1、血 液 中 葡 萄 糖 的 测 定血 液 中 葡 萄 糖 的 测 定 邻甲苯胺法邻甲苯胺法 1PPT学习交流一、实验目的一、实验目的 (1)(1)了解血糖的概念。了解血糖的概念。(2) (2) 掌握血糖的测定方法掌握血糖的测定方法邻甲苯胺法。邻甲苯胺法。2PPT学习交流二、二、 实验原理实验原理p血糖及正常血糖水平血糖及正常血糖水平:血糖：指血液中的葡萄糖血糖：指血液中的葡萄糖.正常血糖浓度：正常血糖浓度： 空腹波动在空腹波动在3.893.896.7mmol/L6.7mmol/L（7070110mg/dl110mg/dl） 餐后餐后2h2h内应内应7.8mmol/L7.8mmol/L（140m
2、g/dl140mg/dl）。）。 3PPT学习交流糖的重要生理功能4PPT学习交流血糖的来源、去路血糖的来源、去路 5PPT学习交流6PPT学习交流p 7PPT学习交流高血糖症与糖尿病高血糖症与糖尿病、高血糖症高血糖症: :空腹血浆血糖（空腹血浆血糖（FPGFPG）6.76.7 mmol/Lmmol/L（130mg/dl130mg/dl）生理性：包括生理性：包括饮食性饮食性（高糖饮（高糖饮食）或食）或情感性情感性（情绪紧张，肾（情绪紧张，肾上腺分泌增加）上腺分泌增加）病理性：见于病理性：见于糖尿病；内分泌腺糖尿病；内分泌腺（甲（甲状腺、肾上腺皮质或髓质、胰岛细胞状腺、肾上腺皮质或髓质、胰岛细胞
3、功能亢进）；功能亢进）；颅内压颅内压升高刺激血糖中升高刺激血糖中枢；呕吐、腹泻、高热等引起的枢；呕吐、腹泻、高热等引起的脱水。脱水。尿糖：尿糖：若血糖浓度高于肾糖阈值若血糖浓度高于肾糖阈值9.0mmol/L9.0mmol/L，出现尿糖。，出现尿糖。8PPT学习交流糖尿病（糖尿病（diadiabetbetes mellitus,DMes mellitus,DM） 定义：定义：是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病，系胰岛素相对或绝对不是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病，系胰岛素相对或绝对不足，或利用缺陷引起。足，或利用缺陷引起。临床特征：临床特征：血糖持续升高，甚至出现糖尿。长期患有糖尿病常有脂类、血糖
4、持续升高，甚至出现糖尿。长期患有糖尿病常有脂类、蛋白质代谢紊乱以及眼、肾的微血管病变及神经病变等蛋白质代谢紊乱以及眼、肾的微血管病变及神经病变等并发症并发症。严重者。严重者还可出现水、电解质紊乱及酸碱平衡紊乱，表现为高脂血症，酮症酸中还可出现水、电解质紊乱及酸碱平衡紊乱，表现为高脂血症，酮症酸中毒等，重者可致死亡。毒等，重者可致死亡。9PPT学习交流糖尿病的分类IDDM：也称型糖尿病，好发于青春期，对胰岛素敏感。NIDDM： 型，常见于中年肥胖病人，病变在于靶细胞膜上的胰岛素受体的数目减少或者缺陷，因而对胰对胰岛素不敏感。继发性糖尿病：如嗜铬细胞瘤、库欣病等，或其它因素。 10PPT学习交流两
5、类原发性糖尿病的特征两类原发性糖尿病的特征 特特 征征 1 1型型 2 2型型基本病因基本病因 遗传遗传+ +环境环境发病机制发病机制 自身免疫性疾病自身免疫性疾病 生物活性降低生物活性降低占占DM% DM% 15% 15% 85%85%（可发展为（可发展为1 1型）型）发病年龄发病年龄 通常通常2020岁岁 4040岁岁身体肥胖身体肥胖 罕见罕见 多见多见血胰岛素血胰岛素 （绝对不足）（绝对不足）或或（相对不足）（相对不足）病情及酮症病情及酮症 较重、常见较重、常见 较轻、少见较轻、少见 治疗治疗 胰岛素敏感胰岛素敏感 控制饮食、减控制饮食、减肥肥11PPT学习交流无机化学法无机化学法有机化
6、学法有机化学法酶法酶法血糖的测定12PPT学习交流（一）无机化学法（氧化还原法）（一）无机化学法（氧化还原法） 方法 类型 原 理 用途及备注 班氏法班氏法 半定量半定量 G+Cu+CuG+Cu+Cu2 2O O 尿糖测定尿糖测定（BenedictBenedict） 磷钼酸法磷钼酸法 定量定量 G+Cu+CuG+Cu+Cu2 2O O 历史意义历史意义（Folin-WuFolin-Wu）分光）分光 Cu+ Cu+ 磷（砷）钼酸盐磷（砷）钼酸盐 操作复杂、操作复杂、需制滤液、需制滤液、 砷钼酸法砷钼酸法 同上同上 蓝色络合物蓝色络合物 特异性差特异性差、 新铜试剂法新铜试剂法 （660nm660
7、nm） 受还原物质影响受还原物质影响结果偏高结果偏高10%10% 碱性高铁碱性高铁 同上同上 G+Fe(CN)G+Fe(CN)6 6-3-3 Fe(CN) Fe(CN)6 6-4 -4 历史意义历史意义氰化物法氰化物法 黄色黄色 无色无色 TechniconTechnicon曾曾用用13PPT学习交流（二）有机化学法（缩合法）（二）有机化学法（缩合法） 方法方法 类型类型 原原 理理 用途及备注用途及备注 邻甲苯胺邻甲苯胺 定量定量 G+G+邻甲苯胺邻甲苯胺G G基胺基胺 操作简便、操作简便、法法（630nm630nm） 无需滤液、无需滤液、特异性较高，特异性较高，中小医院使中小医院使用普遍，
8、很用普遍，很少用于自动少用于自动14PPT学习交流邻甲苯胺法邻甲苯胺法15PPT学习交流（三）（三）酶酶 法法 方法 类型 原 理 用途及备注 己糖激酶己糖激酶 定量定量 G+ATPG-6-P+ADP G+ATPG-6-P+ADP 血清尿液脑脊液、血清尿液脑脊液、（HKHK）法）法 分光分光 G-6-P + NADP+ G-6-P + NADP+ 公认参考方法公认参考方法 动态动态 GA-6-P + NADPH GA-6-P + NADPH 操作简便，特异操作简便，特异 终点终点 （340nm340nm） 性和灵敏性均高性和灵敏性均高手工、自动化分析手工、自动化分析 葡萄糖氧葡萄糖氧 同上同上
9、 G+OG+O2 2 GA+H2O2 GA+H2O2 推荐常规方法推荐常规方法化酶（化酶（PODPOD） H H2 2O2 + O2 + 染料染料有色染料有色染料 偶联法偶联法 （还原型）（还原型） （氧化型）（氧化型） 可制试纸片定量可制试纸片定量（TrinderTrinder） （4-4-氨基安替比林氨基安替比林+ +酚酚 半定量筛选试验半定量筛选试验 红色琨类化合物红色琨类化合物505nm505nm）16PPT学习交流 方法方法 类型类型 原原 理理 用用途及备注途及备注 葡萄糖氧葡萄糖氧 定量定量 G+OG+O2 2 GA+H GA+H2 2O O2 2 与与HKHK法有最佳法有最佳化
10、酶氧消化酶氧消 电化学电化学 用用O O2 2电极作极谱测定，电极作极谱测定， 相关性相关性耗法耗法 动态动态 求求O O2 2的消耗量的消耗量 （CX3CX3生化仪）生化仪） 终点终点 葡萄糖脱葡萄糖脱 定量定量 G + NAD+GA + NADH G + NAD+GA + NADH 偶有使用偶有使用氢酶（氢酶（GDHGDH）分光）分光 （340nm340nm）可自动化分析）可自动化分析法法 动态动态17PPT学习交流刺血针刺血针18PPT学习交流20 : 01 9.10M4.5 mmol血糖仪血糖仪19PPT学习交流二、实验原理二、实验原理 葡萄糖在热的醋酸溶液中，与邻甲苯胺缩合成雪夫氏碱
11、(Schiff base)。 雪夫氏碱呈兰绿色，其最高吸收峰为630nm波长，颜色深浅与葡萄糖含量成正比。反应式如下:20PPT学习交流三、实验器材三、实验器材1.分光光度计（630nm），比色皿 2. 计算纸（9 cm9 cm）3. 水浴锅4. 10ml容量瓶四、实验试剂四、实验试剂 1. 邻甲苯胺溶液 2.5g硫脲溶于冰醋酸，加入邻甲苯胺150ml及2.4%硼酸100ml，用冰醋酸定容至1升2. 葡萄糖标准母液 （10mg/ml，用饱和苯甲酸溶液配制）3. 血清 （100ml）21PPT学习交流 血液经抗凝处理后的全部血液为全血全血；离心除去血细胞后所得到的淡黄色液体为血浆血浆。 如血液不
12、经抗凝处理，让他自行凝固，则在抽血后的一段时间内，血液会自动在一系列凝血因子的作用下发生凝集，血液首先凝固成一个整体，再经过一段时间或用离心机离心，血液中凝固的部分会与一些清澈淡黄色的液体分离开，这些液体称为血清血清。血清与血浆从表面上看似乎没有什么不同，但其内在的主要区别是血清中不含纤维蛋白原，是未经抗凝处理过的血液凝固后得到的。 血清多用于血液生化、免疫等方面的测定；血浆多用于凝血等方面的测定；全血则多用在血细胞、血常规、血沉等方面的测定。22PPT学习交流五、实验步骤五、实验步骤取5支10ml容量瓶，标号，依次加入葡萄糖母液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0ml，用饱和苯甲酸稀释至
13、10ml，混匀（则上述溶液100ml葡萄糖含量为25，50，100，200，300mg ）；混匀后，置沸水中 15分钟，立即移入冷水浴中冷却；以0号管调零，在630nm 处比色（见下表），以各管的 吸光度为纵坐标，相应管中葡萄糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，并根据测定管吸光度查找含量。23PPT学习交流24PPT学习交流标准曲线标准曲线（standard curve）是指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线。 标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。建立标准曲线的目的是推导待测物质的理化属性。 常用标准曲线法进行定量分析，通常情况下的标准工作曲线是一条直线。 25PPT学习交流六、注意事项六、注意事项 1. 本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与醛糖显色，血液中其他还原性物质基本上无影响。 2. 邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度、冰醋酸浓度、加热时间有关。此法显色稳定，24小时内无变化。如将加热时间缩短，生成颜色容易消褪。 3. 轻度溶血的血清对结果无明显影响。根据推导，血清中含血红蛋白 450毫克/100毫升时，可使测定结果降低约10%。 4.高脂血的标本最后显色有时会出现浑浊，影响测定结果。可先制备血滤液后再行测定。26PPT学习交流
