1、细菌培养及鉴定细菌培养及鉴定 .标本采集原则标本采集原则1.1.及时及时采集微生物标本作病原学检查采集微生物标本作病原学检查2.2.在抗菌药物在抗菌药物使用前使用前采集标本采集标本3.3.采样时严格执行采样时严格执行无菌操作无菌操作4.4.标本标本容器须无菌容器须无菌，但不得有消毒剂但不得有消毒剂5.5.采样后采样后立即送检立即送检6.6.送检标本应注明送检标本应注明来源来源和检验和检验目的目的.咳痰方法咳痰方法病人先病人先漱口，漱口，清洁口腔，清洁口腔，去除表面的菌群去除表面的菌群 病人病人深咳深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液，收集从下呼吸道咳出的痰液无痰可用无痰可用35NaCl 5ml雾吸约
2、雾吸约5min导痰导痰以清晨以清晨第二口第二口痰为佳痰为佳标本采集后放置时间不超过标本采集后放置时间不超过2小时小时 .清洁中段尿液清洁中段尿液尽量取早晨尽量取早晨第一次第一次尿液尿液嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人女性病人收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口冲洗尿道口排出几毫升后，排出几毫升后，不停止不停止尿流，采集尿流，采集中段尿中段尿男性病人男性病人翻转包皮，清洗尿道口翻转包皮，清洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流排出几毫升后，不停止尿流,采集采集中段尿中段尿 采集标本后立即送检！采集标本后立即
3、送检！.哥伦比亚血平板哥伦比亚血平板营养要求高的细菌营养要求高的细菌巧克力平板巧克力平板含含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用脑膜炎球菌和淋球菌用中国蓝中国蓝/麦康凯平板麦康凯平板G-杆菌用杆菌用SS平板平板沙门氏菌和志贺氏菌用沙门氏菌和志贺氏菌用M-H平板平板细菌药敏用细菌药敏用TCBS平板平板弧菌科细菌用弧菌科细菌用沙包氏平板沙包氏平板真菌培养用真菌培养用真菌显色平板真菌显色平板真菌培养用真菌培养用罗氏培养基罗氏培养基分枝杆菌用分枝杆菌用常用的培养基种类和用途常用的培养基种类和用途.临床标本培养基选择临床标本培养基选择血血： 血培养瓶血培养瓶中断尿中
4、断尿：血平板、：血平板、mac平板平板脑脊液脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平：血培养瓶、血平板、巧克力平板板穿刺液穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平：血培养瓶、血平板、巧克力平板、板、mac平板平板胆汁胆汁：血平板、巧克力平板、：血平板、巧克力平板、mac平板平板大便大便:. .麦康凯、麦康凯、SSSS、血、血平板平板.细菌接种的基本程序细菌接种的基本程序灭菌接种环灭菌接种环沾取标本沾取标本接种接种灭菌接种环灭菌接种环.细菌接种法细菌接种法平板划线接种法：平板划线接种法： 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。形成单个菌落，以便获得纯
5、菌。 方法：方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本分区划线法：适用于含菌量较多的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本.分区划线法分区划线法(3区区)第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环.连续划线法连续划线法.细菌培养法细菌培养法一般培养一般培养（需氧培养）：（需氧培养）：培养温度：培养温度：35（采用恒温培养箱）（采用恒温培养箱）培养时间：培养时间：1824h二氧化碳培养法二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养：烛缸法、二氧化碳培养箱箱厌氧培养法厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋
6、、厌氧：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等.细菌在固体培养基中的生长现象细菌在固体培养基中的生长现象菌落菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性明度、湿润度、黏度、溶血性菌落类型：光滑型（菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（）、粗糙型（R）、黏液型）、黏液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌
7、堆积物。.菌菌 落落.菌落与菌苔菌落与菌苔.菌落的三个类型：菌落的三个类型：1.1.光滑型菌落（光滑型菌落（Smooth type ColonySmooth type Colony） ：又称：又称S S型型2.2.粗糙型菌落（粗糙型菌落（Rough type ColonyRough type Colony）：又称）：又称R R型型3.3.粘液型菌落（粘液型菌落（Mucoid type ColonyMucoid type Colony）又称）又称M M型型.2022-5-1716 S型菌落型菌落 .R型菌落.革兰染色革兰染色原理原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形：通过结晶紫初染和碘液
8、媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在
9、遇脱色剂后，以类脂高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。呈红色。. 革兰染色步骤革兰染色步骤 涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片涂片 干燥干燥 固定固定.固定的目的：固定的目的：使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固；可改变菌体对染料的通透性；加热固定可杀死细菌，比较安全。
10、 . 结晶紫结晶紫 1 1 碘液碘液 1 1 95%95%乙醇乙醇 3030” 复红复红1 1 冲洗冲洗 滤纸干燥滤纸干燥 油镜观察油镜观察冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗革兰染色程序革兰染色程序初染初染媒染媒染脱色脱色复染复染.紫色（紫色（G）革兰氏染色步骤示意图革兰氏染色步骤示意图革兰染色革兰染色甲甲菌菌乙乙菌菌初染初染结晶紫结晶紫媒染媒染碘液碘液脱色脱色乙醇乙醇复染复染稀释复红稀释复红紫色（紫色（G）红色（红色（G-）革兰染色步骤示意图革兰染色步骤示意图.【结果结果】细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌；而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；阳性菌阳性菌紫色紫色（G+b) G+b) 阴性菌阴性菌红色（红
11、色（G-b)G-b).G+ 球菌.显微镜下的杆菌G-杆菌Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells.痰标本涂片染色低倍镜下分类痰标本涂片染色低倍镜下分类 分级分级 白细胞白细胞（个）（个） 上皮细胞上皮细胞（个）（个） A 25 25 25 C 25A、B两种情况的痰适合做培养，两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标不合格，应重新留标本本.革兰染色注意事项革兰染色注意事项标本标本涂片涂片不宜不宜太厚太厚固定固定不宜不宜过热过热脱色脱色不宜不宜过度过度选用培养选用培养18-24小时小时菌龄的细菌为宜菌龄的细菌为宜.抗酸染色抗酸染色原理原理：分
12、枝杆菌细胞壁含脂质较多：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中其中主要成分为分枝菌酸主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性此物具有抗酸性,染染色时与石炭酸复红结合牢固色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性能抵抗酸性乙醇的脱色作用乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红因此抗酸菌能保持复红的颜色的颜色,达到染色目的。达到染色目的。. 抗酸染色步骤抗酸染色步骤 1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。、涂片包括涂片、干燥、固定三步。 涂片涂片 干燥干燥 固定固定.抗酸染色步骤抗酸染色步骤2、染色包括初染、脱色、复染三步。、染色包括初染、脱色、复染三步。 石炭酸复红维持石炭酸复红维持 3-5 5 3%盐酸酒精盐酸酒精30
13、1 美蓝复染美蓝复染1 冲洗冲洗 干燥干燥 油镜观察油镜观察冲洗冲洗冲洗冲洗初染初染脱色脱色复染复染.抗酸染色结果抗酸染色结果抗酸菌呈红色抗酸菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。.抗酸杆菌报告抗酸杆菌报告300个视野仅见到个视野仅见到18条抗酸杆菌填写条条抗酸杆菌填写条数数1+：镜检查见：镜检查见3-9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/100高倍镜高倍镜视野视野2+：镜检查见：镜检查见19条抗酸杆菌条抗酸杆菌/10高倍镜高倍镜视野视野3+：镜检查见：镜检查见1-9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/高倍镜视高倍镜视野野4+:镜检查见镜检查见9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/高倍镜视野高倍镜视
14、野.抗酸染色注意事项抗酸染色注意事项染色染色充分充分脱色时间脱色时间宁长勿短宁长勿短在涂抹痰标本时在涂抹痰标本时严禁严禁对载玻片进行对载玻片进行加热加热.临床标本培养基选择临床标本培养基选择生殖道标本根据临床医生所写的检验项生殖道标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作目接种相应的平板及操作： 淋球菌培养接种淋球菌平板淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养则按支原体培种沙保罗培养基；支原体培养则按支原体培养的操作规程操作；作普通培养则接种血平养的操作规程操作；作普通培养则接种血平板和巧克力平板板和巧克力平板 .观察细菌在平板上的生长现象观察细菌在
15、平板上的生长现象血平板血平板：大小、形状、边缘、颜色、表：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性面、透明度、湿润度、黏度、溶血性mac平板平板：大小、形状、颜色、透明度、：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度湿润度、黏度巧克力平板巧克力平板：大小、形状、颜色、透明：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度度、湿润度、黏度.2022-5-1737 革兰阴性菌革兰阴性菌 葡萄球菌葡萄球菌.细菌的初步分类细菌的初步分类细菌的分离与纯化细菌的分离与纯化：自血平板挑出待检菌自血平板挑出待检菌株的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，株的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应该重新转种分
16、纯。应该重新转种分纯。染色与镜检染色与镜检： 首先通过革兰氏染色确定基本首先通过革兰氏染色确定基本的分类：（的分类：（1）G+球菌（球菌（2）G-球菌（球菌（3）G-杆杆菌（菌（4）G+杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。能是真菌。.金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌最重要最重要的致病葡萄球菌的致病葡萄球菌血平板上菌落有明显血平板上菌落有明显溶血环溶血环，颜色呈金，颜色呈金黄色、灰白色或柠檬色黄色、灰白色或柠檬色分解分解葡萄糖葡萄糖、麦芽糖麦芽糖、蔗糖蔗糖和和甘露醇甘露醇血浆凝固酶和血浆
17、凝固酶和DNA酶酶阳性阳性 .2022-5-1741葡萄球菌葡萄球菌.念珠菌显色培养基念珠菌显色培养基绿色绿色白色念珠菌白色念珠菌蓝色蓝色热带念珠菌热带念珠菌白色白色其他，细菌被其他，细菌被抑制抑制紫色紫色光滑光滑粉色粉色克柔假丝酵母克柔假丝酵母菌菌.嗜血杆菌的鉴定途径嗜血杆菌的鉴定途径只能只能在营养条件高的在营养条件高的巧克力巧克力平板上生长，平板上生长，菌落为中等大小、圆形菌落为中等大小、圆形、灰白色、透明灰白色、透明革兰染色：革兰染色：G-小杆菌小杆菌卫星实验卫星实验就可以帮助初步鉴定就可以帮助初步鉴定.2022-5-1748嗜血杆菌嗜血杆菌.奈瑟氏菌属鉴定奈瑟氏菌属鉴定在血平板和巧克力
18、平板上生长，在血平板和巧克力平板上生长，mac上上不生长不生长血平板形成血平板形成灰色、湿润、透明或半透明、灰色、湿润、透明或半透明、不溶血的菌落不溶血的菌落巧克力平板上形成巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露圆形、灰蓝色的似露滴状菌落滴状菌落革兰染色：革兰染色： G-双球菌，呈肾形或咖啡豆双球菌，呈肾形或咖啡豆形，凹面相对形，凹面相对氧化酶和触酶都均为氧化酶和触酶都均为阳性阳性. 奈瑟氏菌属有奈瑟氏菌属有11个种，临床就个种，临床就淋病奈淋病奈 菌菌和和脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌 最为重要最为重要.奈瑟氏菌属鉴定流程奈瑟氏菌属鉴定流程 菌落观察菌落观察：灰色、湿润、透明或半透明、不溶血：灰色、湿
19、润、透明或半透明、不溶血 涂片染色涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状双球菌，呈肾形或咖啡豆状 氧化酶试验氧化酶试验+ 触酶触酶+ + 麦芽糖麦芽糖 - 脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌 淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌.细菌的鉴定与药敏细菌的鉴定与药敏.卫生部重点监控的卫生部重点监控的6种种MDRO MASA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌判断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁判断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁诱导实验阳性诱导实验阳性CRAB：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌判断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药判断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药 VER：耐万古霉素肠球菌：耐万古霉素肠
20、球菌判断标准：对万古霉素耐药判断标准：对万古霉素耐药.ESBLs：产超广谱：产超广谱内酰胺酶细菌。包括：内酰胺酶细菌。包括：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌等菌等判断标准：对第判断标准：对第3代和第代和第4代头孢菌素和代头孢菌素和氨曲南耐药氨曲南耐药CRE:耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐药药MDR/XDROA:多重耐药多重耐药/泛耐药铜绿假单泛耐药铜绿假单胞菌胞菌判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐药药.临床常见问题临床常见问题痰涂片与
21、痰培养结果不一致？痰涂片与痰培养结果不一致？ 培养和涂片选择的痰液不同；标本采培养和涂片选择的痰液不同；标本采集时间过长，部分苛养菌死亡；集时间过长，部分苛养菌死亡；选择药敏结果敏感的药物，临床治疗无选择药敏结果敏感的药物，临床治疗无效？效？ 体外药敏试验只能预测体内治疗效果，体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药并不等同；一般来说，耐药=治疗无效，治疗无效，敏感敏感治疗有效治疗有效.今天培养结果与前天结果不一样？今天培养结果与前天结果不一样？1）取材是否规范？）取材是否规范？2）痰标本有时候选择优势菌做，可能结果）痰标本有时候选择优势菌做，可能结果 不一样不一样3）抗生素
22、的使用）抗生素的使用鉴定结果为四联球菌、革兰阳性杆菌，为鉴定结果为四联球菌、革兰阳性杆菌，为何没有药敏结果？何没有药敏结果？1）四联球菌为微球菌，一般不引起人体致）四联球菌为微球菌，一般不引起人体致病，考虑为污染病，考虑为污染2）革兰阳性杆菌目前没有参照标准，故暂）革兰阳性杆菌目前没有参照标准，故暂不做药敏试验，若需要治疗参考阳性球菌不做药敏试验，若需要治疗参考阳性球菌用药用药.B群链球菌群链球菌寄生在产妇生殖道。孕产寄生在产妇生殖道。孕产妇脓毒血症和新生儿脑膜炎的重要原因妇脓毒血症和新生儿脑膜炎的重要原因支原体、衣原体支原体、衣原体. 谢谢大家！谢谢大家！.检测结果为找到抗酸杆菌，临床已经排检测结果为找到抗酸杆菌，临床已经排除了结核除了结核抗酸杆菌包括结核与非结核分枝杆菌，抗酸杆菌包括结核与非结核分枝杆菌，抗酸杆菌阳性不一定就是结核。抗酸杆菌阳性不一定就是结核。.
