1、微生物学实验海南大学海洋学院实验一实验一细菌的形态和结构观察细菌的形态和结构观察一、实验目的一、实验目的 观察细菌的菌落特征观察细菌的菌落特征 掌握简单染色法和细菌涂片方法掌握简单染色法和细菌涂片方法 在油镜下观察细菌个体的形态特征在油镜下观察细菌个体的形态特征 形态形态观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。 细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变
2、化。成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。 细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。 细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为形态观察的不同要求，可将染色分为3 3种类型：简单染色、鉴种类型：简单染色、鉴别染色、特殊染色。别染色
3、、特殊染色。二、实验的基本原理二、实验的基本原理二、实验的基本原理二、实验的基本原理 简单染色法原理：细菌在中性的环境中带负电简单染色法原理：细菌在中性的环境中带负电荷，用碱性染料（解离时带正电荷）如美兰、荷，用碱性染料（解离时带正电荷）如美兰、结晶紫等进行染色。结晶紫等进行染色。 采用加热或化学固定两种方法采用加热或化学固定两种方法，使菌体粘附于使菌体粘附于玻片上，并且增加菌体对染料的亲和力玻片上，并且增加菌体对染料的亲和力三、三、 实验材料实验材料 显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。纸、吸水纸等。 0.05% 和和0.1%吕氏碱性
4、美蓝染色液，吕氏碱性美蓝染色液，0.5%番番红染液，中性红染液，二甲苯，生理盐水红染液，中性红染液，二甲苯，生理盐水 细菌三种形态的染色标本。细菌三种形态的染色标本。 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，哈氏弧菌和无乳大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，哈氏弧菌和无乳链球菌链球菌24h24h液体培养基培养物液体培养基培养物 盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。 简单染色法（一般染色法）简单染色法（一般染色法） .菌种：菌种：牙垢细菌牙垢细菌 .涂片涂片 .干燥：干燥：自然气干或酒精灯自然气干或酒精灯高处微微加热。高处微微加热。 固定固定 .染色：染色：在整个涂面上滴加在整个涂面上滴加齐
5、氏石炭酸复红，染色分齐氏石炭酸复红，染色分钟钟 。 .水洗：水洗：倾去染液，用自来倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。染料颜色为止。 干燥：干燥：空气中自然干燥。空气中自然干燥。 镜检：镜检：在油镜下观察牙垢在油镜下观察牙垢中的各种细菌形态并绘图。中的各种细菌形态并绘图。四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤 油镜的使用油镜的使用 1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察依次再进行中倍、高倍观察 5
6、.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将
7、镜体全部复原。 显微镜保养和使用中的注意事项：显微镜保养和使用中的注意事项： 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件, ,以免损坏。以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以观察时，两眼睁
8、开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片镜片。四、实验步骤四、实验步骤 细菌三种基本形态的观察：细菌三种基本形态的观察： 菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指个体形态的观察。个体形态的观察。 1. 结合油镜的使用，观察三张
9、细菌染色片（球结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。 2. 看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。四、实验步骤四、实验步骤思思 考考 题题 油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？应特别注意些什么？ 使用油镜时，为什么必须用镜头油？使用油镜时，为什么必须用镜头油？ 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？而不是直接用高倍镜或油镜观察？实验二实验二细菌的革兰氏染色细
10、菌的革兰氏染色一、实验目的一、实验目的 掌握细菌的革兰氏染色掌握细菌的革兰氏染色 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 观察和识别细菌细胞的特殊构造观察和识别细菌细胞的特殊构造 细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对革兰氏染色细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对革兰氏染色有不同的反应（阳性和阴性）：有不同的反应（阳性和阴性）： 革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度低，当以低，当以95%95%酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞壁空隙变酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞
11、壁空隙变大，肽聚糖因大，肽聚糖因95%95%酒精处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量酒精处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被合物被95%95%酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成红色；红色； 革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，脂类含量少，经革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，脂类含量少，经95%95%酒精脱色处理后，肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，使得酒精脱色处理后，肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫
12、与碘形成的紫色染料复合物很难被结晶紫与碘形成的紫色染料复合物很难被95%95%酒精洗脱出细胞壁酒精洗脱出细胞壁之外，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现紫色。之外，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现紫色。二、实验的基本原理二、实验的基本原理 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，双层瓶，擦镜纸，生理盐水，吸水纸，染色缸等。双层瓶，擦镜纸，生理盐水，吸水纸，染色缸等。 染色剂：草酸铵结晶紫染色液，卢（路）哥氏染色剂：草酸铵结晶紫染色液，卢（路）哥氏( (LugolLugol) )碘液，碘液，95%95%乙醇，乙醇，0.5%0.5%番红染色液。番
13、红染色液。 菌种：哈氏弧菌和鳗弧菌菌种：哈氏弧菌和鳗弧菌24h24h普通海水琼脂斜面普通海水琼脂斜面2828培培养物，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌养物，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌24h24h牛肉膏琼脂斜面牛肉膏琼脂斜面2828培养物。培养物。三、实验材料三、实验材料 革兰氏（革兰氏（Gram）染色法）染色法 1. 涂片涂片 2. 初染：初染：在做好的涂面上滴加在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染草酸铵结晶紫染液，染1分钟，分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：媒染：先用新配的路哥氏碘先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂液冲去残水，而后用其覆盖涂面面1分
14、钟，后水洗。分钟，后水洗。 4. 脱色：脱色：除去残水后，滴加除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约酒精进行脱色约30秒，后秒，后立即用流水冲洗。立即用流水冲洗。 5. 复染：复染：滴加番红染色液，染滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：镜检：观察染色结果并绘图。观察染色结果并绘图。四、实验步骤四、实验步骤思考题思考题 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？哪些操作？关键在哪几步？为什么？实验三实验三实验室环境及人体表面的实验室环境及人体表面的微生物检查微生物检查 认识细菌分布的广泛性；
15、认识细菌分布的广泛性； 掌握对菌落识别；掌握对菌落识别； 懂得无菌操作的重要性。懂得无菌操作的重要性。一、实验目的一、实验目的 每一菌体在适宜每一菌体在适宜条件下，条件下，经过多次细胞分裂可形成一个肉经过多次细胞分裂可形成一个肉眼可见的子细胞集合体，称为菌落。眼可见的子细胞集合体，称为菌落。 由于不同细菌其个体的形态、结构、生理和生化等特征不由于不同细菌其个体的形态、结构、生理和生化等特征不同，当一个菌体经分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈现同，当一个菌体经分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈现其固有的特点。其固有的特点。 通过合适的方法，将自然环境中的微生物接种到平板培养通过合适的方法，将自然环境
16、中的微生物接种到平板培养基上，经过培养后观察平板上的菌落，就可以检查环境中基上，经过培养后观察平板上的菌落，就可以检查环境中及人体细菌的数量和类型。及人体细菌的数量和类型。二、实验的基本原理二、实验的基本原理 无菌试管，无菌吸管，无菌空培养皿，细菌计数器，无菌试管，无菌吸管，无菌空培养皿，细菌计数器，蜡笔，玻片，消毒牙签，酒精灯，接种环，无菌棉拭蜡笔，玻片，消毒牙签，酒精灯，接种环，无菌棉拭子等。子等。 琼脂平板培养基，高层琼脂培养基，无菌生理盐水，琼脂平板培养基，高层琼脂培养基，无菌生理盐水，2 2碘酒，碘酒，7575乙醇，普通琼脂平板，血琼脂平板，革乙醇，普通琼脂平板，血琼脂平板，革兰氏染
17、色剂。兰氏染色剂。 水样，泥土，空气和人体。水样，泥土，空气和人体。三、实验材料三、实验材料 1、正常人体的细菌检查 皮肤细菌的检查 （1）将手指在平板上按一下；取一根头发，用无菌镊子贴放在平板上。 （2）平板培养、观察四、实验步骤四、实验步骤 咽部细菌的检查 （1）用无菌棉拭子蘸取咽部分泌的液体，然后将该棉拭子在血琼脂平板一端涂抹，接下来用接种环以涂抹处为起点，在平板上画之字形图案进行分离。 （2）将血琼脂平板置37培养箱中，培养1824h，挑选不同菌落作革兰氏染色，镜检。四、实验步骤四、实验步骤 牙垢中细菌的检查 （1）用消毒牙签剔牙垢少许，置于玻片中央。 （2）加少许生理盐水将牙垢混匀，
18、涂成薄层，用酒精灯干燥固定。 （3）革兰氏染色，镜捡。四、实验步骤四、实验步骤 2、空气中细菌的检查 （1）取4个无菌操作制备的琼脂平板，将3个分别置于实验台、走廊、窗台等位置，并打开皿盖放置1530min后，盖好皿盖；另外1个不打开皿盖作为对照。 （2）将上述4个琼脂平板置37培养箱中培养1824h。四、实验步骤四、实验步骤 3. 水中细菌的检查 （1）十倍梯度稀释 （2）稀释水样与培养基混合倒平板 （3）培养、观察。四、实验步骤四、实验步骤 对各种来源的样品进行对比，如平板菌落数和菌落类型等？ 饭前为何要洗手？ 如何防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面？思考题思考题实实 验验 四四 培养基
19、的配制与灭菌培养基的配制与灭菌一、实验目的一、实验目的 1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 2.掌握培养基和无菌水的制备方法。掌握培养基和无菌水的制备方法。 3.掌握高压蒸气灭菌技术。掌握高压蒸气灭菌技术。 培养基是用人工的办法将多种营养物培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元
20、素元素外外还应具有适宜的酸碱度还应具有适宜的酸碱度pH值值、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。 二、实验的基本原理二、实验的基本原理(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10NaOH溶液、溶液、l0盐酸溶液、琼脂、盐酸溶液、琼脂、水水(2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花。试纸、试管、分装漏斗、棉花。高压高压蒸气灭菌锅、烘箱。蒸气灭菌锅、烘箱。三、实验材料三、实验材料 一、玻璃器皿的洗涤和包装一、玻璃器皿
21、的洗涤和包装 清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。 棉塞的制作棉塞的制作 包装培养皿和移液管等包装培养皿和移液管等。 2-1棉塞制作方法2-2移液管灭菌前的包装四、实验步骤四、实验步骤二、培养基的配制二、培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）（一）培养基配方：培养基配方： 牛肉膏牛肉膏2.5g 蛋白胨蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、琼脂、琼脂10.0g、自来水、自来水500mL、pH7.27.4。 （二）（二）操作步骤：操作步骤： 1. 取一个取一个1000mL烧杯，装烧杯，装500mL蒸馏水。蒸馏水。 2
22、. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。解。注意：注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。适当补充因蒸发而损失的水量。 3. 调调pH值：用值：用10 NaOH调调pH至至7.27.4，用精密，用精密pH试纸试纸对照。对照。 4.过滤过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱层纱布趁热
23、过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。，该步可省略。 5. 分装：将培养基分装于分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入支试管，其余全部倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。锥形瓶中，分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染沾在管口或瓶口上面造成污染(见图见图23)。分装量：固体。分装量：固体培养基约为试管高度的培养基约为试管高度的15，灭菌后制成斜面（图，灭菌后制成斜面（图24）。分装入锥形瓶内以不超过其容积的。分装入锥形瓶内以不超过其容积的3/53/5为宜。半固体培为
24、宜。半固体培养基以试管高度的养基以试管高度的1/3为宜灭菌后垂直待凝。为宜灭菌后垂直待凝。注意不要注意不要污染棉塞和瓶口污染棉塞和瓶口。 6. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。 7. 灭菌备用：灭菌条件：灭菌备用：灭菌条件：1210C（相当蒸汽压力（相当蒸汽压力0.103MPa）培养基灭菌后必须在）培养基灭菌后必须在37下恒温培养下恒温培养24h，确定无菌生，确定无菌生长，方可使用。长，方可使用。图 例图23培养基分装 图24 斜面制作 三、稀释水的制备三、稀释水的制备 1.取一个取一个250mL的锥形瓶装的锥形瓶装90(或或99)mL蒸馏水，放蒸馏水，
25、放30颗玻璃珠颗玻璃珠(用于打破活性污用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒泥、菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。塞、包扎，待灭菌。 2.另取另取5支支18mm180mm的试管，分别装的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。的材料。 四、灭菌四、灭菌 加热灭菌有加热灭菌有干热灭菌干热灭菌和和湿热灭菌湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温
26、度将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至调节至160并维持并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到度降到50左右，才能将物品取出。左右，才能将物品取出。湿热灭菌：高压蒸气灭菌法湿热灭菌：高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 注意：器物不能装得太满。注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排除高
27、压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为温度计指示温度为100时关闭排气阀；或当排出时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。 5. 当压力达当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为灭菌器内的温度为121)即开始灭菌，使其维持即开始灭菌，使其维持1530min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2) ，延长时间。，延长时间。 6. 灭菌时间一到，切断电源，灭菌时间一到，切断电源，待压力降至待压力降至零时零时，才能打
28、开排气阀，然后打开灭菌器，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。盖，取出物品，排出锅内剩余水。 7. 待培养基冷却后置于待培养基冷却后置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。备用。间歇灭菌法：间歇灭菌法： 即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。 操作方法：操作方法： a. 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，次，每次在每次在100煮沸煮沸3060min，连续，连续3d重复进行。重复进行。 b. 在
29、每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，这样可以使每次蒸煮后未杀死残，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。 c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在在 37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。，确定无菌才能使用。 过滤除菌法：过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。细菌过滤器
30、进行除菌。用于除菌的滤器：a.蔡氏滤器，b.注射器装置滤器 1.配制培养基有哪几个步骤配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注在操作过程中应注意些什么问题意些什么问题?为什么为什么? 2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培 养基进行无菌检查？养基进行无菌检查？ 3.3.高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖锅内蒸汽才能打开锅盖? 思考题思考题实验五
31、实验五 细菌纯种分离、培养和接种技术细菌纯种分离、培养和接种技术 1.掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。而获得若干种细菌纯培养技能。 2.掌握几种接种技术。掌握几种接种技术。一、实验目的一、实验目的 无菌培养皿无菌培养皿(直径直径90mm)10套、无菌移液套、无菌移液管管1mL2支、支、10mL1支。支。 营养琼脂培养基营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或瓶，活性污泥或土壤或湖水湖水1瓶，无菌稀释水瓶，无菌稀释水90mL1瓶、瓶、9mL5管。管。 其它：接种
32、环、酒精灯、恒温箱。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。二、二、实验材料实验材料一、细菌的纯种分离一、细菌的纯种分离 三三、实验步骤、实验步骤(一一)稀释平板法稀释平板法 1. 取样取样 用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。 2. 稀释水样稀释水样 将将1瓶瓶90mL和和5管管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上无菌水排列好，用记号笔依次编上101、 102、103、104、105、106。在无菌操作条件下。在无菌操作条件下，用，用10mL的无菌移液管吸取的无菌移液管吸取10mL水样水样(或其它样品或其它样品)加入加入编号为编号为101
33、无菌水无菌水(内含玻璃珠内含玻璃珠)中，将移液管吹洗三次，中，将移液管吹洗三次，用手摇用手摇10min将颗粒状样品打散。即为将颗粒状样品打散。即为101浓度的菌液。浓度的菌液。用用1mL无菌移液管吸取无菌移液管吸取1mL 101浓度的菌液于编号为浓度的菌液于编号为102无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为102浓度菌液。浓度菌液。同样方法，依次稀释到同样方法，依次稀释到106 。稀释液的制备稀释液的制备10mL试样 90mL蒸馏水 3. 平板的制作平板的制作 取取10套无菌培养皿编号，套无菌培养皿编号， 104、105、106各各3个，另一个个，另一个为空气
34、对照。为空气对照。 取取1支支1mL无菌移液管从无菌移液管从浓度小的菌液浓度小的菌液开始，以开始，以106、105、104为序分别吸取为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。 加热培养基，当其冷至加热培养基，当其冷至45左左右时，右手拿装有培养基的锥形右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养
35、皿平掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置分混匀，冷凝后即成平板，倒置于于30培养培养2448h，然后观察，然后观察结果。结果。 a:皿法皿法 b:倒平倒平板板 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖盖10min后盖上，倒置于后盖上，倒置于30培养培养2448h，然后，然后观察结果。观察结果。 1. 平板制作：平板制作：将融化并冷至约将融化并冷至约50的肉膏蛋白的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平胨琼脂培养基
36、倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。板。 2. 划线：划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线，在平板上轻轻划线(切勿划破培养基切勿划破培养基)。划线。划线完毕盖好皿盖，完毕盖好皿盖，30培养培养2448h后观察结果后观察结果。平板划线分离的划线方法 左：连续划线法（1，2依次划线的起点）右：分区划线法（1，2，3
37、，4依次划线的起点） 接种方法：常用的有接种方法：常用的有斜面接种法斜面接种法、平板接种法平板接种法、液体接种法液体接种法、试管深层固体培养基的试管深层固体培养基的穿刺接种法穿刺接种法。 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。铲或接种锄、玻璃涂棒等。 左手平托两支试管，拇指压住两支试管左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面斜面(两支试管的斜面同时向上两支试管的斜面同时向上) 。右手将。右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。棉塞旋松
38、，以便在接种时容易拔出。 右手拿接种环，在火焰上先将右手拿接种环，在火焰上先将环端环端烧红烧红灭菌，然后灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔出，塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中棉塞仍夹在手中，然后，然后让试管口缓缓过火焰。让试管口缓缓过火焰。123 将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却先冷却，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸而后再用环挑取少许菌种
39、，将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线由底部向上划线。抽。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。次烧红接种环，则接种完毕。456781.液体接种法液体接种法(从斜面菌种接入培养液从斜面菌种接入培养液)：用：用接种环接种环挑取斜面菌挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培
40、养液中均匀分布。最后将接种环管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。烧红灭菌。2.穿刺接种法穿刺接种法(从斜面菌种接入从斜面菌种接入(半半)固体培养基固体培养基)：用：用接种针接种针经火经火焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完毕。灭菌，则接种完毕。1.稀释样品：方法同稀释平板分离法稀释样品：方法同稀释平板分离法2.倒平板：将融化并冷至倒平板：将融化并冷至50左右的培养基倒入无菌培养皿中，左
41、右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板冷凝后即成平板3.用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀4.将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培养将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。（四）液体培养基中的菌种接入液体（四）液体培养基中的菌种接入液体培养基培养基 接种工具：无菌移液管和无菌滴管接种工具：无菌移液管和无菌滴管 移液
42、管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌 用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接 到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。 1. 斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培养基上沾一下？种针在无菌培养基上沾一下？ 2.2.用一根无菌移液管接种几种浓度的水样用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？时，应从哪个浓度开始？为什么？思考题思考题实验六实验六 微生物细胞的计数微生物细胞的计数 1. 1.了解血球计数板的结构及计数
43、了解血球计数板的结构及计数原理。原理。 2 2、掌握使用血球计数板进行微、掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。生物计数的方法。 一、实验目的一、实验目的 测定微生物数量方法很多，通常采用的有测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计显微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。数法。 显微镜直接计数法显微镜直接计数法 将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计具有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计数板，于显微镜下直接计数的一种简便、快速数板，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方
44、法。、直观的方法。二、实验的基本原理二、实验的基本原理血球计数板的构造血球计数板的构造血球计数板的计算方法血球计数板的计算方法 血球计数板上刻有一长宽各为血球计数板上刻有一长宽各为1 1毫米的方形大格，毫米的方形大格，其体积为其体积为0.1mm0.1mm3 3。计数板有两种刻度，一种是每大格。计数板有两种刻度，一种是每大格分为分为1616个中格，而每中格又分个中格，而每中格又分2525个小格，每大格为个小格，每大格为16162525小格小格=400=400小格，而另一种，则是每大格分为小格，而另一种，则是每大格分为2525个中格，而每中格又分为个中格，而每中格又分为1616个小格，则每大格为个
45、小格，则每大格为252516=40016=400小格（计数板上的标识为小格（计数板上的标识为XBXBK25K25） 计数时，如果使用计数时，如果使用16格格25格规格的计数室，要按格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即个中格（即100个小格）的酵母菌数。如果使用个小格）的酵母菌数。如果使用25 格格 16格规格格规格的计数室除了取其的计数室除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个对角方位外，还需再数中央的一个 中 格个 中 格 ( 即即 8 0 个 小 方 格个 小 方 格 ) 的 酵 母 菌 数 。的 酵 母 菌 数 。(6)当
46、遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的上方和左方线上的酵母细胞的上方和左方线上的酵母细胞(或只计数下方和右方线或只计数下方和右方线上的酵母细胞上的酵母细胞)。计数公式计数公式 (1)1625的血球计数板计算公式：的血球计数板计算公式： 酵母细胞数酵母细胞数ml=（100小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数 100）40010000稀释倍数稀释倍数 (2)25x16的血球计数板计算公式：的血球计数板计算公式： 酵母细胞数酵母细胞数ml=（80小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数80）40010000稀释倍数稀释倍数三、实验器材三、实验器材 显微镜
47、、血球计数板、酵母菌液、盖玻显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻片、吸管、吸水纸。片、吸管、吸水纸。操作步骤操作步骤1. 1. 镜检计数室镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能才能 进行计数。进行计数。2. 2. 加样品加样品 在血球计数板上盖上盖玻片在血球计数板上盖上盖玻片, , 用滴管用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴, ,菌液会菌液会自动进入计数室，静置自动进入计数室，静置5 5分钟。分钟。3. 3. 计数计数 将血球计数板置于载物台上，先用低
48、倍将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。 2525个中格的个中格的取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复计计2-32-3次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中菌体的个数。菌体的个数。4.4.清洗血球计数板清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。须重复洗涤干净为止。结果记录结果记录 第一个
49、第一个中格中格第二个第二个中格中格第三个第三个中格中格第四个第四个中格中格第五个第五个中格中格第一次第一次测测 定定第二次第二次测测 定定第三次第三次测测 定定平平 均均 1. 1.使用血球计数板应注意什么问题使用血球计数板应注意什么问题? ? 2. 2.试分析影响本实验结果的误差来源并提出试分析影响本实验结果的误差来源并提出改进措施改进措施思考题思考题实验七实验七 大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定 1. 1.了解大肠杆菌的生长曲线特征了解大肠杆菌的生长曲线特征和繁殖规律，并学会绘制生长曲线和繁殖规律，并学会绘制生长曲线； 2. 2. 学习光电比浊法测量细菌数学习光电比浊法测量细菌
50、数量的方法。量的方法。 一、实验目的一、实验目的 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，所绘制的曲线叫生长曲线。它反映了作横坐标，所绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下进行液体培养时单细胞微生物在一定环境条件下进行液体培养时所表现出的群体生长规律。所表现出的群体生长规律。 细菌悬液的浓度与光密度（细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此值）成正比，
