1、植物免疫学第八章 植物与病原物互 作的相关基因寄主一病原物相互关系中主要问题的研究渊源（数字为发表年份或研究兴起的大致年代）“在具有一个抗病基因（抗不含毒性基因的小种）的亚麻品种上，病菌小种杂种F2中出现一对因子的分离比；在具有2个、3个或4个抗病基因的品种上，病菌小种杂种F2中相应出现2对、3对或4对因子的分离比。这说明：对应于寄主方面的每一个决定抗病性的基因，病菌方面也存在一个决定致病性的基因。”寄主寄生物体系中，“任何一方的每个基因，都只有在另一方相对应的基因的作用下才能被鉴定出来。”8.1 基因对基因假说亚麻锈菌小种22号小种24号的F1在Ottawa770B，Bombay两品种上的致
2、病性分离比（两对因子）（据Flor，1956）品种及其基因型品种的反应亲本小种基因型小种杂种F2基因型的分离22aLaLANAN24ALALaNaNAL_AN_ aLaLAN_ AL_aNaNaLaLaNaNOttawa 770BLLnn感(病)免免感免感BombayllNN免(疫)感免免感感观察菌系比理论比例(9:3:3:1)78:27:23:575:25:25:8符号说明：L和N为两个不同的抗病基因；aL为对L的隐性毒性基因，AL为其显性无毒性基因；aN为对N的隐性毒性基因，AN为其显性无毒性基因OttawaBombay1 F2对亚麻锈菌小种22号和24号的反应的分离比（据Flor，195
3、6）小种及其基因型寄主基因型及其反应亲本F2Ottawa LLnnBombay llNNL_N_L_nnllN_llnn小种22aLaLANAN感免免感免感小种24ALALaNaN免感免免感感观察植株数理论比例(9:3:3:1)110:32:43:9109:36:36:12该学说认为：植物对某种病原物的特异抗性取决于它是否具有相应抗性基因，而同时病原物的专一致病性取决于病原物是否具有无毒基因也就是说寄主分别含有感病基因（r）和抗病基因（R），病原物分别含有毒性基因（Vir）和无毒基因（Avr）只有当具有相应抗病基因的植物与具有无毒基因的病原物相遇时，才会激发植物的抗病反应，其他情况下二者表现亲
4、和，即寄主感病寄主植物与病原菌之间“基因对基因”关系的简要模型A. 通用模式 B. 一种特殊模式小麦小麦锈菌系统“基因对基因”关系的简要模型“”表示不亲和反应（抗病）；“+”表示亲和反应（感病）（1）抗病基因Hx和非毒性基因Px为显性基因，这是最普通的模式（2）病菌显性逆转，Hx表示抗病基因，Px表示毒性基因（3）寄主显性逆转，Hx表示感病基因，Px表示非毒性基因（4）病菌和寄主双方发生显性逆转，Hx表示感病基因，Px表示毒性基因 已证实或已推证出有基因对基因关系存在的寄主一寄生物系统（选录自Flor 1971 和Day 1974）亚麻锈病 LinumMelampsora linti马铃薯晚疫
5、病 SolanumPhytophthora infestans小麦秆锈病 TriticumPuccinia graminis tritici番前叶霉病 LycopersicumCladosporium fulvum小麦条锈病 TriticumP. striiformis马铃薯癌肿病 SolanumSynchytrium endobioticum小麦叶锈病 TriticumP. recondita玉米锈病 ZeaPuccinta sorghi燕麦秆锈病 AvenaP. graminis avenae燕麦冠锈病 Avena一Puccinia cronasa咖啡锈病 CoffeaHemileia v
6、astatrix大麦散黑穗病 HordeumUstilago hordei向日葵锈病 Helianthus一Puccinia helianthi马铃薯金线虫病 SolanumHeterodera rostochiensis小麦网腥黑穗病 TriticumTilletia caries棉花角斑病 GossypiumXanthomonas malvacearum小麦矮腥黑穗病 TriticumT. contro versa番茄病毒病 LycopersicumTMV小麦散黑穗病 TriticumUstilago tritici番茄斑萎病 LycopersicumSpotted wilt virus大
7、麦白粉病 HordcumErysiphe graminis hordei 马铃薯病毒病 SolanumX virus小麦白粉病 TriticumE. g. tritici向日葵列当 HelanthusOrobanche sp.苹果黑星病 MalusVenturia inequalis 小种鉴定中鉴别寄主的改进 新小种可以预见 品种抗病基因型和病原物毒性基因型的鉴定 抗病性机制研究 寄主和寄生物共同进化的理论研究专化性（specificity）识别（recognition）亲和性（Compatible） R基因和r基因一样，是植物正常代谢所需基因 原生功能是一样的，只是次生功能相反 当无毒菌系入
8、侵后，R植株表现抗病，r植株感病 无毒性基因不是一个病菌的自杀基因，而有其与毒性基因相同的原生功能，为病菌正常代谢所需8.2 植物抗病基因和防卫反应基因 抗病基因（resistance gene，R gene）：侦知病原物的侵犯，发出抵抗指令 防卫反应基因（defence response gene）：执行和完成防卫反应 在植物抗病性研究和利用中，都以小种专化性抗病性，即以HR反应为特征的主动抗病性为主要对象，抗病性相关基因的探讨亦不例外8.2.1 植物已知抗病基因 植物的抗病基因是指与病原物无毒基因匹配，而启动不亲和互作的基因，也称为识别基因 抗病基因编码的蛋白质有两个基本作用： 识别相应的
9、Avr衍生信号； 激活下游信号传导，引发复杂的防御反应抗病基因在染色体上的组织和排列抗病基因在染色体上的组织和排列一个座位仅有单个R基因，称为简单基因座（simple locus）。简单位点可能有多个复等位基因 亚麻的L座位有13个等位基因，分别对抗亚麻锈菌的不同小种 拟南芥的Rpp13也是简单座位，具有功能不同的等位基因 拟南芥的Rpm1和Rps2等位点，除了一个抗病基因外，也有功能不明的等位基因。拟南芥不同生态型之间，该两基因的等位基因有相当大的序列差异复合座位（complex locus），R基因在染色体上成簇（cluster）存在。有些以串联方式构成基因家族（gene family），
10、基因间距离因物种而异 亚麻M基因座是复合的，已鉴定的7个抗病基因以串联重复的方式簇集在该基因座上 抗病基因Pto、Cf2、Cf9、N、Xa21等都位于此类复合基因座位 同一簇的不同基因甚至可以分别抵抗不同类群的病原物 有的抗病基因簇在植物染色体上占据相当大的区段，超出了一个基因家族的范围。另一些抗病基因则在DNA某些特殊区域呈松散簇状分布，基因座相隔12 cM复合基因座位中可能含有功能相似或相关的不同基因 番茄Pto基因簇有5个编码蛋白激酶的基因，它们紧密连锁，还有对有机磷杀虫剂倍硫磷敏感基因Fen和Prf基因 抗病基因Pto和丁香假单胞无毒基因avrPto的识别需要Prf基因的参与，后者编码
11、含LRR和NBS的蛋白质有的基因座位具有两个基因共同控制抗病专化性 番茄的Cf2/Cf5基因座位和Cf4/Cf9基因座位 另外，不同种的植物可能含有识别功能一致的R基因，同一R基因也可能识别相同病原菌不同小种的avr基因。同源程度较高的核苷酸序列的串联重复，有利于基因内和基因间的重组，导致较大基因区段的交换，或基因内精细结构的改变基因突变、重组、重复、缺失、核苷酸置换等都有利于抗病基因多样化和抗病专化性的分化。总之，这种成簇分布的抗病基因复合体在遗传上是不稳定的。8.2.2 抗病基因产物的结构特点 抗病基因的共同结构域富亮氨酸重复（leucinerich repeats，LRRs）卷曲螺旋结构
12、（coiledcoil，CC）核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS）跨膜结构域（transmembrane domain，TM）丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶结构域 (serine/threonine kinase，S/TK)亮氨酸拉链（leucine zipper，LZ）Toll/白介素1同源区域（TollInterlenkin1 like receptor，TIR）R基因编码R蛋白的结构特点核苷酸结合位点（Nucleotide binding site，NBS） 抗病蛋白的NBS区有3个特征保守区， 第1区域为磷酸结合环(Ploop)，又称激酶la(Kinase
13、 la)，其共有序列为GM(GPP)GNGKTT(aPT) 第2区域为激酶2，共有序列为X(XPR)XaaaaDDV(WPD) 第3区域为激酶3a，其保守区为SraaaT(TPS)R R基因编码产物中NBS的存在，表明R基因的功能之一是磷酸化，通过磷酸化识别配体，导致一系列抗性反应的发生 NBS主要氨基酸的突变可导致抗性的降低或消失。RPS4和RPS5中NBS结构域的结构，显示保守基序的位置蛋白质结构是带状图所示：Ploop (蓝色)；RNBSA (绿)；kinase2 (品红)； RNBSB (green)；RNBSC (绿)；GLPL (黄)；RNBSD (绿)；MHDV (橘黄)富含亮氨
14、酸重复 ( Leucine rich repeats，LRR )富含亮氨酸重复( LRR) 因亮氨酸在这一结构中呈规律性重复而得名LRR 存在于多种不同的蛋白中，与蛋白质间相互作用及信号传导密切相关。在功能方面，LRR决定着与配体结合的专一性，即决定着寄主与病原的特异性识别抗病蛋白所含的LRR结构可大至分为2类：定位于胞外的 LRR，共有序列为“LXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX”定位于胞质的 LRR，共有序列为“aXXXXXLXXLXLXX(XPC)XXXXXaXXX”可以看出所有LRR都具有“XLXXLXLXX”结构。 根据拟南芥抗病原菌假单胞菌丁香蛋白5（RPS5）中的LRR
15、预测的LRR域结构a)一个代表性的RPS5 LRR域的结构预测。折叠形成凹脸的“马蹄形”由箭头所示b)在12个核心蛋白聚糖中富含亮氨酸重复的比对结果和在RPS5中13重复以及氨基端的9个氨基酸 亮氨酸拉链(Leucine zipper，LZ ) LZ 存在于一些寡聚蛋白中，许多DNA结合蛋白就含有LZ LZ 中每7 个氨基酸残基构成一个重复，第7 位置上的残基为( 异) 亮氨酸。这些( 异) 亮氨酸在蛋白质二级结构中形成螺旋的疏水脊, 在疏水交互作用下, 两个LZ 中的( 异) 亮氨酸残基形似拉链, 将其所在的亚基聚合成多聚体 LZ在真核生物转录因子的同源及异源二聚体形成中起着重要作用，相似的
16、卷曲螺旋结构域(Coiledcoil domains)促进了蛋白之间的相互作用，并导致许多其他功能的产生亮氨酸拉链丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶 ( SPT protein kinase )SPT 蛋白质激酶是植物的受体类蛋白激酶(Receptorlike kinase，RLX ) 的主要形式，其功能主要有以下几点：与一些信号分子如激酶、生长因子、性因子等相互作用的传导信号 参与防御反应。如B细胞中的抗体和T细胞中的受体通过识别外来分子启动下游激酶产生一系列级联反应，最终产生免疫作用；在细胞分裂过程中控制分裂时期对一些自然逆境如缺乏关键元素产生反应SPT蛋白激酶的2个特征保守区分别为DaKXXN 和
17、 GTaGYXAPCNPE白细胞介素1受体相似的区域( TIR ) 果蝇的Toll 蛋白及哺乳动物的白介素1受体，在各自的免疫系统信号传导中起重要作用 通过对病原物的结合，将信号传导给传导因子。如果蝇的Dif 因子和哺乳动物的NFKB 因子。 这些传导因子获得由细胞质向细胞核内运输的能力，并与各免疫反应基因的启动子相结合，引起免疫反应基因的表达，从而对病原物产生抗性。 越来越多的证据表明，植物中可能也存在与哺乳动物和昆虫自然免疫系统相似的抗病途径。抗病基因产物的类别1. NBS-LRR类蛋白类蛋白 大多数R基因属NBSLRR类，其共同特点是：在它们编码蛋白的近N端有核苷酸结合位点（NBS），而
18、在近C端有富亮氨酸重复序列（LRR） 这类蛋白一般存在于细胞质中。NBS结构暗示它们在发挥功能时可能要结合ATP或GTP，而LRR结构则表明它们可能作为受体，结合病原物产生的某种配体，从而启动细胞信号传递过程和产生防卫反应 对亚麻R基因的研究表明，LRR可能决定着R基因的专化性，它的改变将会引起R基因抗病谱的改变。LRR不仅有感应信号的作用，而且在下游信号传递中也起作用NBS-LRR类蛋白类蛋白(1) TIR-NBS-LRR亚类亚类烟草的N，亚麻的L6、M，拟南芥的RPP5等基因产物N端有一个较大的TIR结构域，用于信号传递烟草N基因产物是一个胞质内定位的蛋白，其N末端结构与哺乳动物白细胞介素
19、1受体（IL1R）的胞质域以及果蝇Toll蛋白的胞质域具有高度相似性。IL1R的胞质域在病原物信号的作用下，可引起转录因子NFkB活化以及从细胞质到细胞核的位移，进而激活防卫基因的转录和表达。烟草的N蛋白可能也有类似的机制。TIR结构也可能参与了对病原物的识别。对亚麻抗锈病基因L的13个等位基因的研究发现，TIR域的变异导致了病原物识别的变化。总之，TIR和LRR结构都可能在病原物识别中起作用。(2) LZ-NBS-LRR亚类亚类在N端连接有亮氨酸拉链（LZ），拟南芥的RPS2、RPM1，大麦的Mla1等基因的产物都具有LZ结构。LZ在正常情况下参与形成蛋白二聚体，可能与病原物配体的特异性结合
20、有关。进一步的研究发现，本亚类的显著特征是NBS之间具有卷曲螺旋序列（coiledcoil，CC），也可据此命名为CCNBLRR亚类。在拟南芥中，具有TIR的蛋白是通过含EDS1基因途径传递信号，而LZ类蛋白传递的信号则需要NDR1基因。如前所述，LRR结构域参与蛋白质蛋白质互作，促进基因产物与其他信号蛋白质的作用。LRR结构中单个氨基酸的改变，就可导致寄主植物HR反应能力的丧失。R蛋白中的NBS结构域具有高度保守性，这说明核苷酸结合对R基因发挥功能是必不可少的。(3) NBS-LRR亚类亚类辣椒Bs2、莴苣Dm3、番茄I2等基因的产物属于此亚类，仅有NBS和LRR结构域。(4) TIR-NB
21、S-LRR-NLS-WRKY亚类亚类仅有拟南芥抗青枯病的RPS1基因产物，在NBSLRR蛋白的C端有一个WRKY结构域。WRKY蛋白是植物特异性锌指转录因子（plantspecific zincfinger transcription factors），常在防卫反应中被诱导，与多个病原菌诱导的启动子顺式作用元件结合。这就意味着基因编码产物可结合DNA，从而激活其他抗病相关基因。(5) 水稻水稻Pi-ta蛋白亚类蛋白亚类该蛋白有NBSLRD结构，LRD为富亮氨酸结构域（leucinerich domain），不是典型的LRR。2. eLRR-TM类类R蛋白蛋白没有NBS位点，仅有胞外LRR结构域
22、（eLRR）和跨膜结构（TM)。番茄对叶霉病菌不同生理小种有若干抗病基因，其中Cf9、Cf2、Cf4和Cf-5等基因的产物有eLRRTMsCT结构，俱为锚定于细胞膜上的糖蛋白受体，具有N端信号肽。在细胞膜外存在着一个巨大的LRR构成的受体结构域，占据了蛋白质分子的大部分。这类蛋白具有跨膜区，但在胞质内的部分仅有单一胞质尾（single cytoplasmic tail，sCT），包含数十个氨基酸残基。进一步分析表明，各Cf基因产物的LRR结构比NBSLRR类蛋白的LRR更为均匀一致，它们之间的高度同源，尤其是后面9个LRR几乎一样，这可能是由于所抵抗的对象是同一病原菌的不同小种。拥有LRR结构
23、的蛋白不仅可以接受病原菌配体信号，而且还可能与其他蛋白结合。Cf9蛋白拥有巨大的LRR结构域，这可能使它除与Avr9多肽结合外，仍可与其他种类的蛋白相互作用，共同参与植物防卫反应信号传递。比较Cf2、Cf4、Cf5和Cf9等四种基因编码的蛋白，显示出C端保守性强，而N端差异较大的特点。这说明C端可能与共同信号传递有关，而N端则与特异性的识别有关。3. S/TK类R蛋白番茄对丁香假单胞番茄致病变种的抗病基因Pto，编码产物为位于胞质内的丝氨酸苏氨酸激酶（S/TK），没有NBS和LRR结构域对PtoavrPto基因互作的研究，发现病原细菌AvrPto蛋白进入植物细胞后，可与胞内的Pto激酶直接作用
24、。但Pto和avrPto基因的识别还需要另一基因Prf的参与。Prf基因与Pto基因紧密连锁，编码含有LRR和NBS结构的蛋白。Pto和Prf蛋白分别类似于水稻Xa21蛋白的胞外域和胞内域，因此推测Pto和Prf蛋白很可能构成了一个受体系统，在功能上相当于Xa21的酪氨酸受体激酶Pto蛋白具有蛋白激酶的代谢活性，在接受avrPto信号后，Pto激酶活性被激活，自动磷酸化，使Pti1基因和类似基因编码的蛋白磷酸化，进而引发了信号传递下游蛋白的一系列磷酸化级联反应4. eLRRTMS/TK类蛋白 水稻抗白叶枯病基因Xa21编码的蛋白是由1025个氨基酸组成的受体蛋白激酶。 Xa21蛋白包含胞外富亮
25、氨酸重复（eLRR）结构域和胞内丝氨酸苏氨酸激酶（S/TK）结构域两部分，通过一个跨膜区域连在一起。 LRR结构是由23个不完全的重复单位组成，参与蛋白质蛋白质的相互作用，与病原菌的识别有关。 S/TK结构域含15个保守氨基酸，是典型的信号分子。从整体上看，Xa21蛋白是一个具有激酶活性的跨膜受体。5. 病原菌毒素降解酶 玉米抗圆斑病基因Hm1的产物是依赖于NADPH的HC毒素还原酶，属于病原菌毒素降解酶（detoxifying enzyme），该基因抵抗玉米圆斑病菌1号生理小种的侵染 病原菌的HC毒素缺陷菌株对不含Hm1的玉米无致病性 Hm1与HC毒素基因间的互作没有“基因对基因”关系6.
26、G蛋白偶联受体大麦的mlo基因是控制大麦对白粉病广谱抗病性的隐性基因，位于大麦4号染色体的长臂上。具Mlo基因的感病大麦品种诱导突变后，突变株缺失Mlo或变成隐性mlo基因，也获得广谱抗病性。该基因与病原菌匹配基因的互作也不符合基因对基因关系。Mlo基因家族大约有35个成员。在水稻、拟南芥、棉花、西瓜等多种植物中都存在Mlo的同源基因或同源序列。mlo基因编码60ku的蛋白，有7个跨膜螺旋（TM），其N端位于胞外，有糖基化位点，C端位于胞内，具有一个推测的核定位位点（nuclear locatization site，NLS）和两个位于核定位信号下游的酪氨酸激酶II位点，NLS和激酶之间通常相
27、隔1030个氨基酸。含有核定位信号表明Mlo可能会被转运至细胞核。对拟南芥中发现的25个Mlo家族成员的比较表明，它们有着相同的基因结构和蛋白质空间构象。进一步研究表明，Mlo基因编码的蛋白，类似于哺乳动物的G蛋白偶联受体（Gproteincoupled receptors，GPCRs）。这类受体通过与配体结合，传递胞外信号并激活异源G蛋白亚基而转化为放大的胞内信号。7. 其他类型拟南芥对白粉病的广谱抗病基因RPW8，编码较小的具CC结构域的蛋白质，其N端有一个推测的信号锚定（signal anchor，SA）结构域，可能是一种膜蛋白。大麦对秆锈病的抗病基因可能编码受体蛋白，接受病原菌信号，但
28、不连接于细胞膜，其C端有两个蛋白激酶结构。Hs1pro1是甜菜抗胞囊线虫的基因，其产物为一跨膜的LRRTM蛋白，但又不同于其他一些具有LRRTM结构的蛋白，Hs1pro1的信号肽和跨膜区都很短，并且含有许多带电荷的氨基酸残基。其LRR结构域也缺少其他LRR所共有的特征，既缺少亮氨酸间隔，也没有其他特殊的氨基酸残基。为此，Hs1pro1被认为是胞质蛋白成员中的新类型。已知植物对病毒病害的抗病基因部分编码NBSLRR类蛋白，其余多为类似木菠萝凝集素（jacalin）序列或真核翻译起始因子4E（eIF4E）8.2.3抗病基因的功能1. 典型的典型的R基因基因R基因编码产物为受体蛋白，特异性地识别作为
29、配体的病原物无毒基因（avr）产物，即激发子激发子（elicitor）。两者的互作符合典型“基因对基因”关系。两者的识别启动了寄主信号传递系统（signal transduction cascade）。多种R蛋白具有的推定的信号结构域（putative signalling domain），介导蛋白质蛋白质的互作。例如，富亮氨酸重复（LRR）被认为是受体蛋白，起识别作用。在抗病基因编码的蛋白中，若LRR发生突变，R基因的功能就被抑制。LRR不仅在感应信号上起作用，而且在下游信号传递中也起作用。这些信号激发了植物防卫基因的转录，编码所需要的蛋白质，诸如谷胱苷肽S转移酶、过氧化物酶、细胞壁蛋白、蛋
30、白酶抑制物、水解酶（几丁质酶、1,3葡聚糖酶等）、发病相关蛋白以及次生物代谢有关的酶类。与侵入病原物直接接触的植物细胞发生过敏性坏死。2. 编码产物可钝化病原菌毒素的编码产物可钝化病原菌毒素的R基因基因 已经克隆的有玉米的Hm1基因 该基因编码NADPH依赖性还原酶，可钝化玉米圆斑病菌（Cochliobolus carbonum）1号小种产生的HC毒素 它与病原菌产毒基因的互作不符合典型“基因对基因”关系。3. 编码产物为病原菌标靶的编码产物为病原菌标靶的R基因基因 植物若缺少此标靶，就表达抗病性。 玉米的线粒体基因Turf13，控制雄性不育性和对T毒素的敏感性。 T毒素是玉米小斑病菌T小种产
31、生的小种专化性毒素。具有T-urf13基因的玉米对毒素敏感，从而感病；而缺乏T-urf13基因的玉米自交系或品种则抵抗小斑病。4. 编码产物控制植物防卫反应的编码产物控制植物防卫反应的R基因基因 大麦抗白粉病的隐性mlo基因，该基因控制乳突的产生等防卫反应，表达广谱抗病性。 即使没有病原菌侵染，隐性抗病基因仍可使植物产生细胞壁类似物和坏死斑。 感病品种具有其显性等位基因Mlo。已知Mlo基因产物可能对植物细胞坏死或其他防卫反应起逆向调控作用。 抗病基因：与病原物无毒基因匹配，而启动不亲和互作的基因，也称为识别基因 抗病基因编码的蛋白质的作用 识别相应的Avr衍生信号； 激活下游信号传导，引发复
32、杂的防御反应 抗病基因的共同结构域富亮氨酸重复（leucinerich repeats，LRRs）卷曲螺旋结构（coiledcoil，CC）亮氨酸拉链（leucine zipper，LZ）核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS）丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶结构域 (serine/threonine kinase，S/TK)跨膜结构域（transmembrane domain，TM）Toll/白介素1同源区域（TollInterlenkin1 like receptor，TIR）抗病基因产物的类别1.NBSLRR类蛋白2.eLRRTM类R蛋白3.S/TK类R蛋白4.e
33、LRRTMS/TK类蛋白5.病原菌毒素降解酶6.G蛋白偶联受体7.其他类型抗病基因的功能1.典型的R基因编码产物为受体蛋白2.编码产物可钝化病原菌毒素的R基因3.编码产物为病原菌标靶的R基因4.编码产物控制植物防卫反应的R基因8.2.4 防卫反应基因 植物的防卫反应基因（defence response gene）是指植物被病原物侵染后，在病原物激发子诱导下表达防卫反应功能的相关基因，其编码产物直接或间接地作用于病原物 防卫反应基因的作用一般不具有专化性，不同种类的寄主植物中有类似的防卫反应基因。但有些防卫反应基因产物仅对特定病原物类群有效。 在抗病品种与感病品种之间，防卫反应基因的作用出现表
34、达时间和表达量的差别寄主病原物相互作用中的防卫反应类型重要防卫反应基因 与抑菌活性物质合成及代谢有关的基因，此类物质主要有植保素、天然抗菌素等 与各类发病相关蛋白基因、核糖体失活蛋白、抗菌肽、水解酶等相关的基因 与植物细胞壁修饰作用和细胞壁类似物质合成有关的基因 与病原菌致病因子解除有关的基因，包括与降解病原菌毒素、抑制病原菌致病酶类有关的基因等防卫反应基因的结构特点 植物防卫反应基因多以基因家族出现 常有多种同工酶，各种同工酶的基因不相同 不同同工酶的基因在基因组中的拷贝数不同 不同植物中编码同一诱导抗性因素的基因具有保守性（如PR蛋白基因），但在DNA碱基序列上可能也存在着一定的差异防卫反
35、应基因的表达调控 植物防卫反应多数是诱导性的，基因对信号刺激应答迅速 各种防卫反应基因的表达具有组织和细胞类型的特异性，相互间存在着时间上的差异 基因表达存在时空差异，首先诱导表达的是与植保素合成有关酶的基因，其后是水解酶基因和PR蛋白基因，再后是木质素和HRGP以及GRP基因等 防卫反应和基因表达的强弱在不同植物中有所不同，同时会受到外界处理信号的影响防卫反应基因的多重功能和多重反应 防卫基因的存在不单单是为防卫反应而准备的，植物正常生活中也需要它们定量的表达 编码一种因素的基因在植物防卫反应中可以受多种不同类型因子的诱导8.3 病原物致病性相关基因 无毒基因（avirulence gene
36、，avr gene）是与植物匹配R基因互作，引起不亲和反应的基因，但也有其他作用 致病性基因（pat gene）控制各种致病性因子的作用 病原细菌致病性的决定因子，除了无毒基因外，还有过敏性反应和致病性基因（hrp gene）以及病害专化致病性基因（dsp gene）等8.3.1病原物的无毒基因 病原物的无毒基因产物与寄主R基因产物互补，发生不亲和互作。 无毒基因主要决定对植物不同品种的无毒性，有时也决定对不同种植物的无毒性，因而也称为寄主专化性基因或反向调节寄主范围的基因。后来发现无毒基因对亲和性互作也起重要作用。 Staskauicz等（1984）从丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomo
37、nas syringae pv. glycinea）克隆到第一个无毒基因avrD 迄今已经克隆的无毒基因多数属于病原细菌1. 植物病毒的无毒基因植物病毒基因组的任何部分似乎都可以作为无毒性决定因子（avirulence determinant）对于控制HR反应的显性R基因，无毒基因产物包括病毒外壳蛋白、复制酶、移动蛋白等 马铃薯抗马铃薯病毒X的Nx、Rx1和Rx2基因，烟草抗番茄花叶病毒的N基因，拟南芥抗黄瓜花叶病毒的RCY1基因，辣椒抗烟草花叶病毒属的L1、L2和L3基因等，无毒性因子都是外壳蛋白（CP） 烟草抗烟草花叶病毒的N基因和番茄抗番茄花叶病毒的Tm1基因等，无毒因子为复制酶 番茄抗
38、番茄花叶病毒的Tm2基因和Tm22基因，无毒因子为30ku移动蛋白对于已知隐性抗病基因，虽抗病机制不同，但多以病毒VPg蛋白为致病因子病毒的无毒基因除了与寄主抗病基因互作外，还有其本身的生理功能2. 细菌的无毒基因 主要来源于假单胞菌属（Pseudomonas）和黄单胞菌属（Xanthomonas）的病原细菌 这些基因位于染色体或质粒上，编码亲水性可溶蛋白质，不具有典型的信号肽 已分离得到的细菌无毒基因，除avrBs3和avrRxv/yopJ家族外，大部分没有同源性或同源性很低 大多数无毒基因是单顺反子，具有开放阅读框架，其产物也没有髙度保守的结构域 根据产物结构特点，细菌无毒基因可大致分为两
39、类，即avrBs3类基因和avrRxv/yopJ类基因。（1）avrBs3类无毒基因家族包括多数克隆自黄单胞菌和茄劳尔氏菌的无毒基因avrBs3基因家族各成员的蛋白具有序列同源性，其中心区域都有由34个氨基酸为重复单元构成的串联重复序列，重复序列数量在决定细菌寄主范围上起关键性作用，在C末端具有细胞核定位信号（nuclear localization signals，NLSs）和酸性转录激活域（acid transcriptional activation domain，AAD）这些无毒基因激发抗病寄主的HR反应，在感病寄主上则加重水浸状症状，或引起溃疡、肿瘤症状avrBs3来源于野油菜黄单胞
40、菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria），其编码蛋白的中心区具有17.5个重复序列，序列大小为102bp，AvrBs3的标靶可能是寄主细胞核水稻白叶枯病菌中的无毒基因avrXa7、avrXa10、avrxa5、avrp3等也属于avrBs3基因家族AvrBs3类蛋白在细菌细胞外不能发挥作用，通过细菌的III型泌出系统，转运进入植物细胞（2）avrRxv/yopJ类无毒基因家族最先分离得到的是来源于油菜黄单胞菌疮斑致病变种（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria）的avrRxv，及来源于耶耳尔森氏菌属（Yersini
41、a）的YopJ。该家族还包括来自假单胞菌属、黄单胞菌属、劳尔氏菌属、根瘤菌属以及哺乳动物病原细菌的其他无毒基因编码小型亲水性蛋白，多数分子质量为1840 ku，个别的高达100ku。除AvrD和AvrBs2外，绝大多数基因产物与已知蛋白没有显著的序列同源性。除了少数特例外，编码产物的机能不明。丁香假单胞菌番茄致病变种的avrD基因编码一种酶，催化细菌合成丁香酮酯（syringolide），可激发具有Rpg4抗病基因的大豆品种发生HR反应野油菜黄单胞菌的AvrBs2蛋白与农杆糖酯合成酶和甘油磷酸二酯酶有较高同源性，这两种酶与葡聚糖的合成有关，因而AvrBS2蛋白可能作为一种酶，促进葡聚糖的合成，
42、后者可能是抗病寄主识别的信号物质3. 真菌和卵菌的无毒基因（1） 稻瘟病菌的无毒基因 决定稻瘟病菌的品种专化性，avr Pi-ta等与品种抗病基因特异性互作的基因。avr Pi-ta编码产物为含223个氨基酸的中性锌金属蛋白酶，成熟蛋白含176个氨基酸。AvrPita176可直接与水稻胞内Pita蛋白的富亮氨酸结构域（LRD）结合，激发防卫反应 决定稻瘟病菌的寄主物种专化性（host species specificity），如弯叶画眉草致病性基因PWL。PWL2基因阻止稻瘟病菌侵染弯叶画眉草（Eraragrostis curvula），决定稻瘟病菌寄主范围，产物为富含甘氨酸的蛋白，内含一个信
43、号肽（2） 番茄叶霉病菌的无毒基因已有4个无毒基因被克隆，即avr2、avr4、avr4E和avr9。产物均为小分子质量蛋白，含有偶数个半胱氨酸，可能形成二硫键，都具有信号肽，成熟产物能被分泌到细胞间隙，在诱导过敏性反应中起重要作用叶霉病菌毒性小种中，无毒基因的存在与否及存在方式均不相同，avr9完全缺失，avr4缺失或产生点突变，avr2以截短形式存在，avr4e缺失或以稳定的突变形式存在，表明叶霉病菌通过不同策略克服抗病基因作用叶霉病菌无毒基因具有无毒和毒性双重作用。例如，Avr9和Avr4除被Cf9和Cf4识别，并诱发过敏性反应外，Avr9可能在叶霉病菌氮素代谢中起调节作用，Avr4具有
44、几丁质结合活性，它与菌丝细胞壁的几丁质相结合，使其避免被植物几丁质酶降解叶霉菌侵染的番茄叶片胞间液中还有许多小分子质量的胞外蛋白（extracellular protein，ECP），这些ECP均小于20ku，含偶数半胱氨酸残基，具有激发子活性。编码胞外蛋白ECP1、ECP2、ECP4和ECP5的4个基因已被克隆。Ecp2对某些番茄品系具有无毒基因功能。（3）卵菌无毒基因和激发素从寄生疫霉（Phytophthora parasitica）克隆到的无毒基因para1，编码一种称为寄生素（parasiticein）的激发子，激发植物物种的抗病性从致病疫霉（Phytophthora infestan
45、s）克隆到的Inf1基因，编码一种称为致病素（infestin）的激发子，激发本氏烟抗病性。Inf1表达被抑制的菌株则有致病性寄生素和致病素都属于激发素，激发素（elicitin）是疫霉属和腐霉属卵菌分泌的，分子质量约10ku蛋白类激发子。激发素是一种无毒因子，用激发素处理茄科、十字花科等植物诱发过敏性反应和系统获得抗病性。激发素具有对疫霉菌有利的固有功能，可能对另一些植物起致病因子作用。有的试验表明，不产生激发素的疫霉突变菌株，对烟草和番茄不致病，也不产生孢子囊和卵孢子。激发素具有转移甾醇的功能，疫霉菌和腐霉菌不能合成甾醇，依靠激发素从植物细胞中获取甾醇，促进生长发育。4. 无毒基因的功能
46、激发过敏性抗病反应。若无毒基因失活或缺乏，则表现亲和性 avr基因编码Avr蛋白，但其生化活性还不甚清楚 Avr蛋白被认为是一类二元功能作用子（bifunctional effector），在决定病原细菌的无毒性和致病性（毒性）两方面都起作用 8.3.2 病原细菌的hrp基因和dsp基因 植物病原细菌大多数为革兰氏阴性菌 革兰氏阴性病原细菌都具有所谓“过敏性反应和致病性基因”（hypersensitive reaction and pathogenicity gene，hrp基因）和“病害专化性致病基因”（disease specific pathogenicity gene，dsp基因） 1
47、. 细菌的hrp基因及其产物（1） hrp基因20世纪80年代，从丁香假单胞菌菜豆致病变种和丁香假单胞菌丁香致病变种中鉴定和分离出了hrp基因hrp基因一般为2027个。大多数病原细菌的hrp基因位于染色体上，多个hrp基因集中分布，可构成hrp基因簇，大的hrp基因簇长度达1741kb，小的hrp基因簇长度只有2.54kb。茄劳尔氏菌的hrp基因则位于一个大质粒上hrp基因有多种功能，可控制病原细菌的基本致病性（basic pathogenicity），即保证和促进病原菌在植物体内生长、繁殖和获取营养，参与激发非寄主植物HR反应，可编码非专化性激发子harpin（2）过敏素（超敏蛋白）植物病
48、原细菌的hrp基因可编码HR反应的激发子，即过敏素（harpin），也称为超敏蛋白最早分离的过敏素是仁果火疫欧氏杆菌hrpN基因编码的harpinEa。harpinEa是403个氨基酸，分子质量44ku的水溶性酸性蛋白，富含甘氨酸而缺乏半胱氨酸，无酶活性，无四级结构。热稳定，100处理10 min后不失活，对蛋白酶K和紫外线敏感最初将过敏素定义为HR反应非专化性激发子，但后来发现过敏素可激活多种抗病信号传递途径，激发子活性与寄主范围无明显相关。过敏素还能激活与植物生长或抗逆性相关的信号途径2. 细菌的dsp基因 dsp基因决定植物病原细菌在寄主植物上的致病性，但不能激发非寄主植物产生HR 基因
49、失活，导致病原细菌丧失或减弱致病能力，但并不影响其激发非寄主植物产生HR的能力 若dsp基因的产物已知，可将其改称为具体的生化致病因子，如果胶水解酶类、毒素类、胞外水解酶类和激素类物质等，这些都是决定植物细菌病害典型症状的致病因子8.3.3 病原细菌的III型蛋白质泌出系统及其效应蛋白 植物病原细菌定殖于植物细胞外空间，所产生的效应蛋白质需输入植物细胞内部方能发挥作用。 革兰氏阴性的植物病原细菌利用III型蛋白质泌出系统（Type III protein secretion system，TTSS），主动将细菌的效应蛋白质输入寄主细胞，干扰或调节细胞正常生理过程，使之有利于病原细菌的侵染和发病
50、1. III型蛋白质泌出系统III型泌出系统由hrp基因和hrc基因（HR and conserved gene）编码，也称为Hrp泌出系统。III型泌出系统输送效应子进入寄主细胞中，从而导致寄主产生抗病性或感病性Hrc蛋白质可输送效应子，使之穿过细菌细胞壁。在植物病原细菌的hrp基因簇中已鉴定出9个hrc基因，组成III型蛋白泌出系统。这9个基因高度保守，具有将Avr蛋白转运穿过植物细胞壁和细胞膜的能力植物病原细菌III型蛋白泌出系统在细菌细胞膜上形成一种膜转位器和胞外hrp纤丝将目的蛋白输入寄主植物细胞，还需要过敏素和移动因子参与。过敏素由hrp纤丝泌出，沿纤丝积累，可协助纤丝穿过植物细胞
