塔 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 缓慢开启蒸汽阀门，或加入少缓慢开启蒸
19、汽阀门，或加入少量消泡剂。量消泡剂。灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“死角死角”。这些死角蒸汽不能有效达到，常。这些死角蒸汽不能有效达到，常会窝藏耐热芽孢杆菌，所以设备安装要注意会窝藏耐热芽孢杆菌，所以设备安装要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。污垢。 染菌的防治http:/ 4、防止空气引起的染菌、防止空气引起的染菌空气过滤除菌设备流程空气过滤除菌设备流程空压机空压机储罐储罐二级冷却二级冷却加热器加热器空气过滤空气过滤粗过滤粗过滤 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http
20、:/ 5、发酵染菌后的措施、发酵染菌后的措施l染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。l凡染菌的罐要找染菌的原因凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。要彻底清
21、洗，进行空罐消毒，才可进罐。l染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。汽消毒。 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 1、必须建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、必须建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉。及时撒石灰或漂白粉。 2、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面、车间地面
22、和通往车间的道路尽量采取水泥地面 3、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操作规程，认真地进行种子保管，不使用本身带有作规程，认真地进行种子保管，不使用本身带有噬菌体的菌种。感染噬菌体的培养物不得带入菌噬菌体的菌种。感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间种室、摇瓶间 染菌的防治http:/ 4、认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。严格控、认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。严格控制逃液和取样分析和洗罐所废弃的菌体。对倒罐制逃液和取样分析和洗罐所废弃的菌体。对倒罐所排放的废液应灭菌后才可排放。所排放的废液应灭菌后才可排放。 5、选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用
23、菌种。、选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种。 6、发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到、发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。发酵罐周围的杀死噬菌体，才可排放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。管道也必须彻底灭菌。 染菌的防治http:/ 结结染菌对发酵的危害：染菌对发酵的危害：干扰生产菌的正常代谢，降低产量干扰生产菌的正常代谢，降低产量改变改变pH，降解某些产物，降解某些产物污染不同的微生物，不同阶段染菌危害污染不同的微生物，不同阶段染菌危害染菌对提炼的危害：染菌对提炼的危害：过滤困难而大幅度降低过滤收率过滤困难而大幅度降低过滤收率有机溶剂萃取时发生乳化
24、有机溶剂萃取时发生乳化 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌的防治http:/ 染菌对发酵有什么危害，对提炼有什么危害？染菌对发酵有什么危害，对提炼有什么危害？2.有哪些原因会引起染菌？有哪些原因会引起染菌？3.染菌以后应采取什么措施？染菌以后应采取什么措施？ 4.为什么会感染噬菌体？感染了噬菌体后应采取哪些为什么会感染噬菌体？感染了噬菌体后应采取哪些措施？措施？ 染菌的防治 灭菌与空气净化灭菌与空气净化发酵染菌发酵染菌：指在发酵过程中生产菌以外的其他微：指在发酵过程中生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的
25、纯种培养意义上的纯种培养。 1. . 生物反应的基质因杂菌的消耗而损失，造成生生物反应的基质因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。产能力的下降。2. 2. 杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。加困难，造成得率降低，产品质量下降。3. 3. 有些杂菌会分解产物，使生产失败。有些杂菌会分解产物，使生产失败。4. 4. 杂菌大量繁殖后，会改变反应液的杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pHpH值，使反值，使反应异常。应异常。5. 5. 如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败
26、。使生产失败。 染菌危害染菌危害染菌对不同发酵过程的影响染菌对不同发酵过程的影响1、青霉素等抗生素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。2、核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。3、柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。4、谷氨酸发酵：
27、周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。5、疫苗发酵：全部废弃谷氨酸谷氨酸1）使用的培养基和设备须经灭菌；）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；）设备应严密，发酵罐维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子。）使用无污染的纯粹种子。工业上具体措施工业上具体措施灭菌：用物理或化学的方法杀灭或去灭菌：用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有生命物质的过程。除物料或设备中所有生命
28、物质的过程。消毒消毒: :一般指杀死营养细胞而不包括芽一般指杀死营养细胞而不包括芽孢。孢。牢固树立无菌观念牢固树立无菌观念! !强调无菌操作强调无菌操作! ! 第一节第一节 灭灭 菌菌( (一一) ) 灭菌的方法灭菌的方法1 1）干热灭菌法：）干热灭菌法：160160170170，1 11.5h1.5h2 2）火焰灭菌法：范围有限）火焰灭菌法：范围有限3 3）电磁波、射线灭菌法：表面和空间的）电磁波、射线灭菌法：表面和空间的灭菌灭菌4 4）湿热灭菌法湿热灭菌法：121 121 ，30min30min5 5）化学药剂灭菌法：车间环境等）化学药剂灭菌法：车间环境等 高锰酸钾、漂白粉、高锰酸钾、漂白
29、粉、7575酒精等酒精等6 6）过滤除菌法：液体、气体）过滤除菌法：液体、气体（二）（二） 培养基的灭菌培养基的灭菌目的：目的：杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创 造无菌的条件。造无菌的条件。要求：要求：达到要求的无菌程度（达到要求的无菌程度（10-3） 尽量减少营养成分的破坏尽量减少营养成分的破坏 致死温度：杀死微生物的极限温度。致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间。的时间。热阻热阻:微生物在某一特定条件下微生物在某一特定条件下(主要是温度主要是温度)的致死的致死
30、时间，用于表示微生物对热的抵抗力。时间，用于表示微生物对热的抵抗力。相对热阻：某一微生物在某一条件下的致死时间与相对热阻：某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。另一微生物在相同条件下的致死时间之比。 微生物相对热阻微生物相对热阻微生物微生物大肠杆菌大肠杆菌细菌芽孢细菌芽孢霉菌孢子霉菌孢子病毒病毒相对热阻相对热阻13 000 000210151.微生物热阻湿热灭菌湿热灭菌2.2.对数残留定律对数残留定律 对数残留定律对数残留定律：湿热灭菌时，微生物受热：湿热灭菌时，微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比。死亡的速率与残存的微生物数量成正比。dNdt=-kN
31、N:N:培养基中残留活菌数培养基中残留活菌数, ,个个t:t:受热时间受热时间,min,minK:K:反应速率常数也称比死亡速率常数反应速率常数也称比死亡速率常数, min, min-1-1 若开始灭菌若开始灭菌(t=0)时时,培养基中活的微生物培养基中活的微生物为为N0,则上式积分以后可得则上式积分以后可得: InNN0-kt2.303Lg =ktNN0t= 2.303/kLgN0N=024681010-410-310-210-1154oC56oC58oC60oCNNot(min)大肠杆菌在不同温大肠杆菌在不同温度下的残留曲线度下的残留曲线注：1、k越大，微生物越容易死亡 2、要达到彻底灭菌
32、，即N=0，所需时间为无穷大，这在实际工作中是不可能的，因此常采用N=0.001，即灭菌的失败概率为千分之一。 例题：有一个发酵罐内装有40m3培养基，在121 进行实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2*105个耐热细菌芽孢，121 时灭菌速度常数为1.8 min-1。求灭菌失败几率为0.001时所需要的灭菌时间。 解：N0=40*106*2*105=8*1012（个） Nt=0.001 k=1.8（min-1） 灭菌时间：t=2.303/kLg = 20.34min N0Nt3.培养基灭菌温度的选择 杀死微生物杀死微生物 培养基营养破坏培养基营养破坏 如：高压加热情况下，仅如：高压加热情况下，
33、仅20分钟，分钟，50%赖氨酸，精氨酸，赖氨酸，精氨酸，其他碱性氨基酸被破坏；糖溶液焦化变色等。其他碱性氨基酸被破坏；糖溶液焦化变色等。 实践证明：“高温瞬时灭菌法”较好 如：126 132 ，57min连续灭菌，所得培养基质量比采用120 ，30min 实罐灭菌好。（三） 培养基湿热灭菌方法 1、分批灭菌分批灭菌 2、连续灭菌、连续灭菌 3、固体培养基灭菌、固体培养基灭菌1、分批灭 菌 又叫又叫实罐灭菌，也叫实消（空消？），间歇灭菌，实罐灭菌，也叫实消（空消？），间歇灭菌，指将配置好的指将配置好的培养基放在发酵罐中，通入蒸气进行灭菌的过程。培养基放在发酵罐中，通入蒸气进行灭菌的过程。 优点优
34、点无需专门灭菌设备，投资少，设备简单，灭无需专门灭菌设备，投资少，设备简单，灭 菌效果可靠；菌效果可靠； 蒸气要求较低，蒸气要求较低，3*1054*105。 缺点缺点加热和冷却时间较长，营养成分有一定损失；加热和冷却时间较长，营养成分有一定损失； 罐利用低；蒸气用量变化大，造成锅炉负荷波罐利用低；蒸气用量变化大，造成锅炉负荷波 动大。动大。适合中小型发酵罐及含有固体颗粒或培养基有较多泡沫时适用适合中小型发酵罐及含有固体颗粒或培养基有较多泡沫时适用分分 批批 灭灭 菌菌 使物料溶胀并均匀受热，至使物料溶胀并均匀受热，至9090以上，通入蒸以上，通入蒸汽，达到汽，达到121121开始计算维持时间，
35、生产中习惯采开始计算维持时间，生产中习惯采用用3030分钟。快速冷却，以减少营养物质的破坏，分钟。快速冷却，以减少营养物质的破坏，灭菌结束时，立即通入无菌空气，以维持罐压，灭菌结束时，立即通入无菌空气，以维持罐压，然后开启冷却系统进行冷却。然后开启冷却系统进行冷却。 升温升温保温保温冷却冷却灭菌分 批 灭 菌注：注： （1）为防止培养基因直接蒸汽加热而稀释，可）为防止培养基因直接蒸汽加热而稀释，可先在蛇管或夹套通蒸汽加热至先在蛇管或夹套通蒸汽加热至90100，然后，然后再直接蒸汽加热保压。再直接蒸汽加热保压。 （2）实罐灭菌带入水分达）实罐灭菌带入水分达820%，因此培养，因此培养基灭菌时应留
36、有余地。基灭菌时应留有余地。 （3）实消前尽可能先空消。）实消前尽可能先空消。 （4）有些设备也可采用）有些设备也可采用SO2熏蒸灭菌，如葡萄熏蒸灭菌，如葡萄酒发酵池、罐等。酒发酵池、罐等。2、连、连 续续 灭灭 菌菌 连续灭菌：又叫连消，将配置好的培养基在连续灭菌：又叫连消，将配置好的培养基在高温快速的情况下，向发酵罐输送的同时经高温快速的情况下，向发酵罐输送的同时经过加温、保温、冷却的过程，进行灭菌的。过加温、保温、冷却的过程，进行灭菌的。时间(min)温度图2-3 培养基连续灭菌过程中温度的变化20s20s2-3min14427连续灭菌特点连续灭菌特点 优点优点可采用高温快速灭菌工艺，营
37、养成分可采用高温快速灭菌工艺，营养成分 破坏的少，有利于提高发酵产率；破坏的少，有利于提高发酵产率； 蒸气用量平稳，蒸汽压力高于蒸气用量平稳，蒸汽压力高于5 5* *10105 5PaPa； 发酵罐利用率高；发酵罐利用率高； 适于采用自动控制，劳动强度小；适于采用自动控制，劳动强度小； 缺点缺点设备比较复杂，投资较大；设备比较复杂，投资较大； 增加了连续灭菌设备及操作环节，增增加了连续灭菌设备及操作环节，增 加染菌几率加染菌几率 。 连续灭菌前要先空罐灭菌，管路灭菌连续灭菌前要先空罐灭菌，管路灭菌 适于串连罐一起灭菌适于串连罐一起灭菌配料罐配料罐 联消塔联消塔 维持罐维持罐 冷却器冷却器连续灭
38、菌流程连续灭菌流程 2 2、喷射加热、喷射加热- -真空冷却流程真空冷却流程图2-5 加热-真空冷却连续灭菌流程生培养液蒸汽喷射加热器维持管膨胀阀急聚蒸发室灭菌好的培养液真空 培养基从中间管培养基从中间管进入，蒸汽从料进入，蒸汽从料管周围的环隙进管周围的环隙进入，在喷嘴处快入，在喷嘴处快速混合。速混合。国内大多数企业国内大多数企业采用。采用。图2-6 薄板换热器连续灭菌流程维持段蒸汽加热段热回收段水冷却段生培养液冷却水灭菌好的培养液 3 3、板式换热器灭菌流程、板式换热器灭菌流程连续灭菌的设备连续灭菌的设备 （1）预热）预热 在配料罐或预热罐中进行，使培养在配料罐或预热罐中进行，使培养基的温度
39、升到基的温度升到70 70 左右，使得不溶性物左右，使得不溶性物料（如淀粉）发生糊化，不易沉淀，且进料（如淀粉）发生糊化，不易沉淀，且进一步加热时震动噪音也大大减少。一步加热时震动噪音也大大减少。连续灭菌的设备 (2)加热：加热：在加热器中，培养基与蒸气混和，温在加热器中，培养基与蒸气混和，温度度迅速上升迅速上升到到130 140。连消塔式连续灭菌设。连消塔式连续灭菌设备有套管式和气液混合式。备有套管式和气液混合式。套管式连消塔气液混合式连消塔喷射加热器喷射加热器可使料液和蒸汽迅速接触，充分混合，加热是在瞬时内完成的。 图2-10 喷射加热器示意图1-喷嘴 2-吸入口 3-吸入室 4-混合喷嘴
40、 5-混合段 6-扩大管料液已加热料液 2 3 4 5 6 优点优点:结构简单结构简单,体体积小积小,噪音低。噪音低。 （3）保温：）保温：培养基被加热到预定温度后进入保温设备（也称维持设备），经过一段时间（57min）的保温，杀灭培养基中微生物。保温过程中，不通蒸汽，保温设备用保温材料包裹。 常用保温设备有：罐式保温设备和管式保温设备。 （4）冷却：）冷却： 常用喷淋冷却器和套管冷却器。常用喷淋冷却器和套管冷却器。 前者是将冷却水通过喷淋装置均匀的淋在水平前者是将冷却水通过喷淋装置均匀的淋在水平 的排管上，以冷却管内的培养基。的排管上，以冷却管内的培养基。 后者是一种内管走热培养基，内外管间
41、的管隙后者是一种内管走热培养基，内外管间的管隙 中走冷却水的冷却器。中走冷却水的冷却器。3) 固体培养基灭菌 固体培养基：流动性差，不易翻动，吸水加热易成团，冷却困难 常用转鼓式灭菌机转鼓式灭菌机 转鼓以0.51r/min徐徐转动，培养基得到翻动，蒸汽沿轴中心通入加热培养基，达到一定温度后，保温灭菌。 适用于酒厂、酱油厂 污染杂菌的种类数量、灭菌温度时间等 培养基成分：油脂、糖、一定浓度蛋白质 pH值：pH68，微生物最耐热 培养基的颗粒 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层（四）（四） 影响培养基灭菌的因素：影响培养基灭菌的因素：（三）（三） 空气的净化空气的净化 耗氧发酵和微生物繁殖培养都需要氧气
42、，以空气为氧源。耗氧发酵和微生物繁殖培养都需要氧气，以空气为氧源。 空气中含有杂菌较多，消耗营养物质，干扰甚至破坏预定发酵的空气中含有杂菌较多，消耗营养物质，干扰甚至破坏预定发酵的 正常进行。正常进行。 例如：一个通气量40m3/min的发酵罐，一天所需要的空气量高达5.76*104m3，假如所用的空气中含菌量104个/m3，那么一天将有5.76*108个微生物进入发酵系统。 （1 1）空气中微生物的分布）空气中微生物的分布 空气中主要含有孢子和芽孢，细小而轻的菌体；空气中主要含有孢子和芽孢，细小而轻的菌体； 随水分的蒸发、物料的移动被气流带入空气中或黏附在灰尘随水分的蒸发、物料的移动被气流带
43、入空气中或黏附在灰尘 上而漂浮在气流中。上而漂浮在气流中。 空气中微生物是附着在尘埃上的，有如下空气中微生物是附着在尘埃上的，有如下关系式：关系式： Y=0.003x-2.6 Y空气中微生物数量，个空气中微生物数量，个/m3 X空气中尘埃颗粒数量，个空气中尘埃颗粒数量，个/m3 空气中含菌量随空气中含菌量随环境的不同环境的不同而有很大的差异，选择良好的取而有很大的差异，选择良好的取风位置风位置( (如高空取风等如高空取风等) )和提高空气除菌系统的除菌效率。和提高空气除菌系统的除菌效率。一、通风发酵对无菌空气的要求一、通风发酵对无菌空气的要求（2 2）发酵对空气无菌程度的要求）发酵对空气无菌程
44、度的要求 不同的发酵过程，由于菌种生长能力强弱、生长速度不同的发酵过程，由于菌种生长能力强弱、生长速度快慢、它的分泌物的性质、发酵周期长短、培养物的营快慢、它的分泌物的性质、发酵周期长短、培养物的营养成分和养成分和pHpH值的差异，对所用的无菌空气的无菌程度有值的差异，对所用的无菌空气的无菌程度有不同的要求。如酵母培养没有氨基酸、液体曲、抗生素不同的要求。如酵母培养没有氨基酸、液体曲、抗生素发酵那么严格。发酵那么严格。 （3 3）空气含菌量测定）空气含菌量测定 难以准确测定，一般采用培养法和光学法。难以准确测定，一般采用培养法和光学法。 目前我国采用目前我国采用Y-09Y-091 1型粒子计数
45、器，是利用微粒对光线型粒子计数器，是利用微粒对光线散射作用来测量粒子大小和数量的。总菌数的测定；重叠细散射作用来测量粒子大小和数量的。总菌数的测定；重叠细菌则难以测准。菌则难以测准。 发酵空气的标准发酵空气的标准- 连续一定流量的压缩无菌空气。 空气流量：单位时间（min）单位发酵液体积（m3）内通入的标准状态下的空气体积（m3），一般在0.1-2.0。 压强：压力表显示0.2-0.4 MPa，克服下游阻力。 空气质量：相对湿度小于70；温度比培养温度高1030；洁净度100级，或失败率103。 二、空气净化的方法空气除菌就是除去或杀灭空气中的微生物。除去方法：静电吸附、介质过滤。杀灭方法：辐
46、射、热杀菌、化学药物杀菌。 热灭菌法热灭菌法：经压缩机压缩后，：经压缩机压缩后，200以上以上 静电除菌法静电除菌法：静电除尘器除去空气中的水：静电除尘器除去空气中的水雾、油雾、尘埃、微生物雾、油雾、尘埃、微生物 介质过滤除菌法：介质过滤除菌法：经济实用经济实用，采用定期灭，采用定期灭菌的介质来阻截空气中的微生物。菌的介质来阻截空气中的微生物。（一）、空气过滤除菌 1.空气过滤除菌原理 空气通过过滤介质时空气通过过滤介质时, ,由于阻碍导致气流出现无数次改变由于阻碍导致气流出现无数次改变运动速度和方向，绕过纤维前进，存在五种作用机理。运动速度和方向，绕过纤维前进，存在五种作用机理。不同于液体过
47、滤不同于液体过滤布朗扩散截留作用布朗扩散截留作用 惯性截留作用惯性截留作用 拦截截留作用拦截截留作用 重力沉降作用重力沉降作用 静电吸引作用静电吸引作用 惯性截留作用惯性截留作用p当微生物等颗粒随空气以一定的速度流动，在接近纤维时，气流碰到纤维而受阻，空气就改变运动方向绕过纤维继续前进。但微生物等颗粒由于具有一定的质量，在以一定速度运动时具有惯性，碰到纤维时，由于惯性作用而离开气流碰在纤维表面上，由于摩擦、粘附作用，被滞留在纤维表面上，这叫做惯性滞留作用p当气流达到一定速度时，它是介质过滤除尘的主要作用。 布朗扩散截留作用 拦截截留作用p在气流速度在临界速度以下，由于速度很低时，在纤维周边形成
48、一层边界滞留区，在滞留区内气流速度更慢，在滞留区内的颗粒缓慢接近纤维，并与之接触，由于摩擦、粘着作用而被滞留。w 重力沉降作用w 静电吸引作用 当空气流过介质时，上述五种除菌机理同时起作用，不过气流速度不同，起主要作用的机理也就不同。当气流速度较大时，除菌效率随气流流度的增加而增加，此时惯性冲击起主要作用；当气流速度较小时，除菌效率随气流流度的增加而降低，此时扩散起主要作用；当气流速度中等时，可能是截留起主要作用。如果空气流速过大，除菌效率又下降，则是由于已被捕集的微粒又被湍动的气流夹带返回到空气中。（二）、空气净化流程提高空气的洁净度 冷却后除去空气中油和水 总过滤器和分过滤器除菌 获得无菌
49、空气 经过空气压缩机空气净化的一般流程 1 1、两级冷却、加热除菌流程、两级冷却、加热除菌流程 1 1）、比较完善的空气除菌流程，可适应各种气候条件，）、比较完善的空气除菌流程，可适应各种气候条件，能充分地分离油水，使空气达到低的相对湿度下进入过能充分地分离油水，使空气达到低的相对湿度下进入过滤器，以提高过滤效率。滤器，以提高过滤效率。 2 2）、特点：两次冷却、两次分离、适当加热。）、特点：两次冷却、两次分离、适当加热。 3 3）、尤其适用潮湿的地区，其他地区可根据当地的情况，）、尤其适用潮湿的地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。对流程中的设备作适当的增减。介绍几种典
50、型流程 2 2、冷热空气直接混合式空气除菌流程、冷热空气直接混合式空气除菌流程 1 1）、压缩空气从贮罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温）、压缩空气从贮罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合。度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合。 2 2）、特点是可省去第二次冷却后的分离设备和空气加热设备，流程比较简单，）、特点是可省去第二次冷却后的分离设备和空气加热设备，流程比较简单，利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少等。利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少等。 3 3）、适
