1、HLAHLA分型技术分型技术Variation 1% at a single genetic locus in a population of individualsEach polymorphic variant is called an alleleIn the human population, over 1,695 MHC alleles have been identifieda babab3559231263481DRDPDQClass II851506276ABCNo ofpolymorphismsClass IData from http:/www.ebi.ac.uk/imgt
2、/hla July 2007Polymorphism in the MHCPolymorphic residues are located in the antigen-binding groove Variation in amino acid sequences changes the shape of the grooveHLAHLA分型概述分型概述v方法比较方法比较 血清学分型血清学分型 细胞学分型细胞学分型 基因分型基因分型 PCR-RFLPPCR-RFLP PCR-SSCP PCR-SSCP PCR-SSO PCR-SSO PCR-SSP PCR-SSPv 应用应用 移植配型移植配
3、型 疾病相关性研究疾病相关性研究 法医学法医学PCR-SSP检测检测HLA-B27 一、实验目的一、实验目的 掌握掌握HLAHLA基因分型的原理，学习基因分型的原理，学习PCR-SSPPCR-SSP基因分型基因分型方法。方法。二、实验原理二、实验原理 编码编码HLAHLA的基因具有高度的多态性，每一个基因的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的其各自的DNADNA序列，因此可用相应的序列特异性引物序列，因此可用相应的序列特异性引物（ sequence specific primers ，SSP）进行扩
4、增。通）进行扩增。通过控制过控制PCRPCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。等位基因，而不扩增其他的等位基因。 Every HLA allele has its own unique sequencesSpecific sequence primer (SSP) is designed to bind to the allelic sequences complementarily Sequence specific primer is used to type HLA allele with PCRSequence s
5、pecific primer is used to type HLA allele with PCR三、实验材料和方法三、实验材料和方法 1 1、血样：、血样：0.2 ml EDTA 0.2 ml EDTA 抗凝血抗凝血 2 2、红细胞裂解液、红细胞裂解液 3 3、白细胞裂解液、白细胞裂解液 4 4、PCR PCR 混合液混合液PCR buffer HLA-B27 SSPTaqdNTPinternal positive reference primersHLA-B27HLA-B27检测操作流程检测操作流程一、一、DNADNA的提取的提取1 1、取、取1ml 1ml RBCRBC裂解液入血样管中
6、混匀，裂解裂解液入血样管中混匀，裂解RBC;RBC;2 2、离心、离心4000rpm4000rpm1min;1min;3 3、重复步骤、重复步骤1-21-2两次，最后用棉签吸干管壁液体；两次，最后用棉签吸干管壁液体；4 4、取、取40ul40ul白细胞裂解液白细胞裂解液（SDS, ProteinaseSDS, Proteinase K) K)入上述入上述 WBC WBC管中混匀；管中混匀；5 5、将、将WBCWBC管于管于6060o oC C水浴消化水浴消化20min20min；6 6、取出、取出WBCWBC管再于管再于100100o oC C，3-5min3-5min，灭活蛋白酶，灭活蛋白酶
7、K K；7 7、离心、离心1000010000rpmrpm2min2min。上清即为富含。上清即为富含DNADNA的的PCRPCR模板。模板。二、二、PCRPCR扩增扩增1 1、吸、吸2ul2ul模板模板DNADNA入装有入装有PCRPCR混合液的小管中（注意不要加混合液的小管中（注意不要加到石蜡油层）；到石蜡油层）；2 2、将小管置于、将小管置于PCRPCR仪内进行扩增。（需仪内进行扩增。（需80min80min） 12 23 预变性：预变性：94 oC 2min 变性：变性：94 oC 20sec 复性：复性：67 oC 30sec 延伸延伸：72 oC 30sec 变性变性：94 oC 20sec 复性：复性：60 oC 30sec 延伸延伸：72 oC 30sec HLA-B27HLA-B27扩增程序扩增程序三、电泳检测三、电泳检测 吸吸PCRPCR产物产物10ul10ul加到加到2%2%琼脂糖凝胶孔内；琼脂糖凝胶孔内； 将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳160V160V20min20min后取后取 出，观察结果。出，观察结果。四、结果观察四、结果观察 Specific bands can be seen with HLA-B27(+) samples
