1、 免免 疫疫 佐佐 剂剂2011级 生物制品 刘应祥一 佐剂的发现及其概念 与抗原同时或预先应用，能够增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的制剂1926年，Glenny 等发现明矾沉淀白喉毒素能产生一种微粒，极大地增强机体对抗原的特异性免疫应答，从而拉开了佐剂使用的序幕。1 为什么要使用佐剂？ 可溶性纯化蛋白质疫苗或蛋白质亚单位疫苗的免疫激活作用通常较弱，不足以刺激机体产生足够的抗体，因此通常在疫苗制剂中加入佐剂与单独应用抗原相比，抗原与佐剂联合应用所需的抗原量较少，机体产生的抗体量较多，并且还可以减轻免疫耐受二 佐剂的作用机理 1 改变抗原物理性状，延缓抗原降解和排除，延长体内
2、存留的时间，从而更有效的刺激免疫系统。 2 刺激单核巨噬细胞增强其对抗原的处理和递呈能力。 3 刺激淋巴细胞增生和分化，从而增强和扩大免疫应答的效应。4 改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应。安全，且无短期及长期的毒副作用。安全，且无短期及长期的毒副作用。佐剂的化学成分和生物学形状清楚，制备批间差异小且易于生产。佐剂的化学成分和生物学形状清楚，制备批间差异小且易于生产。与单独使用抗原相比，佐剂与抗原联用能刺激机体产生较强的免疫反与单独使用抗原相比，佐剂与抗原联用能刺激机体产生较强的免疫反应。应。用较少的免疫剂量即可产生效力。用较少的免疫剂量即可产生效力。保证液体剂型疫苗在较低的浓度下即可刺
3、激机体产生较强的免疫应答。保证液体剂型疫苗在较低的浓度下即可刺激机体产生较强的免疫应答。进入体内的佐剂可自行降解且易于从体内清除。进入体内的佐剂可自行降解且易于从体内清除。价格低廉。价格低廉。三 理想佐剂的必备条件四 佐剂的分类 颗粒性佐剂 如氢氧化铝佐剂 非颗粒性佐剂 如细胞因子 本身具有免疫原性 如如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等 本身不具有免疫原性 如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等 来源于植物的佐剂，如皂甙和多糖类提取物等 来源于病原微生物的佐剂单磷脂、霍乱毒素以及CpG寡聚脱氧核苷酸等五 常用佐剂 铝盐佐剂是一类含Al离子的无机盐佐剂，主要有氢氧化铝
4、胶和明矾。氢氧化铝胶，又称为铝胶，由于其生产成本低廉，使用方便，毒性极低。铝盐佐剂是第一个被批准可用于人的佐剂。1 铝盐佐剂铝盐佐剂1-1 作用原理 铝盐佐剂是将佐剂与抗原混合,形成凝胶状态,注入动物体内后形成“贮存库”,这些不溶性颗粒能吸附、分散抗原物质,增加抗原表面积,在组织中形成一个富含巨噬细胞的肉芽肿,延缓吸收。肉芽肿中的抗原缓慢地渗透到组织中,这样就延长了抗原的刺激时间,使在正常情况下只能存留数日的抗原保持达数周之久。1-2 铝盐佐剂的种类铝化合物沉淀疫苗铝化合物沉淀疫苗 铝化合物吸附疫苗铝化合物吸附疫苗1-3铝盐佐剂存在的缺点3 铝化合物的佐剂作用在超过一定剂量以后逐渐下降，其原因
5、可能是铝化合物在一定程度上对巨噬细胞有毒害作用4 以铝化合物为佐剂的疫苗不能采用低温冻干技术生产，也不能冷冻保存，这两点限制了以铝化合物为佐剂的疫苗的保质期。1 主要刺激 Th2 相关抗体的产生，不能刺激 Th1 的细胞活性,也不加强 CD8+细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）的活性,即只能增强体液免疫，不能增强细胞免疫。2 会诱导产生 IgE 抗体，增加发生超敏反应的危险弗氏佐剂( FA) 分为 弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂(FCA)FCA) 弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂( FIA)( FIA)2 油性佐剂 弗氏不完全佐剂是由低引力和低粘度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂。 弗氏完全佐剂是在不
6、完全佐剂的基础上加一定量的分枝杆菌分枝杆菌而成。组成组成2-1 作用特点对体液和细胞免疫系统具有很强的激活作用。 FCA 只用于初始免疫,在以后的加强免疫中只用 FIA。佐剂与抗原的体积一般各占 50 %。 最终所形成的抗原佐剂混合物是典型的“油包水”乳胶混合体。FCA 能够刺激机体产生很强的体液免疫和细胞免疫应答。铝盐佐剂和油包水乳剂是典型的短期贮存库,这种类型的抗原包裹于注射部位,因此不会由于肝脏的清除作用而丢失。2-2 副作用皮下注射时，可在注射部位引起强烈的炎症和溃疡2-3其他油性佐剂 佐剂佐剂-65 -65 在体内可被代谢或分泌,用于人的流感疫苗,证明安全有效. 白油白油SpanSp
7、an佐剂佐剂 是用轻质矿物油(白油)作油相,用Span-80或Span-85及Tween-80作为乳化剂制成的油乳佐剂,是当前兽用生物品中最常用最有效的佐剂之一。3 微生物佐剂短小棒状杆菌短小棒状杆菌(CP)(CP)由CP经加热或甲醛灭活制成,为非特异性免疫增强剂,对机体毒性低,没有明显的副作用。卡介苗卡介苗(BCG)(BCG)最常用的微生物佐剂之一原是用来预防结核病的疫苗,在预防儿童结核病方面功效显著。胞壁酰二酞胞壁酰二酞(MDP)(MDP)及其衍生物及其衍生物MDP的成分是N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺,有很强的佐剂活性。被认为是最有发展前途的佐剂之一。细菌脂多糖细菌脂多糖(L
8、PS)(LPS)LPS可起到多克隆B细胞有丝分裂原的作用,也可促进巨噬细胞分泌单核因子。LPS由于具有毒性,所以不能直接成为人用疫苗的佐剂单磷酰脂质单磷酰脂质A(MLA)A(MLA)MLA是一种毒性较低的具有佐剂活性的脂多糖衍生物。霍乱毒素霍乱毒素(CT)(CT)霍乱毒素是由霍乱弧菌分泌的分子量为84KD的一种不耐热肠毒素,增强弱免疫原的免疫原性。4 表面活性剂类佐剂 1 组成组成 抗原物质与由皂树皮提取的一种糖苷Quil A及胆固醇按 1：1：1 混合后自发形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡。每个小泡直径40 nm，约含1012个分子的蛋白质 2 作用方式作用方式 ISCOM 能够与抗原的
9、疏水部分结合，从而将其亲水部位暴露于免疫细胞，将抗原有效地递呈给抗原提呈细胞，由于抗原递呈细胞的内体小泡和胞质溶胶的双重作用，含 ISCOM 的疫苗可以通过 MHC-和 MHC-两种途径将抗原递呈给免疫系统，同时激活CD4+T细胞和CD8+T细胞4-1免疫刺激复合物（免疫刺激复合物（ISCOM） ISCOM 可以显著提高 T 细胞的增殖、分化，并诱导多种亚型 IgG 及特异性抗体的生，引起动物对多种抗原产生高滴度的抗体应答。 具有佐剂和抗原递呈的双重功能。应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗，具有产生“ 全面” 免疫应答的效力， 可长期增强特异性抗体应答。 ISCOM能有效地通过粘膜给药，从而
10、可以用于抗呼吸道感染。3 作用特点 它并不是一种可以和任何抗原都能形成复合体的佐剂，只有那些含有很多疏水基团的抗原或免疫原才能与 ISCOM 形成复合体，含亲水基团多的抗原不适合与 ISCOM 佐剂混合制备疫苗。4 存在的不足4-2 脂质体 1 1 结构结构 ：类似生物膜，一般由磷脂和胆固醇形成的双分子层包被目标物形成的超微球状制剂。 2 2 特点：特点： 脂质体注入体内后能自然聚集到某些组织； 脂质体可以通过接触、吸附、吞噬、融合和脂质交换等方式与细胞相互作用； 脂质体可以增加所携带药物对淋巴系统的指向性和靶组织的滞留性，延缓药物释放，提高疗效； 无毒并且还可以降低药物对正常细胞的毒性5 分
11、子佐剂 5-1 5-1 细胞因子细胞因子 化学组成化学组成 多属小分子多肽或糖蛋白，是由免疫细胞和某多属小分子多肽或糖蛋白，是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质。些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质。 特点特点 对对ThTh细胞的分化起重要作用细胞的分化起重要作用, ,能增强自然杀伤细胞能增强自然杀伤细胞细胞毒性细胞毒性T T淋巴细胞的功能淋巴细胞的功能, ,还有诱导其它细胞因子的产生还有诱导其它细胞因子的产生, ,对机体的免疫应答具有广泛的上调作用。对机体的免疫应答具有广泛的上调作用。 IL-2与外壳蛋白的共表达形式至少使疫苗效率升高100100倍倍5
12、-1-1 细胞因子种类 IL-2IL-2 一种重要的T细胞生长因子 IL-12IL-12 由单核细胞和B细胞产生,具有多种生物活性, 是迄今所知诱导Th1型免疫应答的最主要的细胞因子。 IL-18 IL-18 是最近发现的鼠和人的细胞因子,可诱导Th1细胞和NK细胞高效分泌IFN-,促进T细胞增生,与IL-12产生协同作用等。 IL-15 IL-15 主要由单核巨噬细胞产生,在哺乳动物一个主要的功能为调节NK细胞的发育与增殖,通过NK细胞产生IL-15共刺激细胞因子从而调节巨噬细胞和NK细胞间的相互作用。 IFN-IFN- 是一种有效的免疫佐剂,它能协同IL-2诱导LAK活性、增强抗原呈递5-
13、2 5-2 CpGCpG序列序列( (CpGCpG） CpG序列序列 一类其序列大部分以非甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为基元的寡聚体,由于这种特征性序列可激活多种免疫效应细胞,故又被称作免疫刺激DNA序列 作用特点作用特点 可激活T细胞、B细胞、NK细胞等免疫活性细胞, 产生大量的多种细胞因子, 增强机体的特异性和非特异性免疫效应。 优点优点 CpG引起的免疫反应以Th1型为主,因此可以很好的激发粘膜免疫反应虽然CpG-DNA具有安全、有效等优点。CpG序列作为免疫佐剂有如下特点 与常用的氢氧化铝佐剂具有协同作用 一些不能与铝混合的减毒活疫苗或多价疫苗则可单独使用CpGDNA增
14、强其免疫原性 应用范围广6 化学物质 左旋咪唑左旋咪唑主要作用于T淋巴细胞。此外它还有恢复周围效应细胞的功能,既是免疫扶正剂又是免疫调节剂六 佐剂研究的新趋向 抗原递呈细胞佐剂 通过刺激抗原递呈细胞影响抗原的识别、加工及处理过程,从而增强免疫原性的佐剂。如树突状细胞、脂质体等。 T细胞佐剂 能够选择性增强T细胞介导的免疫应答的物质。通过改变抗原的物理性状、表位外显、空间限构等作用,加强抗原识别、吞噬和递呈, 从而激发机体产生保护作用的细胞免疫应答。 黏膜佐剂 一类供黏膜疫苗使用的佐剂。内毒素和霍乱毒素是目前最为有效的黏膜佐剂。 结合物型佐剂（分子内佐剂）人工合成的多肽绝大多数为小分子,免疫原性较差,与较大分子结合可提高其免疫原性。
