1、一 培养基的制备步骤：步骤：1 称量药品称量药品 2 溶解溶解3 调节调节PH5 过滤分装过滤分装6 包扎标记包扎标记7 灭菌灭菌二二 消毒灭菌法消毒灭菌法物理灭菌法：物理灭菌法： 干热灭菌法：干热灭菌法：150-170 150-170 维持维持 1-2 1-2h h； 高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法121121（101.53kPa）15-3015-30minmin； 其他：过滤除菌法、紫外线灭菌法。其他：过滤除菌法、紫外线灭菌法。化学灭菌法：化学灭菌法：主要使用一些化学消毒剂进行，主要使用一些化学消毒剂进行，如：如：7575酒精、酒精、1 1的新洁尔灭等。的新洁尔灭等。 三三 细菌的分离、接种
2、与培养细菌的分离、接种与培养细菌的分离方法：细菌的分离方法： 稀释法、平板分区划线法。稀释法、平板分区划线法。细菌的接种方法细菌的接种方法： 斜面培养基接种法、液体培养基接种法、穿刺斜面培养基接种法、液体培养基接种法、穿刺接种法、倾注平板法、平板涂布法。接种法、倾注平板法、平板涂布法。细菌的培养方法：细菌的培养方法： 需氧培养法需氧培养法 CO2培养法培养法 厌氧培养法厌氧培养法3.1 细菌的分离培养方法l连续稀释法连续稀释法l平板分区划线平板分区划线 分区划线分离法分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本此法常用于含菌量较多的标本如混合细菌的分离。如混合细菌的分离。 连续划线分离法连续划线
3、分离法：此法常用于含菌量不多的标本：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养或培养物中的细菌分离培养 1区2区3区4区1234平板分区划线法（学生操作）平板分区划线法（学生操作）注意事项划完前一区后，需重新灼烧接种环后再进划完前一区后，需重新灼烧接种环后再进行下一区的划线。行下一区的划线。相邻两区要有重叠区域。相邻两区要有重叠区域。结果观察：观察各区的生长情况，并看是结果观察：观察各区的生长情况，并看是否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、大小、边缘、透明度都需记录。大小、边缘、透明度都需记录。l平皿送平皿送37温箱培养温箱培养24小时小时l结果结果
4、(要求要求)l两种单个菌两种单个菌落落l分四区分四区l无杂菌无杂菌l琼脂不破琼脂不破3.2 细菌的接种斜面接种法斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、该法主要用于单个菌落的纯培养、 保存菌种或观察细菌的某些特性。保存菌种或观察细菌的某些特性。 液体接种法液体接种法 多用于一些液体生化试验管或发酵的多用于一些液体生化试验管或发酵的接种。接种。穿刺接种法穿刺接种法 此法主要用于半固体培养基、明胶此法主要用于半固体培养基、明胶 及双糖管的接种。及双糖管的接种。(1) 斜面琼脂培养基接斜面琼脂培养基接种法（种法（2人一组）人一组） 大肠埃希菌大肠埃希菌/枯草芽枯草芽孢杆菌孢杆菌/葡萄球菌葡萄球菌送
5、培养送培养24小时小时(2支支/组组)一组一组 37温箱温箱一组一组 60温箱温箱一组一组 4 冰箱冰箱用接种环挑菌后在用接种环挑菌后在斜面表面划折线斜面表面划折线(2) 液体培养基接种法（液体培养基接种法（2人一组）人一组）1. 菌种菌种 (任选一种）任选一种）l 大肠埃希菌大肠埃希菌/枯草芽枯草芽孢杆菌孢杆菌/葡萄球菌葡萄球菌2. 接种接种l 每一菌种分别接种每一菌种分别接种pH5.0 / 7.2 / 9.0的营的营养肉汤各一支养肉汤各一支3. 送送37温箱培养温箱培养24小小时时液体培养基液体培养基(3) 琼脂半固体接种法琼脂半固体接种法 （1人一份）人一份）1. 菌种菌种大肠埃希菌大肠
6、埃希菌/枯草芽孢枯草芽孢杆菌杆菌/葡萄球菌葡萄球菌2. 接种接种用接种针穿刺接种用接种针穿刺接种3. 送送37温箱温箱 培养培养24小时小时3.半固体培养法观察细菌是否有动力半固体培养法观察细菌是否有动力1、3：有动力：有动力： 呈云雾状呈云雾状2：无动力：无动力： 沿穿刺线生长，沿穿刺线生长，并变粗并变粗四、细菌的生化反应1 1 糖发酵试验糖发酵试验( (Fermentation of sugars) Fermentation of sugars) 2 IMViC 2 IMViC 试验试验靛基质产生试验（吲哚试验）甲基红试验V-P试验枸橼酸盐利用试验3 3 硫化氢产生试验硫化氢产生试验4 4
7、 尿素分解试验尿素分解试验 糖发酵试验糖发酵试验 不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。例如大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖；而痢疾杆菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽相同，如大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2，故产酸并产气；而痢疾杆菌缺乏该酶，发酵葡萄糖仅产酸不产气。吲哚（靛基质）试验吲哚（靛基质）试验( (Production of indole)Production of indole) 有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而产生靛基质，靛基质无色，不能直接查见，此时滴加数滴吲哚试剂于培养基的液面上，上层呈玫瑰
8、红色者为阳性，仍呈黄色者为阴性。 甲基红（甲基红（methyl red）试验试验 将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37培养48h后，再向其中加入甲基红试剂3滴。 大肠杆菌等细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，但丙酮酸不被缩合成乙酰甲基甲醇，而转化成甲酸、乙酸等酸性物质，培养基中酸多，pH值低，故呈红色，为阳性。 而产气杆菌将丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇，培养基中酸少，pH值高，故呈黄色，为阴性。 VP VP（Voges-ProskauerVoges-Proskauer）试验试验 大肠杆菌和产气大肠杆菌均能发酵葡萄糖，产酸产气，两者不能区别。但产气杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被氧化
9、生成二乙酰，二乙酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是为VP试验阳性。大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性，枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验(Utilization of citrate) 将细菌接种于枸橼酸盐培养基上，37培养48h。产气杆菌等细菌能利用枸橼酸盐作为碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使培养基变为碱性，培养基中的指示剂（溴麝香草酚蓝）由淡绿色转为深蓝色，为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌则不能分解枸橼酸盐，培养基颜色不变，为阴性。 硫化氢产生试验硫化氢产生试验( (Production of HProduction of H2 2S)S) 将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，37
10、培养24h后观察结果。有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，穿刺部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色无变化，则为阴性。尿素分解试验尿素分解试验( (Splitting of urea)Splitting of urea) 将细菌接种于尿素培养基中，37培养1824h。变形杆菌能迅速(24h)分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色，是为阳性反应。 实验后处理l将接种针和接种环放入原位，摆放整齐！l将所有的原菌种管原菌种管放入自己组的红框试管架红框试管架中中！l将自己接种的培养物接种的培养物集中在试管架中统一放入培养箱中37度培养！l关照明和电扇开关，请勿关实验室总电关照明和电扇开关，请勿关实验室总电源！源！
