1、内容概要内容概要植入前遗传学诊断与筛查的概念植入前遗传学诊断与筛查的概念PGD检测流程检测流程染色体易位携带者的染色体易位携带者的PGD基于全染色体筛查的基于全染色体筛查的PGD(PGD-CCS)单基因病单基因病PGD背景介绍背景介绍适应征及技术进展适应征及技术进展临床应用临床应用植入前诊断植入前诊断 植入前遗传植入前遗传学诊断和筛学诊断和筛查的概念查的概念植入前遗传学植入前遗传学诊断的临床应诊断的临床应用用植入前遗传学植入前遗传学筛查的临床应筛查的临床应用用一、一、植入前遗传学诊断与筛查的概念植入前遗传学诊断与筛查的概念PGD (Preimplantation Genetic Diagnos
2、is)：又称为孕前诊断(preconception genetic diagnosis, PGD)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技术对显微活检的胚胎细胞进行染色体异常或遗传性疾病进行诊断，选择正常的胚胎植入。第一部分 植入前遗传学诊断和筛查的概念PGD/PGS是以ICSI-ET为基础，结合显微操作技术和分子生物学研究的而发展起来的。PGDPGD的意义的意义nPGD可在孕前阶段杜绝X-连锁隐性遗传病、染色体病和基因病患儿的妊娠，避免人工流产终止异常妊娠给广大妇女的身心痛苦。n理论上还可减少遗传病在人群中的遗传负荷。nPGD是遗传性病防治的重要手段，是Edwards获诺贝尔奖的理由之一。植入前诊
3、断植入前诊断传统的产前诊断传统的产前诊断最早于1965由Edwards提出。1968年Gardncr和Edwards在显微操纵下对兔囊胚进行活检，取出少量滋养外胚层细胞分析染色质来选择雌性胚胎。1990年Handyside报道了世界第一例植入前性别诊断婴儿的出生，开创了产前诊断的新纪元。1994年，Munne用FISH技术，在植入前诊断胚胎染色体非整倍体及性别获得成功。1999年，Terlin等用巢式PCR和单链多态性分析技术，对单细胞进行视网膜母细胞瘤的易感性分析，在植入前确定胚胎未来发生肿瘤的可能性大小，从而为PGD应用于人类胚胎基因表达的研究开辟了崭新的途径。2001年Verlinsky
4、有报道对胚胎进行HLA选型以便于骨髓移植。进一步拓宽了该技术的研究和应用。u染色体异常（罗氏易位、相互易位、倒位等）染色体异常（罗氏易位、相互易位、倒位等） 染色体异常的筛查染色体异常的筛查u单基因病（一般的单基因病、性连锁遗传病等）单基因病（一般的单基因病、性连锁遗传病等）单基因异常的筛查单基因异常的筛查 PGDPGD期望解决的问题期望解决的问题 植入前遗传学筛查的概念植入前遗传学筛查的概念u胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetic Screening, PGS），是指胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，通过一次性检测胚胎23对染色体的结构
5、和数目，挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率，降低多胎妊娠。uPGS目前特指针对染色体数目异常，即非整倍体；uPGS理论上将来可以应用于单基因病。uPGS是低风险人群，夫妻双方的染色体或者基因是正常的。卵子精子ICSI活检取样胚胎冷冻遗传学检测选择胚胎胚胎植入遗传咨询知情谈话FISHCHIPPCRMPSIVF临床促排卵（一）活检技术选择(细胞固定及杂交失败，扩增失败，ADO等)。缺点：大部分情况下（除非可以在24小时之内出结果）需将活检后的囊胚冷冻保存。一、染色体易位携带者的一、染色体易位携带者的FISH-PGDFISH-PGD第二部分 植入前遗传学诊断的临床应用相
6、互易位：两条非同源染色体之间进行片段的交换，常常是整个末端的断裂并互换。- Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010着丝粒着丝粒Derivative chromosome 4Derivative chromosome 20罗氏易位：这种类型的易位是在两组端着丝粒染色体 (D组 and G 组, 染色体13-15, 21-22)间进行交换，往往在靠近着丝粒的区域断裂重组，导致易位的两条染色体随体的丢失-Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010CentromereCentromereChr21Chr14de
7、r(14;21)平衡易位携带者的遗传风险平衡易位携带者的遗传风险四射体对于相互易位携带者，配子分离模式理论上产生18种配子类型：包括1种正常, 1种平衡易位型 和16 种不平衡分离的配子。normalbalanceddisomy 21disomy 21nullisomy 21Nullisomy 14罗氏易位产生6种配子类型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4种不平衡分离配子，这类不平衡配子往往导致流产。罗氏易位的遗传风险罗氏易位的遗传风险严重男性因素 17.2% (245/1425)卵巢功能下降1.2% (18/1425) 1998年，FISH技术被用于易位携带者的PGD诊断并获得成功- C
8、onn CM et al. 1998; Munn S et al.1998;Pierce KE et al. 1998度高； 探针能较长时间保存； 多色标记，简单直观； 可用于中期染色体及间期细胞的分析人类干细胞国家工程研究中心 * 中信湘雅生殖与遗传专科医院技术流程ESHRE要求： 实验室胚胎活检技术； 遗传室细胞核玻片固定基础，并对固定程序有详细要求； 选择合适的探针，对平衡易位患者需提前做好外周血淋巴细胞中期分裂相预实验；欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南75%、90%、100%酒精梯度脱水，风干；加入DAPI，处理3min后，直接荧光显微镜下观察。欧洲生殖与
9、胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南着丝粒探针位点特异性探针亚端粒探针FISH-PGDFISH-PGD举例：平衡易位携带者举例：平衡易位携带者预实验结果：外周血淋巴细胞培养制备的一个中期分裂相和一个间期核FISH探针：易位片段的亚端粒探针（6q136qter，Tel 6q SpectrumOrange；10p1510pter， Tel 10p SpectrumGreen）和10号着丝粒片段的着丝粒探针（10p1510qter,blue CEP10 alpha satellite SpectrumAqua）。FISH-
10、PGDFISH-PGD举例：平衡易位携带者举例：平衡易位携带者FISH-PGDFISH-PGD检测结果：检测结果：不同通道滤光片下观察到的细胞核中的FISH探针荧光信号。a胚胎细胞核中每个探针均为2个杂交信号提示每个探针位点均为2个拷贝，表示易位相关的染色体组成为正常或平衡易位。b胚胎核中均为1个红色信号、3个绿色信号和2白色信号，分别提示6号易位片段为一个拷贝、10号易位片段为3个拷贝和10号着丝粒片段为2个拷贝，表示该胚胎为临近-1分离形成的6q136qter单体和10p1510pter三体不平衡产物。临近-1分离模式图2006-2011 年我院易位携带者进行d3 FISH-PGD结果正常
11、或平衡易位胚胎比例低，尤其是相互易位2006-2011 年我院易位携带者进行d3 FISH-PGD结果杂交背景干扰太强的情况杂交杂质信号干扰的情况杂交失败未见信号的情况固定或重杂交细胞核丢失的情况囊胚FISH相对卵裂期FISH更有优势？1.活检细胞数的增多有利于信号的判定；2.直观方便检出胚胎嵌合体。囊胚囊胚FISH-PGDFISH-PGD举例：平衡易位举例：平衡易位FISH面临的挑战不同实验室不同实验室FISH检出率和准检出率和准确率波动较大确率波动较大着床率和妊娠率随着着床率和妊娠率随着FISH检检测错误率的上升而降低测错误率的上升而降低FISH-PGD早期流产胚胎进行比较基因组杂交检测，
12、检出5号染色体重复。需要全染色体筛查为基础的PGD技术？PGD with Comperhansive Chromosome Screening，避免了，避免了FISH仅能检测少数染仅能检测少数染色体的限制，采用全染色体筛查的方式对易位或倒位携带者进行色体的限制，采用全染色体筛查的方式对易位或倒位携带者进行PGD诊断，同诊断，同时排除其它染色体非整倍体异常。时排除其它染色体非整倍体异常。易位携带者的SNP-PGD临床情况总结1. 囊胚+SNP活检分析增加PGD诊断的准确性2. 基于基于SNP的的PGD-CCS可以检测出除易位染色体外其他染色体的异常，减少流产可以检测出除易位染色体外其他染色体的异
13、常，减少流产易位携带者SNP-PGD的临床结局总结0.00%20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%202122232425262728293031323334353637383940414344新发生异常率新发生异常率新发生异常率共分析共分析360 个患者年龄在个患者年龄在2044岁之间，平均新发生异常的几率是岁之间，平均新发生异常的几率是27.2% Age是否是否SNP-PGD需要用于每个易位携带者需要用于每个易位携带者?Comparison D5-FISH and d5-SNP results in translocation carriers 40种
14、代谢疾病，可覆盖大规模人群建立国家和地区发病率数据库 确认诊断疾病，特别是稀有疾病疾病亚型分类，或鉴别相似表型的不同疾病，进行有效干预 拯救婴儿生命，使他们更健康减少对社会和家庭带来的负担减少出生缺陷指导意义指导意义Next Generation Sequencing(NGS)WGASNParray检测NGS检测平行实验已知样本非整倍体单个胚胎干细胞正常核型淋巴细胞FISH-PGD诊断为异常的胚胎重活检淋巴细胞全基因组扩增获得产物临床并行实验SNParray检测NGS检测建立平台评估检出率，准确度等指标，芯片与测序相当方法学的建立2X 测序深度能覆盖60%人类基因组，10X深度能覆盖90%人类
15、基因组。等位基因脱扣ADO率约5-20%；平均值为4%，近着丝粒区段发生ADO率相对较高。碱基对检出误差：C:GT:A.Before & after GC bias correction专为单细胞测序 CNV 分析而设置的算法，矫正WGA产生的GC偏差，使结果更接近基因组DNA测序水平。 方法学的建立我中心完成的NGS-PGD/PGS工作三、单基因病PGD3. 产前诊断1 1、等位基因脱扣（、等位基因脱扣（allele dropout, ADOallele dropout, ADO）影响影响PGDPGD准确性的主要因素之一，其发准确性的主要因素之一，其发9696酶酶；增加活检细胞数等。增加活检
16、细胞数等。单基因病单基因病PGDPGD中，着重解决等位基因脱扣和污染两大问题中，着重解决等位基因脱扣和污染两大问题我们的解决办法：我们的解决办法：1 1）采用）采用ICSIICSI防止精细胞污染；防止精细胞污染；2 2）防止丘细胞污染：）防止丘细胞污染：A.操作中尽量去除卵细胞周围的丘细胞。B.活检的卵裂球在无污染的PBS或培养基中反复洗脱。C.采用多重PCR同时检测活检标本及双亲的DNA指纹加以鉴别。3)3)防止外源防止外源DNADNA污染污染A.实验室物理分区；所有的试剂分装，不反复冻融，耗材一次性使用。B.设立空白对照。C.在专用层流室中操作（如右图）。育龄夫妇未采用任何避孕措施，1年或
17、1年以上未能受孕，称为不孕症不孕症；虽有过妊娠，但均已流产或死胎，而未能获得活婴者，称为不育症不育症。中国不孕不育人数大约大约50005000万万, ,不孕不育的发生率12121515我们的研究发现，人类早期自然流产胚胎中超过50%发生了非整倍体异常。植入前遗传学筛查背景-不孕症和不育症世界范围内不孕不育率高达15%，成为继癌症和心脑血管疾病之外，严重影响人类健康的第三大疾病。Tan YQ,et al.Genetic changes in human fetuses from spontaneous abortion after in vitro fertilization detected
18、by comparative genomic hybridization.Biol Reprod. 2004 Feb;70(2):495-9. Epub 2003 Oct 15.第三部分 植入前遗传学筛查的临床应用New England Journal of Medicine 351(19):1927-1929New England Journal of Medicine 351(19):1927-1929， 20042004植入前遗传学筛查背景-年龄与生育关系文献统计随着女性年龄的升高，流产率逐渐升高，生育率急剧下降。我中心2012年-2013年间不同年龄阶段的296对夫妇共1016枚检测胚
19、胎异常率统计，新发生染色体异常率随女方年龄的增长而升高。植入前遗传学筛查背景-染色体异常与胚胎发育染色体异常是引起胚胎发育能力降低的重要原因，也是出生缺陷的重要原因。据报道，体外培养的D3分裂期卵裂球有50%-70%概率出现染色体异常，其出现频率随母方年龄增加而增加。即使发育到D5囊胚期，仍有40%概率出现染色体异常。传统的胚胎形态学评价体系不能反映胚胎的遗传学真实情况。据报道，在形态学良好的胚胎中，仅42%的胚胎是染色体完全正常的。Joyce Harper, et al 20112009 Colls P, et al.Increased efficiency of preimplantati
20、on genetic diagnosis for aneuploidy by testing 12 chromosomes.Reprod Biomed Online, 19(4):532-538.(首次用到FISH-PGD检测12条染色体)卵裂期使用FISH技术的随机对照试验检测了不同数目的染色体：Staessen et al , 2008Meyer et al, 2009Mersereau et al, 2008Blockeel et al, 2008Debrock et al, 2010Hardarson et al, 2008Schoolcraft et al, 2009没有一个实验显示
21、能增加分娩率，甚没有一个实验显示能增加分娩率，甚至部分研究显示分娩率显著下降。至部分研究显示分娩率显著下降。可能的原因？分裂期卵裂球高度的染色体异常嵌合，导致检测细胞不能很好代表整个胚胎；卵裂期活检过程本身可能对胚胎发育潜能产生危害和负面影响选择合适的活检时间全染色体筛查的方法更多RCTs研究更为有效的PGSPGS技术- Tan YQ., et al. Hum Rerpod. 2013;28(9):2581-2592D3活检影响囊胚发育所有患者同时移植两枚胚胎，所有患者同时移植两枚胚胎，一枚来自卵裂期或囊胚期活一枚来自卵裂期或囊胚期活检的胚胎，一枚来自未活检检的胚胎，一枚来自未活检的胚胎，采用
22、的胚胎，采用DNA指纹鉴定指纹鉴定妊娠胚胎的来源。妊娠胚胎的来源。2013卵裂期活检 -损伤胚胎发育潜能的风险囊胚期活检较卵裂期囊胚期活检较卵裂期活检对胚胎的发育潜活检对胚胎的发育潜能影响更小；能影响更小；卵裂期活检 -损伤胚胎发育潜能的风险染色体检测方法染色体检测方法的差的差异。异。 胚胎嵌合现象示意图胚胎嵌合现象示意图In 1993 chromosomal mosaicism was described in human preimplantation embryos for the first time. -Delhanty et al.1993 conclusions:Diploida
23、neuploid mosaicism is by far the most common chromosomal constitution in spare human preimplantation embryos after IVF. This undermines the reliable determination of the ploidy status of a cleavage-stage embryo based on the analysis of a single cell. Future research should determine the origin and d
24、evelopmental potential of mosaic embryos随着胚胎的随着胚胎的发育，嵌合发育，嵌合体胚胎比例体胚胎比例逐渐降低。逐渐降低。The fate of the mosaic embryo chromosomal constitution and development of Day 4, 5 and 8 human embryos. Santos MA,et al. Human Reproduction, Vol.25, No.8 pp. 19161926, 2010嵌合对PGS诊断的影响40%aneuploid cells 25%aneuploid cells
25、 25-40%aneuploid cells FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage,Antonio C,et al. Human Reproduction, Vol.0, No.0 pp. 110, 2013真正会影真正会影
26、响到移植响到移植风险的嵌风险的嵌合胚胎发合胚胎发生率仅为生率仅为5%.因为绝大因为绝大多数非整多数非整倍体异常倍体异常在内细胞在内细胞团与滋养团与滋养层中共同层中共同发生。发生。而在滋养而在滋养层细胞中层细胞中可能嵌合可能嵌合存在更多存在更多异常。异常。嵌合对PGS诊断的影响如何理解卵裂期活检的影响（Timelapse分析） 正常卵裂球的移除进一步影响胚胎发育的潜能 异常卵裂球的存在影响胚胎的正常诊断Fertil Steril. 2013 Sep;100(3):608-14. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.004.极体活检对胚胎没有损伤，随着极体染色体检测
27、技术的进步，如极体活检对胚胎没有损伤，随着极体染色体检测技术的进步，如更精确而且便宜的测序技术的应用，极体活检将成为未来更精确而且便宜的测序技术的应用，极体活检将成为未来PGD/PGS中一项非常有前景的技术。中一项非常有前景的技术。 避免嵌合的影响避免嵌合的影响不影响未来的胚胎不影响未来的胚胎仅检测减数分裂错误而未评估有丝分裂错仅检测减数分裂错误而未评估有丝分裂错误，而有丝分裂可能修复减数分裂错误误，而有丝分裂可能修复减数分裂错误 能分析来自父母双方的异常能分析来自父母双方的异常嵌合嵌合(滋养外胚层可能不能代表内细胞团滋养外胚层可能不能代表内细胞团) 囊胚培养和玻璃化囊胚培养和玻璃化冷冻冷冻美
28、国的Nathan Treff 代表与欧洲的Joep Geraedts达成了许多共识：极体活检与囊胚活检各有优势，不再建议进行卵裂期活检Willadsen S et al. Hum. Reprod. 1999;14:470-475早年PGS尝试：利用动物MII卵构建人卵裂球分裂相技术难度大，构建成功率低，无法实现临床应用。全染色体组筛查技术FISH: 9-11条条chr所有23对人染色体都需要筛查CGH-比较基因组杂交比较基因组杂交aCGH: 基因组杂交芯片基因组杂交芯片Microarray SNP RealTime PCRNext Generation Sequencingplanned fr
29、esh euploid blastocyst transfer (首次用首次用qPCR做做PGS)2013 Chunlei Zhang,et al.A Single Cell Level Based Method for Copy Number Variation Analysis by Low Coverage Massively Parallel Sequencing (首次用首次用NGS做做PGS)Pubmed总体能够搜索到2881篇文献，自2002年至今，每年平均有176篇，称增长趋势JM,2014rray囊胚检测结果囊胚检测结果高龄患者非整倍体异常及发生频率极高。高龄患者非整倍体异常
30、及发生频率极高。PGS适应证-高龄反复植入失败反复植入失败：2003年Wilton等人将单细胞CGH应用到反复植入失败（Recurrent Implantation Failure,RIF）患者的PGS中，对比应用CGH与FISH两种平台，发现单细胞CGH-PGS的植入率与妊娠率均高于FISH。2007年Voullaire等人对28名反复失败女性采用CGH筛查胚胎非整倍体，发现存在高比例的染色体异常。2014年最新研究Basile等人结合arrayCGH及Timelaps形态学分析反复植入失败患者125个周期504枚胚胎，认为随着胚胎发育动力的逐渐减弱，染色体正常胚胎逐渐减少。Geoffrey
31、 Sher, et al. Genetic analysis of human embryos by metaphase comparative genomic hybridization (mCGH) improves efficiency of IVF by increasing embryo implantation rate and reducing multiple pregnancies and spontaneous miscarriages. Fertility and Sterility 2009;92(6).35岁，优质患者，单囊胚移植的随机研究，aCGH筛选囊胚后明显提高妊娠率。“until results of RCTs using a different biopsy stage and arrays can demonstrate a significant increase in delivery rates, there is no evidence that routine PGS is beneficial for patients with advanced maternal age”
