1、11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术11.2 获得需要的目的基因（外源基因）11.3 构建重组质粒和基因克隆11.4 转化受体细胞和转化子的筛选11.5 转化子的分析Southern杂交重组DNA技术，又称为基因克隆或分子克隆技术， 克隆(clone)-无性繁殖 分子克隆 DNA的无性繁殖技术 重组DNA技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术基因工程(genetic engineering)所谓基因工程(genetic engineering)就是把外源
2、基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表达的操作叫基因工程。基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或表达所需要的产物。 重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成
3、互补的DNA片段，建立cDNA文库；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。 （4）化学合成11.2 获得需要的目的基因（外源基因）n 细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建l 细胞内总DNA的提取分离程序苯酚沉淀蛋白质l 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。l 基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。cDNAcDNA文库的构建文库的构建mRNA 反转录cDNA(互补DNA）第二条DNA链
4、n 反转录人工合成互补DNA, cDNA 构建基因文库获取目的基因存在的问题费时费事内含子序列 反转录人工合成互补DNA方法的优势获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因n 聚合酶链式反应（PCR）l PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。l 加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。n 聚合酶链式反应（PCR）l变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链
5、DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链n 聚合酶链式反应（PCR）l每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段l PCR技术的发明 PCR的发明是DNA操作技术的革命 美国Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖 基因重组和克隆操作最重要的工具是： 1.限制性内切酶 2.载体 和 3.宿主菌 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等
6、操作。11.3 构建重组质粒DNA和基因克隆n 限制性内切酶 限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。识别特定的核苷酸序列46个碱基对形成粘性末端或平端n 限制性内切酶 已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段 粘性末端 T4连接酶 The formation of a recombinant DNA molecule载体载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，（1）能够自我复制，并带动插入的外
7、源基因一起复制（2）具有合适的限制性酶切位点（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）载体的分子量要小 （6）细胞内稳定性高目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。质粒 基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯
8、化便可获得想要的产品。 通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物。11.4 转化受体细胞和转化子的筛选宿主菌或受体细胞n感受态细胞（competent cell） 受体细胞和重组基因的导入（转化或转染） 将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1获得目的基因和质粒载体；2形成重组质粒；3制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。 pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，
9、如果平板培养基中含有IPTGIPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-galX-gal，X-galX-gal（ 半乳糖苷酶的底物）便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆 利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒 pUC18载体还携带了抗生素（antibiotic）基因，可筛选重组质粒。n 一般克隆基因的检查和鉴定方法 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力 不同迁移率分子量标准参照物l 酶切和电泳方法Restriction mapping酶切克隆基因的检
10、查和鉴定方法32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法l DNA杂交直接鉴定l 植物遗传转化常用的方法 载体法转化农杆菌介导法（Ti质粒） 基因的直接转移（1）高压电脉冲电激穿孔（2）基因枪法（3）微注射法 构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株（直接转化重组质粒） 纪念发明者Edward Southern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析11.5 转化子的分析Southern杂交 Southern杂交分析示例 A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Sou
11、thern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中 1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。 1988年，美国国家卫生院和能源部 迄今为止在生命科学领域最宏大的研究计划人类基因组计划 主要内容是完成人体23对染色体的全部基因的遗传作图和物理作图，完成23对染色体上30亿个碱基的序列测定 以美国为主、包括英国、法国、日本和中国多国科学家参加的国际合作计划9.7 人类基因组计划基因交换导致基因重组 重组率染色体上各基因间的重组率与基因位点间的距离成正比三点测交法 遗传学图 人类基因组计
12、划主要应用了4方面相互配合与补充的研究方法和技术：1. 用RFLP等标记出包含大约1 Mb的超大片段进行定位作图2. 用RFLP把超大片段分割成10多个包含100 kb的大片段，做出它们的物理图3. 用酵母人工染色体(YACs）或其他载体构建包含其中小片段的一系列重叠的克隆，约0.51.0 Mb4. 对小片段逐个进行测序，进而实现对整个染色体的测序和作图 1992年，酵母3号染色体DNA的全部315 357个碱基序列的测定，这是人类完成的第一条真核生物染色体DNA的全序列。 1995年，科学家们获得了人类第3、第16和第22号染色体的高密度物理图。 1996年，科学家们完成酵母其他15条染色体
13、的碱基序列测定。 1997年，大肠杆菌基因组序列测定宣告完成。 1999年12月1日，科学家们宣布，人类第22号染色体，含3.34107个碱基序列的测定已经全部完成，这是人类完成的第一条人类自身染色体的全序列测定。 2000年6月26日，人类基因组工作框架图完成，标志着功能基因组时代的到来。 科学家们对人类基因组的性质和作用的认识在不断地深化。 未来：健康领域、基础科学研究领域重组DNA技术的一般操作步骤有：(1)获得目的基因；(2)构建重组质粒；(3)转化受体细胞；(4)筛选和鉴定转化子；(5)培养转化细胞获得所需性状或所需产物。 获得目的基因的方法有：提取总DNA构建基因文库并从中调用；以
14、mRNA为模板合成互补DNA片段；利用PCR特异性扩增所需目的基因片段等。用紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。 用限制性内切酶识别并切开核酸序列特定位点，将外源基因插入到载体中，用重组载体转化宿主细胞，外源基因将随宿主的繁殖而复制，这种过程称为基因的克隆。 凝胶电泳是用于分离、纯化和鉴定DNA片段最常规的实验技术。可依据DNA分子的大小来使其分离。还可以利用DNA杂交技术直接鉴定带有重组质粒的细菌克隆。 利用载体法或基因直接转移等技术将外源目的基因转入合适的宿主细胞中进行表达，获得所需表达产物或所需性状。用Southern杂交对转基因生物外源目的基因进行检测分析。1该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。2进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。3在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点
