1、药物色谱分析药物色谱分析 中国药科大学药物色谱分析课程 第九章第九章1 1化学键合相色谱化学键合相色谱. *1 1、化学键合相色谱的定义、化学键合相色谱的定义化化学学键键合合相相色色谱谱借助于化学反应的方法将有机分子以借助于化学反应的方法将有机分子以共价键连接在色谱担体上形成化学键共价键连接在色谱担体上形成化学键合相，以化学键合相为固定相的色谱合相，以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱（法称为化学键合相色谱（bonded phase chromatography，BPC），简），简称键合相色谱。称键合相色谱。 . *2 2、化学键合相的特点、化学键合相的特点与液液分配色谱相比，使用过
2、程中固定相与液液分配色谱相比，使用过程中固定相不流失，耐溶剂冲洗。不流失，耐溶剂冲洗。与液固吸附色谱相比，消除了担体上的表与液固吸附色谱相比，消除了担体上的表面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。面活性作用点，清除了某些可能的催化活性。表面改性灵活，容易获得重复性产品。表面改性灵活，容易获得重复性产品。化学性能稳定，耐受范围为化学性能稳定，耐受范围为pH2pH28 8。热稳定性好，一般在热稳定性好，一般在7070以下稳定。以下稳定。载样量大，比硅胶约高一个数量级。载样量大，比硅胶约高一个数量级。梯度洗脱平衡快。梯度洗脱平衡快。. *3 3、化学键合相的稳定性、化学键合相的稳定性1 1在较低在
3、较低pHpH值条件下值条件下（pH2pH9pH9） 键合相中键合相中SiOSiSiOSi键很容易被键很容易被KOHKOH和和NaOHNaOH这一类强碱这一类强碱性亲核试剂所切断：性亲核试剂所切断： SiOSiM+OH-SiOH+SiO-M+. *4 4、化学键合相的分类、化学键合相的分类 化学键合相的分类可以有不同的依据。化学键合相的分类可以有不同的依据。按键合相的表面结构：单分子键合和聚合键合；按键合相的表面结构：单分子键合和聚合键合；按键合有机硅烷的官能团：按键合有机硅烷的官能团：极性键合相极性键合相、非极非极性键和相性键和相和和离子交换键合相离子交换键合相三种。三种。. *二、制备与评价
4、二、制备与评价1 1、化学键合相的制备、化学键合相的制备2 2、常见的官能团、常见的官能团3 3、常用的键合相商品牌号、常用的键合相商品牌号4 4、化学键合相性能评价、化学键合相性能评价. *. *. *(1)(1)硅胶的预处理硅胶的预处理 在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸在制备键合相时，首先作为担体的硅胶需要酸处理，洗去制备、运输和保存过程中引入的污处理，洗去制备、运输和保存过程中引入的污染物；除去表面层的金属氧化物杂质，如染物；除去表面层的金属氧化物杂质，如Na+、Ca2+、Al3+、Fe3+等；使表面的硅氧烷键打开，等；使表面的硅氧烷键打开，形成尽可能多的自由羟基，有利于反应。形
5、成尽可能多的自由羟基，有利于反应。. *(1)(1)硅胶的预处理硅胶的预处理酸处理酸处理酸处理可以用酸处理可以用0.1 mol/L的盐的盐酸，于酸，于90下下浸泡浸泡24 h，或，或以以10%的盐酸的盐酸在回流状态处在回流状态处理理8 h 。中中 和和中和，水洗至中和，水洗至无无Cl- ，经酸处，经酸处理后的硅胶表理后的硅胶表面的羟基浓度面的羟基浓度已达到理论值已达到理论值8 mol/m2左右。左右。 干干 燥燥在在200以下真以下真空烘干除去物空烘干除去物理吸附水，注理吸附水，注意不得超过意不得超过200，否则硅，否则硅醇基脱水形成醇基脱水形成硅氧烷结构。硅氧烷结构。. *（2 2）溶剂与试
6、剂预处理）溶剂与试剂预处理 硅烷化试剂对水很敏感，使用前应以蒸馏方式硅烷化试剂对水很敏感，使用前应以蒸馏方式进行纯化或以玻璃棉将其中的悬浮物滤去。所进行纯化或以玻璃棉将其中的悬浮物滤去。所使用的有机溶剂，必须进行干燥。使用的有机溶剂，必须进行干燥。. *（3 3）衍生化反应）衍生化反应 （1）SiOC键型键型（2）SiN或或SiC键型键型 （3）SiOSiC键型键型. * Si SiO OSiSiC C键型键型 SiOSiC键型是一类键型是一类目前占绝对优势目前占绝对优势的键的键合相类型，具有良好的热稳定性及化学稳定性，合相类型，具有良好的热稳定性及化学稳定性，能在能在pH 28的介质中使用。
7、这类键合固定相的介质中使用。这类键合固定相是硅胶上的硅羟基与有机氯硅烷或有机氧硅烷是硅胶上的硅羟基与有机氯硅烷或有机氧硅烷试剂反应而得。试剂反应而得。 . *单官能团有机硅烷单官能团有机硅烷 X 通常为通常为Cl、OH、OCH3、OC2H5等官能团；等官能团； R 通常为直链或支链烷基、芳香基，如通常为直链或支链烷基、芳香基，如CH3、C4H9、C8H17、C18H37、苯基等，也可以是它们被不同的基、苯基等，也可以是它们被不同的基团取代后的衍生基团，如团取代后的衍生基团，如(CH2)2CN、(CH2)2NH2、(CH2)nOCH2OH等。等。 Si OH+ R3SiXSi OSiRRR +H
8、X. *双官能团有机硅烷双官能团有机硅烷 双官能团化合物如双官能团化合物如R2SiX2可单独形成线型或环可单独形成线型或环状有机硅氧烷。状有机硅氧烷。Si OH+ R2SiX2Si OSiXRR +HXSiOOHSi OH+ R2SiX2SiOOSi OSiRR+ 2HX. *三官能团有机硅烷三官能团有机硅烷硅烷化试剂中三个硅烷化试剂中三个X X基团都参与硅醇基反应的基团都参与硅醇基反应的可能性很小。三官能团化合物如可能性很小。三官能团化合物如RSiXRSiX3 3反应后的反应后的产物可水解进一步形成硅羟基，进而形成三维产物可水解进一步形成硅羟基，进而形成三维交联化合物交联化合物 + RSiX
9、3+HXSi OHSi OSiXXRSiOOHSi OH+ RSiX3SiOOSi OSiRX+2HX. * 硅烷化试剂的反应活性为：硅烷化试剂的反应活性为：RSiX3R2SiX2R3SiX。 Si-O-Si-C：不水解，热稳定性好，在：不水解，热稳定性好，在pH 28范范围内对水稳定。围内对水稳定。. *聚合层键合相聚合层键合相 在硅胶表面与硅烷化试剂反应时加入一定在硅胶表面与硅烷化试剂反应时加入一定量的水，即形成聚合物，可以制备较致密量的水，即形成聚合物，可以制备较致密的键合层，从而更有效地掩蔽硅胶表面的的键合层，从而更有效地掩蔽硅胶表面的硅羟基硅羟基 但若反应控制不当，会产生过厚的聚合网
10、，但若反应控制不当，会产生过厚的聚合网，而引起传质较慢，柱效降低而引起传质较慢，柱效降低 . *（4 4）端基封尾）端基封尾 残余的硅醇基会对键合相的分离性能产生一定残余的硅醇基会对键合相的分离性能产生一定影响，特别是在非极性键合相的情况下，硅醇影响，特别是在非极性键合相的情况下，硅醇基的存在会降低硅胶表面的疏水性，而对极性基的存在会降低硅胶表面的疏水性，而对极性化合物或溶剂产生吸附，使键合相的分离性能化合物或溶剂产生吸附，使键合相的分离性能改变。改变。原原 因因. *（4 4）端基封尾）端基封尾 用氯化三甲基硅烷等试剂与硅胶表面的残留硅用氯化三甲基硅烷等试剂与硅胶表面的残留硅醇基反应，将残留
11、硅醇基封锁起来的化学处理醇基反应，将残留硅醇基封锁起来的化学处理过程称为端基封尾。过程称为端基封尾。定定 义义. *（4 4）端基封尾）端基封尾 为了进一步消除残留的游离硅醇基，一般在键为了进一步消除残留的游离硅醇基，一般在键合反应后再用合反应后再用封尾剂封尾剂钝化，也可用十八烷基三钝化，也可用十八烷基三氯硅烷再键合一次。氯硅烷再键合一次。 方方 法法最常用的封尾剂有三甲基氯硅烷（最常用的封尾剂有三甲基氯硅烷（TMCSTMCS）和六甲基）和六甲基乙硅氧烷（乙硅氧烷（HMDSHMDS）以外，现已研制出三甲基硅咪唑）以外，现已研制出三甲基硅咪唑（TMSITMSI） . *三甲基氯硅烷三甲基氯硅烷十
12、八烷基十八烷基. *（4 4）端基封尾）端基封尾经封尾处理的硅胶基质固定相经封尾处理的硅胶基质固定相减小了溶质与固定相之减小了溶质与固定相之间的次级相互作用间的次级相互作用，使分离效果明显改善。，使分离效果明显改善。可改善对可改善对极性化合物的吸附或拖尾极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间填料稳定性好了，组分的保留时间重现性重现性就好；就好；如果待分析的样品属如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物酸性或碱性的化合物，最好选用，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。填料经端基封尾的色谱柱。 作作 用用.
13、 *2 2、常见的官能团、常见的官能团 十八烷基硅烷键合硅胶十八烷基硅烷键合硅胶(octyldecylsilica)（ODS）苯基苯基. *氨基氨基P158P158Table 9-4Table 9-4氰基氰基. *3 3、常用的键合相商品牌号、常用的键合相商品牌号一个完整的色谱柱标识包括：色谱柱商品牌号，填料牌号，固定相种类，柱长色谱柱商品牌号，填料牌号，固定相种类，柱长内径，填料粒径；如：内径，填料粒径；如：Phenomenex,Gemini, C18 (150 Phenomenex,Gemini, C18 (150 4.6mm, 5um4.6mm, 5um) )AgilentAgilent
14、,Zorbax, Phenyl (150 ,Zorbax, Phenyl (150 4.6mm, 5um)4.6mm, 5um). *3 3、常用的键合相商品牌号、常用的键合相商品牌号安捷伦公司安捷伦公司（Agilent）Waters公司公司岛津（岛津（ShimadzuShimadzu）公司）公司Merck公司公司. *填料的品牌填料的品牌 Zorbax LiChrosorb XTerra Symmetry Kromail. *（1 1）AgilentAgilent公司公司 Zorbax由著名的色谱科学家由著名的色谱科学家Kirkland研制，研制，并由杜邦公司所生产和销售的系列色谱填料的并由
15、杜邦公司所生产和销售的系列色谱填料的注册商标。现在，注册商标。现在，Zorbax的全部生产线已并入的全部生产线已并入Agilent公司，所以公司，所以Zorbax亦全部转入亦全部转入Agilent公司。公司。 另外还有另外还有LiChrosorb、LiChrospher等。等。 . *（2 2）WatersWaters公司公司 Waters公司是全球性的液相色谱、质谱及相关公司是全球性的液相色谱、质谱及相关产品专业生产厂家，拥有实力雄厚的研究机构产品专业生产厂家，拥有实力雄厚的研究机构和色谱柱生产厂，是唯一同时生产液相色谱仪和色谱柱生产厂，是唯一同时生产液相色谱仪器、化学品及数据处理系统三大液
16、相色谱要素器、化学品及数据处理系统三大液相色谱要素的专业厂商。的专业厂商。 . * Waters公司旗下的色谱柱品牌有很多，如公司旗下的色谱柱品牌有很多，如 BondapakTM，它是能经历，它是能经历20多年但性能基本上保持一致的多年但性能基本上保持一致的HPLC色谱柱。色谱柱。 XTerra色谱柱使用的杂化颗粒技术突破了化学的极限色谱柱使用的杂化颗粒技术突破了化学的极限,是是Waters公司历史上公司历史上HPLC色谱柱销售增长最快的色谱色谱柱销售增长最快的色谱柱家族，无论是药物发现、药物开发，还是进行药物分柱家族，无论是药物发现、药物开发，还是进行药物分离和纯化，离和纯化，XTerra杂
17、化颗粒技术都受到制药领域科学杂化颗粒技术都受到制药领域科学家的热烈欢迎，并在家的热烈欢迎，并在2000年度为年度为Waters赢得赢得R&D100大大奖。奖。 . *（3 3）MerckMerck公司公司 德国默克公司的高效液相色谱从德国默克公司的高效液相色谱从1970年起步年起步到现在，已有众多知名品牌到现在，已有众多知名品牌LiChrosorb、 LiChrospher、Nucleosil、Purospherstar明星明星家族等。家族等。. *（3 3）MerckMerck公司公司 默克公司在默克公司在1999年成功研制出整体化色谱柱年成功研制出整体化色谱柱Chromolith并完成产业
18、化生产，使液相色谱的研究和应用跨并完成产业化生产，使液相色谱的研究和应用跨入了一个全新的时代。入了一个全新的时代。Chromolith是目前世界上分是目前世界上分析速度最快的色谱柱。析速度最快的色谱柱。 2001年年3月份，在美国新奥尔良举行的国际色谱会议月份，在美国新奥尔良举行的国际色谱会议上上Chromolith整体化色谱柱获得整体化色谱柱获得“Pitticon EditorsGold Award”；同年；同年9月份，该产品又获得了第月份，该产品又获得了第38届届“R&D 100 World Award”。. *（4 4）Akzo NobelAkzo Nobel公司公司 Kromasil是
19、瑞典是瑞典Akzo Nobel公司的硅胶填料公司的硅胶填料的牌号。的牌号。Kromasil是一种高纯度、球形硅胶填是一种高纯度、球形硅胶填料。这种填料含碳量高，表面极性小，分离效料。这种填料含碳量高，表面极性小，分离效能高。化学稳定性好，化学纯度高，机械强度能高。化学稳定性好，化学纯度高，机械强度高。近年来开始在我国市场上逐渐为人所知。高。近年来开始在我国市场上逐渐为人所知。. *（5 5）PhenomenexPhenomenex公司公司 Luna、Synergi、Biosep、PolymerX、Jupiter、Rezex、Chirex、Aqua、Zebron、Prodigy、Phonogel、Curosil、Envirosep、IB-Sil、SRAR-IONA300等等 （6 6）SupelcoSupelco公司公司 Discovery 系列快速系列快速LC-MS产品是较短的色谱柱，产品是较短的色谱柱，满足了满足了LC-MS分析的需要分析的需要 . *Thanks for your attention!Thanks for your attention!. *
