1、第六章第六章 电泳技术电泳技术1PPT课件前前 言言18091809年俄国物理学家年俄国物理学家首次首次发现电泳现象发现电泳现象。瑞典瑞典UppsalaUppsala大学物理化学系大学物理化学系SvedbergSvedberg教授教授提出提出了荷电了荷电的胶体颗粒在电场中移动的现象称其为的胶体颗粒在电场中移动的现象称其为电泳电泳（electrophoresiselectrophoresis）。）。19371937年瑞典年瑞典UppsalaUppsala大学的大学的TiseliusTiselius创造了创造了TiseliusTiselius电电泳仪泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首，
2、建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的。球蛋白组成的。19481948年年WielandWieland和和FischerFischer重新发展了以滤纸作为重新发展了以滤纸作为支持支持介质介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。2PPT课件5050年代起，出现了利用各种固体物质（如各种滤年代起，出现了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。作为支持介质的区带电泳方法。19591959年年Raymo
3、ndRaymond和和WeintraubWeintraub利用人工合成的凝胶利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，8080年代发展起来的新的毛细管电泳技术。年代发展起来的新的毛细管电泳技术。3PPT课件第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 生物大分子物质如蛋白质和核酸，常以胶体颗粒生物大分子物质如蛋白质和核酸，常以胶体颗粒的形式分散在溶液中，并带有一定的正电荷或负电荷，的形式分散在溶液中，并带有一定的正电荷或负电荷，他们的净电荷取决于介质的他们的净电荷取决于介质的pHpH值。在电场中，带电颗粒值。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极移
4、动，移动的速度和分子的形状大小、分向阴极或阳极移动，移动的速度和分子的形状大小、分子所带的电荷及分子的生物学性质有关，依据此性质可子所带的电荷及分子的生物学性质有关，依据此性质可以将不同两性分子分离。以将不同两性分子分离。4PPT课件溶液酸碱度影响蛋白质带电的性能。溶液酸碱度影响蛋白质带电的性能。5PPT课件u迁移率迁移率(mobility)(mobility)的定义：的定义：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度. .cmcm2 2/Vs/Vs VtdllVtdEvm6PPT课件u颗粒在溶液中迁移的驱动力颗粒在溶液中迁移的驱动力： 颗粒的颗粒的有效电荷有效电荷和
5、和电位梯度电位梯度。他们与介质。他们与介质的的摩擦力摩擦力抗衡，在自由溶液中，这种抗衡服抗衡，在自由溶液中，这种抗衡服从从斯托克斯定律斯托克斯定律 F=6rvF=6rvF F摩擦力摩擦力 r r 颗粒的半径颗粒的半径v v移动的速度移动的速度 介质的黏度介质的黏度7PPT课件u 影响电泳速度的因素影响电泳速度的因素颗粒性质颗粒性质: :直径、形状、静电荷。直径、形状、静电荷。电场强度电场强度: :电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：压：2-10V/cm2-10V/cm溶液性质溶液性质: :电极溶液和蛋白质样品溶液电极溶液和蛋白质样品溶液pHpH、离子
6、强度、离子强度、溶液黏度。溶液黏度。 离子强度离子强度: 0.02-0.2,: 0.02-0.2,若离子强度过高，会降低颗若离子强度过高，会降低颗粒的迁移率。原因：带电粒子吸引周围的离子形成扩粒的迁移率。原因：带电粒子吸引周围的离子形成扩散层，导致颗粒增大阻力增大，迁移率降低。离子强散层，导致颗粒增大阻力增大，迁移率降低。离子强度过低，缓冲能力差，溶液度过低，缓冲能力差，溶液PHPH值变化影响迁移率。值变化影响迁移率。8PPT课件电渗电渗: :在电场作用下，在电场作用下，颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。迁移率。反之亦然。焦耳
7、热焦耳热: :电位梯度一定时，电流强度与电导率成正电位梯度一定时，电流强度与电导率成正比。比。 在电泳过程中，电流越大，放出热量也越多。在电泳过程中，电流越大，放出热量也越多。这会引起区带扩散，影响分辨率。溶液中这会引起区带扩散，影响分辨率。溶液中离子强离子强度越高，电流强度越高度越高，电流强度越高，产热越多，影响分辨率。，产热越多，影响分辨率。筛孔筛孔: :筛孔越大的介质，颗粒泳动速度越快。筛孔越大的介质，颗粒泳动速度越快。IE 9PPT课件第二节第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）是以聚丙烯酰是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的区
8、带电泳，是目前最常用的电胺凝胶为支持物的区带电泳，是目前最常用的电泳方法。泳方法。 10PPT课件2.1 2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点 设备简单设备简单样品量小（样品量小（1-1001-100微克）微克）时间短（时间短（30-6030-60分钟）分钟）操作方便操作方便分离范围广（多肽，蛋白，多糖等）分离范围广（多肽，蛋白，多糖等）可提高灵敏度改为超微量测定（可提高灵敏度改为超微量测定（1010-12 -12 - -1010-9-9）可用于蛋白质分子量可用于蛋白质分子量11PPT课件2.2 2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 以孔径大小不同的聚丙烯酰
9、胺凝胶为支持物，采以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、分、PHPH、电位梯度均不连续），使样品在不连续的两电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.10.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。 12PPT课件2.2.12.2.1不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种物理效应三种物理效应 样品的浓缩效应样品的浓缩效应凝胶的分子筛效应凝胶的分子筛效应
10、电荷效应电荷效应 这三种效应的结果使得样品中各组分达到良这三种效应的结果使得样品中各组分达到良好分离，例如：人血清纸电泳好分离，例如：人血清纸电泳5 5- -8 8个条带，个条带，PAGEPAGE电电泳泳2020- -3030个条带。个条带。13PPT课件A.A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 （1 1）凝胶层的不连续性）凝胶层的不连续性 电泳凝胶有两部分组成：浓缩胶和分离胶。电泳凝胶有两部分组成：浓缩胶和分离胶。 蛋白质在大孔凝胶（浓缩胶）中受到的阻力小，蛋白质在大孔凝胶（浓缩胶）中受到的阻力小，移动速度快。到分离胶的界面时，由于分离胶的孔移动速度快。到分离胶的界面时，由于分离胶的孔径小阻力大
11、，速度就减慢了。由于其不连续性，在径小阻力大，速度就减慢了。由于其不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处样品得到浓缩，区带变窄。大孔与小孔凝胶的界面处样品得到浓缩，区带变窄。14PPT课件（2 2）缓冲液离子成分的不连续性）缓冲液离子成分的不连续性 电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方向移动，若迁移率不同，两种离子能形成界面，向移动，若迁移率不同，两种离子能形成界面，则走在前面的离子称快离子（先行离子），走在则走在前面的离子称快离子（先行离子），走在后面的离子称为慢离子（随后离子）。后面的离子称为慢离子（随后离子）。 通常氯离子为快离子，甘氨酸根离子为慢
12、离子，通常氯离子为快离子，甘氨酸根离子为慢离子，TRISTRIS为缓冲配对离子。为缓冲配对离子。 快离子慢离子和蛋白质样品的有效迁移率次序快离子慢离子和蛋白质样品的有效迁移率次序为：为： ClCl- - Pr Pr- - Gly Gly- - 。15PPT课件（3 3）电位梯度的不连续性）电位梯度的不连续性 电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积。电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积。 电导与电位梯度成反比。电导与电位梯度成反比。（4 4）pHpH的不连续性的不连续性 浓缩胶与分离胶之间有浓缩胶与分离胶之间有PHPH的不连续性，从而控的不连续性，从而控制慢离子的解离度，在浓缩胶中慢离子解离度低，制慢
13、离子的解离度，在浓缩胶中慢离子解离度低，在分离胶中解离度高。在分离胶中解离度高。 16PPT课件17PPT课件 B B分子筛效应分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分布的分离胶时，受阻滞的程度不同，一定孔径分布的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，成为分子筛效应。因此表现出不同的迁移率，成为分子筛效应。 小分子走在前，大分子走在后。小分子走在前，大分子走在后。 C C电荷效应电荷效应 电荷越多，泳动速度越快。电荷越多，泳动速度越快。18PPT课件2.32.3 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备2.3.
14、2.3.、性能、性能: :稳定、机械强度好、纯度高稳定、机械强度好、纯度高2.3.2.3.、制备原理：、制备原理：2.3.2.3. .制备原料：制备原料： 丙烯酰氨（丙烯酰氨（AcrAcr) )，亚甲基双聚丙烯酰胺，亚甲基双聚丙烯酰胺( (BisBis) )CH2=CHCONH2 + CH2=CHC CH2=CHC CH2CHCH2CHxCH2 CH2CHCH2CHxCH2CONH2 C=O CH2 NH NH O O CONH2C=ONH19PPT课件2.3.2.2 2.3.2.2 聚合方式聚合方式化学聚合化学聚合 光聚合光聚合: :20PPT课件21PPT课件22PPT课件3 3凝胶浓度和
15、交联度与孔径的关系凝胶浓度和交联度与孔径的关系 凝胶浓度（凝胶浓度（T T）：）：丙烯酰胺丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的总百分浓度。和亚甲基双丙烯酰胺的总百分浓度。交联交联度（度（C C）：）：亚甲基双丙烯酰胺（亚甲基双丙烯酰胺（b),b),丙烯酰胺丙烯酰胺(a)(a)。(%)100mbaT(%)100babC23PPT课件有效孔径取决于凝胶总浓度有效孔径取决于凝胶总浓度T%T%，有效孔径随有效孔径随T%T%的增的增加而减小。加而减小。有效孔径决定蛋白质的分离有效孔径决定蛋白质的分离24PPT课件有效孔径与交联度有效孔径与交联度( (C%)C%)有关。随交联度的增加而有关。随交联度的增加而减小。
16、减小。分离不同分子量样品所应选择的凝胶浓度分离不同分子量样品所应选择的凝胶浓度25PPT课件26PPT课件三、电泳后的检测三、电泳后的检测氨基黑氨基黑1010B B法：法：是一种酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是一种酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。氨基黑染料染氨基黑染料染SDS-SDS-蛋白质效不好。染不同蛋白时，色蛋白质效不好。染不同蛋白时，色度不等，色调不一（蓝、黑、棕），纯度扫描时误差度不等，色调不一（蓝、黑、棕），纯度扫描时误差太大。太大。27PPT课件考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250：灵敏度是氨基黑灵敏度是氨基黑1010B B的的5 5倍，但倍，但不适用于酸溶
17、蛋白、醇溶蛋白。不适用于酸溶蛋白、醇溶蛋白。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250：灵敏度不如灵敏度不如R250R250，但不溶于酸，但不溶于酸性溶液，本低无色。性溶液，本低无色。28PPT课件29PPT课件ANSANS法：法：1-1-苯胺基苯胺基-8-8-萘磺酸，萘磺酸， 本身无荧光，与蛋白结合后产生荧光，电泳后，本身无荧光，与蛋白结合后产生荧光，电泳后，取胶置平皿中，用此染料溶液浸取胶置平皿中，用此染料溶液浸1-31-3分钟，在紫外分钟，在紫外灯下观察，黄色。检测限灯下观察，黄色。检测限100100微克，如果不明显，微克，如果不明显，将胶取出暴露空气中或浸在将胶取出暴露空气中或浸在3 3摩尔
18、盐酸溶液中摩尔盐酸溶液中2 2分分钟，使蛋白表面稍变性，然后染色，检测线提高钟，使蛋白表面稍变性，然后染色，检测线提高到到2020微克。染色后酶和抗体能保持活力。可用来微克。染色后酶和抗体能保持活力。可用来测定酶活或者作抗原注射动物。测定酶活或者作抗原注射动物。30PPT课件银染法：银染法：机制：蛋白质上的各种基团（如琉基、碳基等）机制：蛋白质上的各种基团（如琉基、碳基等）能与银离子结合，然后再将银离子还原成金属银，能与银离子结合，然后再将银离子还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与他们的浓度成线性关系。他们的浓度成线性关系。蛋白质的
19、染色程度与蛋白质上的特殊基团有关，蛋白质的染色程度与蛋白质上的特殊基团有关，碱性和含硫氨基酸的存在对染色有贡献。碱性和含硫氨基酸的存在对染色有贡献。31PPT课件银染应先固定，固定的作用有两个方面：银染应先固定，固定的作用有两个方面：第一是把蛋白质固定在凝胶中阻止扩散。第一是把蛋白质固定在凝胶中阻止扩散。第二为了除去干扰染色的物质，如去污剂、第二为了除去干扰染色的物质，如去污剂、还原试剂和缓冲液中的成分（甘氨酸）。还原试剂和缓冲液中的成分（甘氨酸）。固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯醋酸。醋酸。染色分为双胺银染和非双胺银染。染色分为双胺银染和非双胺银染。3
20、2PPT课件双胺银染过程：双胺银染过程：1 1 胶在胶在50%50%甲醇中浸泡至少甲醇中浸泡至少1 1小时小时2 2 配制溶液配制溶液A A ：0.80.8克硝酸银到克硝酸银到4 4毫升无离子水。毫升无离子水。B B：2121毫升毫升0.36% 0.36% 氢氧化钠和氢氧化钠和1.41.4毫升毫升14.814.8摩尔的氢氧化胺摩尔的氢氧化胺3 3 染色：将染色：将A A滴到滴到B B中，用无离子水加至中，用无离子水加至100100毫升，此溶毫升，此溶液临用前配制，染色液临用前配制，染色1515分钟分钟4 4 洗涤：无离子水漂洗洗涤：无离子水漂洗5 5分钟分钟5 5 显色液：显色液：2.52.5
21、毫升毫升1%1%柠檬酸与柠檬酸与0.250.25毫升毫升37%37%甲醛混合，甲醛混合，加无离子水至加无离子水至500500毫升。显色约毫升。显色约1010分钟，蛋白带出现。分钟，蛋白带出现。6 6 无离子水漂洗后用无离子水漂洗后用50%50%甲醇终止显色。甲醇终止显色。33PPT课件34PPT课件四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的装置四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的装置35PPT课件 DYCP-31C型微型琼脂糖电泳槽型微型琼脂糖电泳槽(桥桥 式）式） 36PPT课件第三节第三节 SDS-PAGESDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elect
22、rophoresis )概述：概述： 1967 1967年建立，年建立，19691969年完善。年完善。在样品和聚丙烯酰胺凝胶中加入在样品和聚丙烯酰胺凝胶中加入SDSSDS后，蛋白质后，蛋白质分子的迁移率就取决于它的分子量大小，因此可分子的迁移率就取决于它的分子量大小，因此可用来测定分子量。用来测定分子量。几种电泳方式的比较：管状凝胶电泳，垂直板几种电泳方式的比较：管状凝胶电泳，垂直板凝胶电泳，水平薄层凝胶电泳。凝胶电泳，水平薄层凝胶电泳。37PPT课件38PPT课件3.1 SDS3.1 SDS电泳的原理电泳的原理 SDSSDS的性质：的性质：表面活性剂、带负电。表面活性剂、带负电。蛋白质的形
23、状：蛋白质的形状：球状、线状。球状、线状。SDSSDS与蛋白质结合后的状态：与蛋白质结合后的状态：椭圆棒椭圆棒, ,蛋白质的分子量仅与蛋白质的分子量仅与长度有关。长度有关。 39PPT课件40PPT课件电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系：电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系：LogMW=-bLogMW=-bmR+KmR+K 41PPT课件42PPT课件3.2 3.2 影响蛋白质与影响蛋白质与SDSSDS的结合程度的因素的结合程度的因素 溶液中溶液中SDSSDS单体的浓度单体的浓度 样品缓冲液的离子强度样品缓冲液的离子强度 二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原43PPT课件3.3 SDS3.3
24、 SDS聚丙烯酰氨凝胶的组成与聚合聚丙烯酰氨凝胶的组成与聚合 凝胶分为均匀胶和梯度胶两种凝胶分为均匀胶和梯度胶两种. .梯度胶可提高蛋白质分子量的分离范围：梯度胶可提高蛋白质分子量的分离范围：10%-15%10%-15%适合于适合于1-251-25万万MWMW配胶时应注意：配胶时应注意：1 1丙烯酰胺的质量丙烯酰胺的质量2 2尽量减少尽量减少APAP，TEMEDTEMED的量的量. .3 3 控制聚合时间（控制聚合时间（40-6040-60分钟）温度分钟）温度30-5030-50度度 4 4 室温放置室温放置1212小时小时44PPT课件3.4 3.4 样品的制备样品的制备 样品缓冲液的组成样
25、品缓冲液的组成：甘油，溴酚蓝，还原剂：甘油，溴酚蓝，还原剂（DTTDTT），SDSSDS，TRIS-HCLTRIS-HCL样品处理：加热变性样品处理：加热变性特殊样品的处理：特殊样品的处理： 上样浓度：上样浓度： 考马斯亮蓝染色：考马斯亮蓝染色：2020- -3030纳克纳克/ /微升微升 银染：银染： 0.3 0.3- -0.50.5纳克纳克/ /微升微升45PPT课件3.5 3.5 分子量测定分子量测定 标准蛋白标准蛋白: : 蛋白标准的结构与行为尽可能与待测样品接近，蛋白标准的结构与行为尽可能与待测样品接近，分子量范围略高和低于未知蛋白。用相同的条件分子量范围略高和低于未知蛋白。用相同的
26、条件和方法制备样品和标准品，然后在分离和混合状和方法制备样品和标准品，然后在分离和混合状态下一起电泳（在同一张电泳板上）。态下一起电泳（在同一张电泳板上）。分子量测定：分子量测定： 相对迁移率相对迁移率= =蛋白迁移的距离蛋白迁移的距离/ /溴酚蓝迁移的距离。溴酚蓝迁移的距离。 LogMW=-bLogMW=-bmR+KmR+K 46PPT课件3.6 SDS3.6 SDS电泳测定分子量的局限性电泳测定分子量的局限性 测得分子量为亚基的分子量测得分子量为亚基的分子量. .不适合于电荷异常或结构异常蛋白不适合于电荷异常或结构异常蛋白. .47PPT课件3.7 3.7 应用实例应用实例中国药典2015
27、版收载药品本实验室样品的电泳48PPT课件49PPT课件中国药典中国药典20152015版通则版通则0541054150PPT课件51PPT课件52PPT课件 53PPT课件3.8 3.8 低分子量多肽的低分子量多肽的SDSSDS电泳电泳常规常规PAGEPAGE电泳不适合分离电泳不适合分离15KD15KD以下多肽原因如下：以下多肽原因如下： 1.SDS- 1.SDS-多肽胶束大致是球形，长度和直径在同一多肽胶束大致是球形，长度和直径在同一个数量级。个数量级。 2.2.较高的内部电荷不能被覆盖。较高的内部电荷不能被覆盖。改变以下条件可以测定小分子的多肽：改变以下条件可以测定小分子的多肽：增加胶联
28、度：增加胶联度：swank,11swank,11个多肽，个多肽， 18%18%的误差。的误差。加入尿素：加入尿素：williams,williams,观察到分子量小于观察到分子量小于60006000的多的多肽在普通电泳中的相对迁移率是一样的。只有在肽在普通电泳中的相对迁移率是一样的。只有在胶联度胶联度10%10%，且加入，且加入8 8摩尔尿素时才能得到好结果。摩尔尿素时才能得到好结果。增加缓冲液的浓度，慢离子改为增加缓冲液的浓度，慢离子改为TRICINETRICINE：可使电：可使电泳的适用范围：泳的适用范围：1-100KD1-100KD54PPT课件思考题思考题: : 比较以下几种分子量测定
29、方法的优缺点：高效凝比较以下几种分子量测定方法的优缺点：高效凝胶过滤，胶过滤，SDSSDS还原电泳，还原电泳，SDSSDS非还原电泳，非还原电泳，ESI-MS,ESI-MS,渗透压、超离心渗透压、超离心. .55PPT课件第四节第四节 等电聚焦技术等电聚焦技术 4.1 4.1 Isoelectric focusing(IEF):Isoelectric focusing(IEF): 利用蛋白质分子或其它两性分子的利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同等电点不同，在一个稳，在一个稳定的、连续的、线性的定的、连续的、线性的pHpH梯度梯度中进行分离分析的一项技术。中进行分离分析的一项技术。 196
30、6 1966年瑞典科学家年瑞典科学家RilbeRilbe和他的学生和他的学生VersterbergVersterberg建立建立. . 是目前分辨率较高的一种电泳技术是目前分辨率较高的一种电泳技术(0.001pH)(0.001pH) 适用样品为：蛋白质和其他两性分子适用样品为：蛋白质和其他两性分子 56PPT课件 4.2 4.2 等电聚焦电泳的分类等电聚焦电泳的分类 A. A.根据形成根据形成pHpH梯度的原理不同分类：梯度的原理不同分类： 人工人工pHpH梯度梯度, ,载体两性电解质载体两性电解质pHpH梯度，固相梯度，固相pHpH梯度梯度 B.B.根据支持介质分类根据支持介质分类: : 聚
31、丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶。聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶。 C.C.根据电泳方式分类：根据电泳方式分类： 垂直管式，毛细管式，水平板式，超薄水平板式。垂直管式，毛细管式，水平板式，超薄水平板式。57PPT课件4.3 4.3 常规常规PAGEPAGE与与IEFIEF的区别（原理）的区别（原理） 58PPT课件4.4 4.4 等电聚焦的聚焦效应等电聚焦的聚焦效应59PPT课件4.5 4.5 载体载体两性电解质两性电解质pHpH梯度等电聚焦梯度等电聚焦定义定义: : 载体两性电解质是指一系列脂肪族载体两性电解质是指一系列脂肪族多氨基多羧多氨基多羧基基的混合物。的混合物。60PPT
32、课件pIpI的分布在的分布在2.5-11.02.5-11.0之间之间, ,比较精密的等电比较精密的等电点分布在点分布在3-43-4之间。之间。61PPT课件载体两性电解质的特性载体两性电解质的特性：分子量小：分子量小：AmpholineAmpholine的分子量约为的分子量约为700700，很少一部，很少一部分分10001000可溶性好可溶性好缓冲能力强缓冲能力强导电性均匀导电性均匀紫外吸收低紫外吸收低容易从聚焦的蛋白中除去容易从聚焦的蛋白中除去无毒、无生物学效应无毒、无生物学效应 62PPT课件pHpH梯度形成过程梯度形成过程63PPT课件制备方法：制备方法： 配制丙烯酰胺溶液，把载体两性电
33、解质配制丙烯酰胺溶液，把载体两性电解质溶液加入其中，不加缓冲溶液溶液加入其中，不加缓冲溶液。64PPT课件4.6 4.6 固相固相pHpH梯度梯度： 具有弱酸和弱碱性质的具有弱酸和弱碱性质的丙烯酰胺衍生物丙烯酰胺衍生物滴定滴定时，在滴定终点附近形成时，在滴定终点附近形成pHpH梯度并梯度并参与参与丙烯酰胺丙烯酰胺的的共价聚合共价聚合，从而形成固定的不随环境条件变化，从而形成固定的不随环境条件变化的的pHpH梯度。梯度。 制备方法制备方法： 梯度混合仪梯度混合仪65PPT课件CH2=CH-CO-NH-R66PPT课件4.7 4.7 载体载体两性电解质两性电解质pHpH梯度与梯度与固相固相pHpH
34、梯度的区别梯度的区别前者是两性电解质，后者是弱酸和弱碱。前者是两性电解质，后者是弱酸和弱碱。前者制备简单，后者复杂。前者制备简单，后者复杂。后者分辨率高于前者。后者分辨率高于前者。67PPT课件+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 1068PPT课件4.8 4.8 测定蛋白质等电点的方法有三种：测定蛋白质等电点的方法有三种：标准蛋白法标准蛋白法微电极法微电极法切胶法切胶法三种方法的比较：三种方法的比较：69PPT课件 目的要求目的要求 掌握电泳迁移率的概念掌握电泳迁移率的概念了解纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳的原理和方法了解纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳的原理和方法掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、方法和在生化掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、方法和在生化药分中的应用药分中的应用掌握等电聚焦的原理、种类及各自的特点掌握等电聚焦的原理、种类及各自的特点掌握双向电泳的概念及应用掌握双向电泳的概念及应用掌握毛细管电泳的原理和在生化分析中的应用掌握毛细管电泳的原理和在生化分析中的应用70PPT课件思考题：思考题： 试述以下三种电泳技术的原理试述以下三种电泳技术的原理: : PAGE,SDS-PAGE,IEFPAGE,SDS-PAGE,IEF。71PPT课件
