1、细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞术流式细胞术 Western BlotWestern Blot 蛋白质芯片蛋白质芯片. *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪 流式细胞仪流式细胞仪 （Flow CytometerFlow Cytometer，FCM)FCM) 是将流体喷射技术、激光技术、空是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、气技术、射线能谱术及电子计算射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。结合的一种非常先进的检测仪器。通过测量细胞及其他生物颗粒的通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速散射
2、光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以可以对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，并能同时高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等有速度快、精度高、准确性好等特点。特点。 流式细胞仪流式细胞仪. *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪工作原理工作原理 流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每
3、个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。 如左图所示。. *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪流式细流式细胞仪胞仪流动室和流动室和 液流系统液流系统 激光源和激光源和 光学系统光学系统 光电管和光电管和检测系统检测系统 计算机和计算机和 分析系统分析系统 结构组成：结构组成：除以下四个主要部分除以下四个主要部分外，还备有电源及压外，还备有电源及压缩气体等附加装置。缩气体等附加装置。 .
4、*细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪流动室和液流系统流动室和液流系统 流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。 液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱. *. *. *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪
5、光电管和检测系统光电管和检测系统. *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪光电管和检测系统光电管和检测系统 经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装
6、位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。 从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。 . *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪计算机和分析系统计算机和分析系统 经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出
7、来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的68个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。细胞分选系统细胞分选系统. *Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector流式细胞计的分选分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割
8、成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。 . *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪 数据处理原理数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。 数据显示：数据显示：FCM的数据显示方式包括单参数直方图、二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。 X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y
9、轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率单参数直方图（单参数直方图（HistogramHistogram）. *二二维维等等高高图图3D Plot Dot Plot. *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪优优 点：点：v1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。v2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。v3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋
10、亡峰 ，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。 . *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪应应 用：用：v目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应用。v细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体,等等。. *细胞生物学技术细胞生物学技术 流式细胞仪流式细胞仪 例如例如流式细胞仪检测细流式细胞仪检测细胞凋亡胞凋亡Annexin V/PIAnnexin V/PI双染色法双染色法 Annexin V/PI标记染色：取500u1心肌缓冲液，轻轻混匀细胞后加5
11、ul FITC一Amexin V和5ul PI试剂，置冰浴10min后，流式细胞仪(光源为488nm氨离子激光，预先用Flow-Check调整光路)计数104 以上的细胞，用FITC/PI双色分析程序测得心肌凋亡细胞(Annexin V/PI)的百分率。 双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞. *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western BlotWestern Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相
12、载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 原原 理理. *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western BlotWestern blot Western blot 步骤示意图步骤示意图步骤步骤. *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot一、蛋白样品的提取一、蛋白样品的提取p通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶
13、液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋 白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。p有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。p通过层析或电洗脱法制备目的蛋白. *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot蛋白样品的定量蛋白样品的定量1.1.双缩脲法：双缩脲法：在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L10g/L含量的蛋白质溶液测定。
14、干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，可用沉淀法除去干扰物。2.Lowry2.Lowry法：法：第一步Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。 3 3电泳估算法电泳估算法: :样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度 . *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot4.4.紫外吸收法：紫外吸收法：大多数蛋白质
15、在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.10.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正 。5. Bradford5. Bradford比色法比色法: :Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。蛋白样品的定量蛋白样品的定量. *
16、细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot二、二、SDS-SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSSDSPAGEPAGE） . *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot三、样品的印记三、样品的印记-转膜转膜半干转移法半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 | |纸纸| |胶胶| |膜膜| |纸纸| |槽式湿转法槽式湿转法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。 | |海绵海绵| |纸纸| |胶胶| |膜
17、膜| |纸纸| |海绵海绵| |半干转移法半干转移法湿转法湿转法. *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot四、封四、封 闭闭将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的蛋白质结合。目的是使抗体与特异的蛋白质结合。p封闭液：封闭液：5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液 Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。p摇床上缓慢摇动封闭，室温2 h或4过夜。. *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot五、一
18、抗、二抗孵育与洗膜五、一抗、二抗孵育与洗膜l把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。l回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。l加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 l回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。l最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。. *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot六、反应显色六、反应显色重组蛋白一般用重组蛋白一般用APAP显色或是显色或是DABDAB显色，裂解液一般用发光法显色，裂解液一般用发光法 辣根
19、过氧化物酶法（辣根过氧化物酶法（HRPHRP）：）：HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。碱性磷酸酶法（碱性磷酸酶法（APAP）：）：AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66lNBT溶液和33l BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。 1.1. 3.3.化学发光显色法化学发光显色法(HRP)(HRP)：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜
20、表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱要控制好时间）。 . *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot七、结果分析七、结果分析目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。. *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blotv它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。 v具有从混杂抗原中检测
21、出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。v被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。优优 点点. *细胞生物学技术细胞生物学技术 Western Blot应应 用用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白目的蛋白与其它蛋白 的互作的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析目的蛋白的表达量分析. *细胞生物学技术细胞生物学技术 蛋白质芯片蛋白质芯片中文名称：中文名称：蛋白质芯片 英文名称：英文名称：protein chip 其他名称：其他名称：
22、蛋白质微阵列(protein microarray) 蛋白质芯片是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列。又称蛋白质微阵列(Protein miogrorray)，最早是在生物功能基因组学研究中继基因芯片之后，作为基因芯片功能的补充发展起来的。是在一个基因芯片大小的载体上，按使用目的的不同，点布相同或不同种类的蛋白质，然后再用标记了荧光染料的蛋白质结合，扫描仪上读出荧光强弱，计算机分析出样本结果。简简 介介. *细胞生物学技术细胞生物学技术 蛋白质芯片蛋白质芯片Pro Pro 芯片原理芯片原理蛋白芯片技术的研究对象是蛋白质，其原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上(
23、如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持。. *细胞生物学技术细胞生物学技术 蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质微阵列蛋白质微阵列 微孔板蛋白芯片微孔板蛋白芯片 三维凝胶块芯片三维凝胶块芯片分分 类类. *细胞生物学技术细胞生物学技术 蛋白质芯片蛋白质芯片Pro Pro 芯片的具体制备方法芯片的具体制
24、备方法1.固相载体及其处理固相载体及其处理 载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片） 2.蛋白质的预处理蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解3.点制微阵列点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等4.固定微阵列上的蛋白样点固定微阵列上的蛋白样点 膜为载体：芯片放入湿盒，膜为载体：芯片放入湿盒， 37C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白5.微阵列的封闭微阵列的封闭 主要封闭试剂：主要封闭试剂：B
25、SA（牛血清白蛋白）或（牛血清白蛋白）或Gly（甘氨（甘氨 酸）酸）. *细胞生物学技术细胞生物学技术 蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片的检测法蛋白质芯片的检测法1. 1. 探针标记检测法（探针标记检测法（S S）2. 2. 无探针标记检测法无探针标记检测法3. 3. 动态分析检测法（动态分析检测法（S S）. *细胞生物学技术细胞生物学技术 蛋白质芯片蛋白质芯片p 同位素标记检测同位素标记检测p 荧光标记检测荧光标记检测p 化学发光检测化学发光检测p 酶免疫标记检测酶免疫标记检测p 胶体金标记检测胶体金标记检测1. 1. 探针标记检测法（探针标记检测法（S S）. *细胞生物学技术细胞生物学技
26、术 蛋白质芯片蛋白质芯片2. 2. 无探针标记检测法无探针标记检测法p表面增强激光解吸离子化技术表面增强激光解吸离子化技术(Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI)p表面等离子体共振检测技术表面等离子体共振检测技术（surface plasmon resonance, SPR）p原子力显微镜检测技术原子力显微镜检测技术（atomic force microscope, AFM ）. *细胞生物学技术细胞生物学技术 蛋白质芯片蛋白质芯片表面等离子共振生物传感器（表面等离子共振生物传感器（surface plasmon resonan
27、cesurface plasmon resonance，SPRSPR）检）检测法。测法。SPRSPR检测法的原理：利用表面等离子共振现象监测传感片表面介质的检测法的原理：利用表面等离子共振现象监测传感片表面介质的折射率变化，而这一变化仅和传感片表面结合的生物大分子的量成正折射率变化，而这一变化仅和传感片表面结合的生物大分子的量成正比，溶液中的分子不会干扰。比，溶液中的分子不会干扰。SPRSPR现在已经成为一个比较成熟的多方面研究受体现在已经成为一个比较成熟的多方面研究受体- -配基相互作用动力配基相互作用动力学的检测工具。例如，学的检测工具。例如，SapsfordSapsford等发展了一个抗
28、体芯片的生物传感器等发展了一个抗体芯片的生物传感器去研究抗体作用的动力学。去研究抗体作用的动力学。3. 3. 动态分析检测法（动态分析检测法（S S）. *细胞生物学技术细胞生物学技术 蛋白质芯片蛋白质芯片v1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 v2. 同时快速发现多个生物标记物 v3. 小量样品 (as few as 2000 cells for LCM samples) v4. 高通量的验证能力（with 1000s of samples a month） v5. 发现低丰度蛋白质 v6. 测定疏水蛋白质: 与“双相电泳加飞行质谱”相比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白质
29、 v7. 在同一系统中集发现和检测为一体，特异性高。利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。 v8.可以定量 利用单克隆抗体芯片，由于结合至芯片上的抗体是定量的，故可以测定抗原量，但一般飞行质谱不用于定量分析。 v9.功能广 I. 利用单克隆抗体芯片, 可替代 Western Blot。 II. 利用单克隆抗体芯片, 可互补流式细胞仪不足的功能，如将细胞溶解，可测定细胞内的抗原, 而且灵敏度远高于流式细胞仪。优优 点点. *细胞生物学技术细胞生物学技术 蛋白质芯片蛋白质芯片1 1、用于蛋白质、用于蛋白质- -蛋白质、蛋白质蛋白质、蛋白质- -核酸、蛋白质核酸、
30、蛋白质- -脂类等相互作用研究；特异性蛋白质的脂类等相互作用研究；特异性蛋白质的筛选；功能蛋白质组研究。筛选；功能蛋白质组研究。 （S S）例如，应用酵母蛋白质芯片进行钙调蛋白的研究；应用磷脂酰肌醇来筛选磷脂酰肌醇的结合蛋白。（S）2、用于基因表达的筛选、用于基因表达的筛选AngelikaL等实验表明：从人胎儿脑的cDNA文库中选出92个克隆的粗提物制成蛋白质芯片、特异性的抗体对其进行检测、蛋白质芯片技术在同样面积上可容纳更多的克隆，灵敏度可达到pg级。3、用于特异性抗原抗体的检测、用于特异性抗原抗体的检测 免疫分析微缩到芯片上进行，使免疫检测更加方便快捷4、用于蛋白质的筛选及功能研究、用于蛋白质的筛选及功能研究 可以用蛋白质芯片来研究酶的底物、激活剂、抑制剂等。5、生化反应的检测、生化反应的检测 测定酶的活性、定量酶促反应 应用应用. *0808生技生技 孙晓晴孙晓晴. *
