1、佛山科学技术学院佛山科学技术学院 唐冬生唐冬生广东医学院广东医学院 黄迪南黄迪南第六章第六章 DNADNA重组技术重组技术 DNADNA重组重组（DNA recombinationDNA recombination） 不同来源的不同来源的DNADNA，通过磷酸二酯键连接而重，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的新组合成新的DNADNA分子的过程。分子的过程。 DNA DNA克隆克隆（DNA cloneDNA clone） 在体外对在体外对DNADNA分子进行重组，构建成具有自主分子进行重组，构建成具有自主复制能力的重组复制能力的重组DNADNA分子，再导入宿主细胞进分子，再导入宿主细胞进行大量扩
2、增，最终获得大量同一的行大量扩增，最终获得大量同一的DNADNA分子分子 亦称亦称分子克隆分子克隆或或DNADNA重组技术重组技术第六章第六章 DNADNA重组技术重组技术第六章第六章 DNADNA重组技术重组技术第二节第二节 常用载体常用载体第三节第三节 DNADNA重组与鉴定重组与鉴定第一节第一节 常用的工具酶常用的工具酶第一节第一节 常用的工具酶常用的工具酶 工具酶工具酶： DNADNA重组技术，需要利用一些酶在体外对重组技术，需要利用一些酶在体外对DNADNA进行切割、连接等基因操作，这些酶常被进行切割、连接等基因操作，这些酶常被称为工具酶。称为工具酶。 主要主要的的工具酶工具酶: 限
3、制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNADNA连接酶连接酶 逆转录酶逆转录酶 DNADNA聚合酶聚合酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶第一节第一节 常用的工具酶常用的工具酶第一节第一节 常用的工具酶常用的工具酶二、二、DNADNA连接酶连接酶三、分子克隆中常用的其他酶三、分子克隆中常用的其他酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶 简称限制酶，是简称限制酶，是DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具 识别和切割双链识别和切割双链DNADNA分子特异序列的核酸水解酶分子特异序列的核酸水解酶一、限制性内切酶一、限
4、制性内切酶 （二）命名（二）命名 （三）三）类限制性核酸内切酶识别序列特点类限制性核酸内切酶识别序列特点 （四）限制性内切酶的应用四）限制性内切酶的应用 （五）限制性内切酶的活力单位和星号活力（五）限制性内切酶的活力单位和星号活力 （六）甲基化酶（六）甲基化酶 （一）分类（一）分类 （一）分类（一）分类 根据酶的分子组成及裂解方式的不同，将限制根据酶的分子组成及裂解方式的不同，将限制性内切酶分为三类：性内切酶分为三类： 1.1.类和类和类类限制性内切酶限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶 兼有修饰作用和依赖于兼有修饰作用和依赖于ATPATP的限制活性的限制活性 在在DNADNA重组技术
5、中并不常用重组技术中并不常用一、限制性内切酶一、限制性内切酶 2. 2.类类限制性内切酶限制性内切酶 能识别并切割特异性的核苷酸序列能识别并切割特异性的核苷酸序列 通常所说的限制性内切酶即指此类通常所说的限制性内切酶即指此类 （二）命名（二）命名 通常由三个斜体字母表示通常由三个斜体字母表示 1.1.第一个大写字母为微生物属名的第一个字母第一个大写字母为微生物属名的第一个字母 2.2.第二、三个小写字母为微生物种名的头两个字母第二、三个小写字母为微生物种名的头两个字母 3.3.如有株名则再加一个字母如有株名则再加一个字母一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶4.4.同
6、一株微生物发现几种限制性内切酶，根据同一株微生物发现几种限制性内切酶，根据 其发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示其发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示 例如例如: : 淀粉液化芽胞杆菌淀粉液化芽胞杆菌 （B Bacillusacillus amamyloliguefaciensyloliguefaciens）H H株株 第第1 1种限制性内切酶，命名为种限制性内切酶，命名为BamBamH H( (三三)类限制性核酸内切酶识别序列特点类限制性核酸内切酶识别序列特点切口切口 ： 平端切口平端切口 - - 平末端平末端 粘端切口粘端切口 - - 粘性末端粘性末端回文结构回文结构一、限制性内切酶一、
7、限制性内切酶Bam Bam HHGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHinHinddGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口一、限制性内切酶一、限制性内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst1.1.同功异源酶：同功异源酶：来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。些酶称同功异源酶。一、限制性内切酶一、限制性内切酶 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATC
8、TAG GATCT A2.2.同尾酶：同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割切割DNADNA后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。一、限制性内切酶一、限制性内切酶（四）限制性内切酶的应用（四）限制性内切酶的应用 主要应用：主要应用： DNADNA重组克隆及亚克隆重组克隆及亚克隆 改造和构建质粒改造和构建质粒 组建基因组组建基因组DNADNA物理图谱物理图谱 基因组基因组DNADNA同源性研究同源性研究 DNADNA杂交杂交 DNADNA序列分析序列分析一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制
9、性内切酶（五）限制性内切酶的活力单位和星号活力（五）限制性内切酶的活力单位和星号活力1.1.酶活力单位酶活力单位2.2.星号活力星号活力3.3.注意事项注意事项 1.1.酶活力单位酶活力单位 在合适温度、在合适温度、pHpH值和离子强度等条件下，值和离子强度等条件下，1 1小小时内完全消化时内完全消化1g1g特异特异DNADNA底物所需的酶量，定义底物所需的酶量，定义为一个活力单位。为一个活力单位。（五）限制性内切酶的活力单位和星号活力（五）限制性内切酶的活力单位和星号活力一、限制性内切酶一、限制性内切酶 2.2.星号活性星号活性 限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序限制性内切酶在非标准反
10、应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加类似的序列，一般在酶的右上角加 “ “* *” ” 表表示示 克隆过程中需同时进行双酶切时，应选用二种克隆过程中需同时进行双酶切时，应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系，否则可能影响酶酶都能接受的反应缓冲体系，否则可能影响酶的特异性的特异性一、限制性内切酶一、限制性内切酶 3.3.注意事项注意事项 底物底物DNADNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚 溶液中不能含溶液中不能含SDSSDS和过量的盐，和过量的盐， EDTAEDTA的含量不的含量不能
11、大于能大于10mmol/L10mmol/L一、限制性内切酶一、限制性内切酶 反应缓冲体系中一般可加入反应缓冲体系中一般可加入2-2-巯基乙醇或二硫巯基乙醇或二硫苏糖醇，防止含巯基酶的氧化失活苏糖醇，防止含巯基酶的氧化失活 加入牛血清白蛋白稳定酶活性加入牛血清白蛋白稳定酶活性 操作时应注意混匀反应体系操作时应注意混匀反应体系一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶2.2.类限制修饰系统类限制修饰系统3.3.甲基化酶的应用甲基化酶的应用( (六六) ) 甲基化酶甲基化酶1.1.细菌的限制修饰系统细菌的限制修饰系统( (六六) ) 甲基化酶甲基化酶1.1.细菌的限制修饰系统细
12、菌的限制修饰系统 限制（降解）外来限制（降解）外来DNADNA，并通过对自身，并通过对自身DNADNA的的修饰而起保护作用。修饰而起保护作用。一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶一、限制性内切酶 2. 2.类限制修饰系统类限制修饰系统 由两种酶分子组成的二元系统由两种酶分子组成的二元系统 一种为限制性内切酶，另一种为甲基化酶一种为限制性内切酶，另一种为甲基化酶 两种酶识别序列相同两种酶识别序列相同 大肠杆菌株一般有大肠杆菌株一般有damdam甲基化酶和甲基化酶和dcmdcm甲基化酶甲基化酶 （PstPst甲基化酶使甲基化酶使A A甲基化形成甲基化形成5-CTGC5-CTGCm mA
13、G-3AG-3）3.3.甲基化酶的应用甲基化酶的应用 当制备克隆用双链当制备克隆用双链cDNAcDNA时，外源时，外源DNADNA片段可用片段可用EcoREcoR 甲基化酶处理，使双链甲基化酶处理，使双链cDNAcDNA内部内部 EcoREcoR 位点因甲基化受到保护而不被切割位点因甲基化受到保护而不被切割 一、限制性内切酶一、限制性内切酶二、二、DNADNA连接酶连接酶 催化双链催化双链DNADNA中相互邻近的中相互邻近的55磷酸末端和磷酸末端和33羟基末端生成磷酸二酯键，从而封闭羟基末端生成磷酸二酯键，从而封闭DNADNA双链中双链中的切口或将二个的切口或将二个DNADNA分子连接起来。分
14、子连接起来。二、二、DNADNA连接酶连接酶 DNADNA连接酶只能作用于双链连接酶只能作用于双链DNADNA分子而不能将二个分子而不能将二个单链单链DNADNA分子连接分子连接 DNADNA连接酶是重要的基因重组的工具酶连接酶是重要的基因重组的工具酶 应用应用DNADNA连接酶将具有相同粘性末端或平端连接酶将具有相同粘性末端或平端的的DNADNA分子连接起来分子连接起来DNADNA连接酶的特点：连接酶的特点： T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶能连接带粘性末端或平末连接酶能连接带粘性末端或平末端的端的DNADNA分子分子 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶不能连接平末端连接酶不能连接
15、平末端 DNADNA分子分子 DNADNA重组技术常用重组技术常用T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶二、二、DNADNA连接酶连接酶 T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接带粘性末端连接酶连接带粘性末端DNADNA分子的效分子的效率远高于连接平末端的率远高于连接平末端的DNADNA分子分子 连接反应需要连接反应需要ATPATP、MgMg2+ 2+ 和二硫苏糖醇，最适和二硫苏糖醇，最适pHpH为为7.27.27.47.4，ATPATP为连接反应提供能量，二硫苏糖醇为连接反应提供能量，二硫苏糖醇可提高连接效率可提高连接效率 二、二、DNADNA连接酶连接酶三、分子克隆中常用的
16、其他酶三、分子克隆中常用的其他酶1.1.逆转录酶逆转录酶2.Taq DNA2.Taq DNA聚合酶聚合酶3.T3.T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶4.4.末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶）末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶）5.5.碱性磷酸酶碱性磷酸酶6.DNA6.DNA聚合酶聚合酶7.Klenow7.Klenow片段（片段（DNADNA聚合酶聚合酶大片段）大片段）三、分子克隆中常用的其他酶三、分子克隆中常用的其他酶1.1.逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板逆转录合成为模板逆转录合成cDNAcDNA2.Taq DNA2.Taq DNA聚合酶聚合酶PCRPCR扩增目的扩增目的DNADNA片段
17、片段DNADNA序列分析序列分析目的目的DNADNA片段片段33端加端加A A，用于，用于A AT T克隆克隆三、分子克隆中常用的其他酶三、分子克隆中常用的其他酶3.T3.T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 l催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸55端羟基磷酸化端羟基磷酸化l标记探针标记探针55端端4.4.末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶）末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶） DNADNA片段片段33端加上同聚物尾端加上同聚物尾 标记标记DNADNA片段片段33端端5.5.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 去除多聚核苷酸去除多聚核苷酸55端磷酸基团端磷酸基团 6.DNA6.DNA聚合酶聚合酶 合成双链合成双链DNAD
18、NA分子分子 缺口平移法，获得高比活性探针缺口平移法，获得高比活性探针 DNADNA序列分析序列分析 补平补平33端端 三、分子克隆中常用的其他酶三、分子克隆中常用的其他酶7.Klenow7.Klenow片段（片段（DNADNA聚合酶聚合酶大片段）大片段） 具有完整的具有完整的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 保留保留3535外切酶活性外切酶活性 无无5353外切酶活性外切酶活性三、分子克隆中常用的其他酶三、分子克隆中常用的其他酶KlenowKlenow片段的主要应用：片段的主要应用： 合成合成cDNAcDNA第二链第二链 补齐双链补齐双链DNADNA分子分子33端或标记端或标记33端端 DN
19、ADNA序列分析序列分析三、分子克隆中常用的其他酶三、分子克隆中常用的其他酶 载体（载体（vectorvector）的概念）的概念 携带靶携带靶DNADNA（目的（目的DNADNA）片段进入宿主细胞进）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。行扩增和表达的运载工具。第二节第二节 常用载体常用载体第二节第二节 常用载体常用载体 常用的载体主要有：常用的载体主要有： 质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等 根据其用途不同分为：根据其用途不同分为： 克隆载体（克隆载体（cloning vectorcloning vector） 表达载体（表达载体（
20、expressing vectorexpressing vector）载体构建和选择的条件：载体构建和选择的条件：1.1.自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基 因组一同复制的能力因组一同复制的能力2.2.合适的限制性酶切位点供外源合适的限制性酶切位点供外源DNADNA片段插入片段插入3.3.分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNADNA 片段并获得较高的拷贝数片段并获得较高的拷贝数第二节第二节 常用载体常用载体第二节第二节 常用载体常用载体4.4.常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营
21、养缺陷型或形成噬菌斑的能力等缺陷型或形成噬菌斑的能力等5.5.配备与宿主相适应的调控元件，如启动配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等子、增强子和前导序列等第二节第二节 常用载体常用载体二、噬菌体载体二、噬菌体载体三、穿梭载体三、穿梭载体四、人工染色体四、人工染色体一、质粒载体一、质粒载体 一、质粒载体一、质粒载体 质粒载体是应用最广的载体质粒载体是应用最广的载体 质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经 人工改造拼接而成人工改造拼接而成 质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚 能继续复制能继续
22、复制理想质粒载体的特点：理想质粒载体的特点： 1.1.松驰型复制子（如松驰型复制子（如ColE1ColE1）复制子（复制子（repliconreplicon）为质粒自我增殖所必需）为质粒自我增殖所必需2.2.几个单一的酶切位点（或多克隆位点）几个单一的酶切位点（或多克隆位点）以便目的以便目的DNADNA片段插入片段插入 一、质粒载体一、质粒载体一、质粒载体一、质粒载体 3. 3.插入失活的筛选标志插入失活的筛选标志 具有两种抗生素抗性标志，如氨苄青霉素抗具有两种抗生素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（性基因（AmpAmpr r）和四环素抗性基因（）和四环素抗性基因（TetTetr r）等。）等。
23、 4.4.分子量相对较小和拷贝数较高分子量相对较小和拷贝数较高 5.5.缺点：容量较小，一般只能接受小于缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb15kb的的DNADNA 一、质粒载体一、质粒载体（一）（一） pBR322pBR322质粒载体质粒载体 （二）（二） pUCpUC质粒载体系列质粒载体系列（一）（一） pBR322pBR322质粒载体质粒载体pBR322pBR322载体是最早被广泛应用克隆的载体之一载体是最早被广泛应用克隆的载体之一 pBR322pBR322载体的组成：载体的组成： 来源于来源于ColE1ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1pMB1的复制起始位点的复制起始位点 来源
24、于来源于pSF2124pSF2124质粒易位子质粒易位子Tn3Tn3的的AmpAmpr r 来源于来源于pSC101pSC101质粒的质粒的TetTetr r 一、质粒载体一、质粒载体pBR322pBR322质粒载体的特点：质粒载体的特点：1.1.带有一个复制起始点（带有一个复制起始点（oriori） 2.2.抗生素抗性基因（抗生素抗性基因（AmpAmpr r和和TetTetr r）作选择标志）作选择标志3.3.数个单一的限制性酶切位点数个单一的限制性酶切位点 一、质粒载体一、质粒载体 4. 4.较小的分子量较小的分子量 易于自身易于自身DNADNA的纯化，而且能有效地克隆的纯化，而且能有效地
25、克隆6kb6kb大小的外源大小的外源DNADNA片段。片段。 5.5.较高的拷贝数较高的拷贝数 每个细胞达每个细胞达1000100030003000个拷贝。个拷贝。 一、质粒载体一、质粒载体 一、质粒载体一、质粒载体rrpBR332质粒结构示意图（二）（二） pUCpUC质粒载体系列质粒载体系列 在在pBR322pBR322基础上改建而成基础上改建而成 一、质粒载体一、质粒载体典型的典型的pUCpUC质粒载体有质粒载体有4 4个组成部分：个组成部分： 来自来自pBR322 pBR322 质粒的质粒的复制起始点复制起始点 AmpAmpr r基因基因 大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基
26、因（LacZLacZ）启动子）启动子及编码及编码-肽链的肽链的DNADNA序列（序列（LacZLacZ基因基因） 多克隆位点多克隆位点（位于（位于LacZLacZ基因中靠近基因中靠近55端）端） 一、质粒载体一、质粒载体pUCpUC系列的优越性系列的优越性最通用的大肠杆菌克隆载体之一最通用的大肠杆菌克隆载体之一优点优点 具有更小的分子量和更高的拷贝数具有更小的分子量和更高的拷贝数 仅保留了仅保留了pBR322pBR322的复制子和的复制子和AmpAmpr r 具有来自大肠杆菌具有来自大肠杆菌LacZLacZ操纵子的操纵子的LacZLacZ基因，基因，适应于组织化学筛选重组体适应于组织化学筛选重
27、组体 一、质粒载体一、质粒载体 一、质粒载体一、质粒载体rpUC18/pUC19质粒载体结构质粒载体结构二、噬菌体载体二、噬菌体载体 噬菌体载体噬菌体载体 粘粒载体称柯斯质粒（粘粒载体称柯斯质粒（cosmidcosmid） 单链丝状噬菌体载体单链丝状噬菌体载体 二、噬菌体载体二、噬菌体载体gt10（插入型）结构（插入型）结构二、噬菌体载体二、噬菌体载体Charon 40（替换型）结构（替换型）结构二、噬菌体载体二、噬菌体载体r粘粒载体粘粒载体pJB8结构结构二、噬菌体载体二、噬菌体载体M13mp18/M13mp19 结构结构三、穿梭载体三、穿梭载体 同时具有原核和真核细胞的复制起始点同时具有原
28、核和真核细胞的复制起始点 真核生物的克隆载体常构建成穿梭载体，使其真核生物的克隆载体常构建成穿梭载体，使其先在大肠杆菌中扩增，再转入真核细胞先在大肠杆菌中扩增，再转入真核细胞 若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因外源基因三、穿梭载体三、穿梭载体 真核系统载体还必需具备适当的筛选标记真核系统载体还必需具备适当的筛选标记 使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如（如TKTK基因产物）基因产物） 抗新霉素基因抗新霉素基因三、穿
29、梭载体三、穿梭载体（二）逆转录病毒载体（二）逆转录病毒载体（一）（一）SV40SV40（猿猴病毒）载体（猿猴病毒）载体（一）（一）SV40SV40（猿猴病毒）载体（猿猴病毒）载体 真核表达载体中的调控元件大都来源于真核表达载体中的调控元件大都来源于SV40SV40的调控顺序和复制信号的调控顺序和复制信号 用用SV40 DNASV40 DNA与外源与外源DNADNA构建重组子，转染细构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源胞后允许细胞形成含外源DNADNA的病毒颗粒的病毒颗粒 重组子不包装成病毒颗粒，而在细胞中复重组子不包装成病毒颗粒，而在细胞中复制或整合到染色体组中制或整合到染色体组中 三、穿
30、梭载体三、穿梭载体例：例：PSVK3PSVK3质粒质粒 PSVK3 PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体。表达外源基因的穿梭载体。三、穿梭载体三、穿梭载体PSVK3PSVK3具有下列构件：具有下列构件：1.1.原核系统构件：原核系统构件： 复制子和丝状噬菌体复制起始位点复制子和丝状噬菌体复制起始位点flfl 筛选标志（筛选标志（AmpAmpr r） 启动子（启动子（T T7 7启动子）启动子）2.2.真核系统构件：真核系统构件： SV40SV40复制起始点复制起始点 SV40SV40早期启动子早期启动子三、穿梭载体三、穿梭载体3.RNA3
31、.RNA修饰信号：修饰信号： SV40SV40小小T T抗原拼接信号抗原拼接信号 SV40SV40早期区早期区mRNA polyAmRNA polyA加尾信号加尾信号4.4.多克隆位点：多克隆位点： SV40SV40启动子下游有启动子下游有8 8个酶切位点个酶切位点三、穿梭载体三、穿梭载体三、穿梭载体三、穿梭载体pSVK3pSVK3质粒质粒（二）逆转录病毒载体（二）逆转录病毒载体 逆转录病毒载体的特点：逆转录病毒载体的特点： 具有广泛的哺乳动物细胞宿主具有广泛的哺乳动物细胞宿主 较大的容量，能插入较大的容量，能插入7kb7kb甚至更大的外源基因甚至更大的外源基因三、穿梭载体三、穿梭载体 病毒基
32、因组自身含有完整高效的调控元件病毒基因组自身含有完整高效的调控元件 病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在一起复制、长期存在 逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系成完整的体系三、穿梭载体三、穿梭载体逆转录病毒载体的局限性：逆转录病毒载体的局限性： 逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的
33、细胞 装载容量较小，仅装载容量较小，仅8kb8kb左右左右 可能存在具有复制能力的野生型病毒可能存在具有复制能力的野生型病毒三、穿梭载体三、穿梭载体 常用外源常用外源DNADNA片段取代病毒中的癌基因，即卸去片段取代病毒中的癌基因，即卸去其致癌性，称为卸甲载体（其致癌性，称为卸甲载体（disarmed vectordisarmed vector）。）。 三、穿梭载体三、穿梭载体四、人工染色体四、人工染色体 酵母人工染色体酵母人工染色体（YACYAC） 细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACBAC） 噬菌体噬菌体P1P1衍生的人工染色体（衍生的人工染色体（PACPAC） 哺乳动物人工染色体（哺乳
34、动物人工染色体（MACMAC） YACYAC主要调控元件主要调控元件 着丝粒：保证染色体细胞分裂过程中正确分着丝粒：保证染色体细胞分裂过程中正确分 配到子代细胞配到子代细胞 端粒：防止染色体被核酸外切酶降解端粒：防止染色体被核酸外切酶降解 复制起始点和限制性内切酶位点复制起始点和限制性内切酶位点四、人工染色体四、人工染色体 筛选标志：筛选标志： 酵母中一般通过色氨酸、亮氨酸、组氨酸酵母中一般通过色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选 原核序列及调控元件：原核序列及调控元件： 包括大肠杆菌复制起始点、包括大肠杆菌复制起始点、AmpA
35、mpr r基因等基因等四、人工染色体四、人工染色体YACYAC作为载体的主要特点：作为载体的主要特点： 酵母是单细胞真核生物，培养方便酵母是单细胞真核生物，培养方便 酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物基因基因 装载容量大，可达装载容量大，可达MbpMbp水平水平四、人工染色体四、人工染色体 DNADNA片段连接到片段连接到YACYAC载体的（两）臂上形成重载体的（两）臂上形成重组体，将重组体通过常规方法导入酵母组体，将重组体通过常规方法导入酵母 已广泛应用于各种生物基因组计划已广泛应用于各种生物基因组计划四、人工染色体四、人工染色体第三节第三节
36、 DNADNA重组与鉴定重组与鉴定 将不同来源的将不同来源的DNADNA分子进行特异地切割分子进行特异地切割获得的目的基因或获得的目的基因或DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组的重组的DNADNA分子导入相应的宿主细胞分子导入相应的宿主细胞在宿主细胞中进行无性增殖在宿主细胞中进行无性增殖DNADNA重组重组 (DNA recombination)(DNA recombination) 第三节第三节 DNADNA重组与鉴定重组与鉴定第三节第三节 DNADNA重组与鉴定重组与鉴定二、重组子的筛选与鉴定二、重组子的筛选与鉴定三、三、DNADNA序列测定序列测定一、一、DNADNA重组重组 一
37、、一、DNADNA重组重组（二）重组（二）重组DNADNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞（一）目的一）目的DNADNA片段与载体的连接片段与载体的连接 平接法平接法 平端连接法平端连接法 人工接头法人工接头法 同聚体加尾连接同聚体加尾连接 一、一、DNADNA重组重组（一）目的（一）目的DNADNA片段与载体的连接片段与载体的连接 粘端连接法粘端连接法 平端连接法平端连接法一、一、DNADNA重组重组2.2.平端连接平端连接3.3.同聚体加尾连接同聚体加尾连接 4.4.人工接头连接人工接头连接（一）目的（一）目的DNADNA片段与载体的连接片段与载体的连接 1.1.粘性末端连接粘性末端连接
38、1.1.粘性末端连接（粘性末端连接（cohesive end ligationcohesive end ligation） DNADNA插入片段与的载体存在同源粘性末端插入片段与的载体存在同源粘性末端 同源粘性末端包括相同一种内切酶产生的粘性同源粘性末端包括相同一种内切酶产生的粘性 末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端一、一、DNADNA重组重组（一）目的（一）目的DNADNA片段与载体的连接片段与载体的连接一、一、DNADNA重组重组 2.2.平端连接平端连接(blunt end ligation(blunt end ligation) ) DNA DNA
39、连接酶可催化相同和不同限制性内切连接酶可催化相同和不同限制性内切酶切割的平端之间的连接。酶切割的平端之间的连接。一、一、DNADNA重组重组载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目的基因目的基因一、一、DNADNA重组重组 3.3.同聚体加尾连接同聚体加尾连接 适用于外源适用于外源DNADNA片段与载体均为平末端或为不匹片段与载体均为平末端或为不匹 配的粘性末端配的粘性末端 用末端转移酶使一个用末端转移酶使一个DNADNA分子分子33端接上多聚端接上多聚 A, A, 另一个另一个DNADNA片
40、段片段33端接上多聚端接上多聚T T，按，按A-TA-T配对原配对原 则相连则相连 一、一、DNADNA重组重组 一、一、DNADNA重组重组 4.4.人工接头连接人工接头连接 将目的基因或将目的基因或DNADNA片段的两端接上能够被片段的两端接上能够被某一限制性内切酶识别的某一限制性内切酶识别的DNADNA序列，酶切后和序列，酶切后和载体获得相同的粘性末端，再进行粘性末端的载体获得相同的粘性末端，再进行粘性末端的连接。连接。 一、一、DNADNA重组重组 一、一、DNADNA重组重组 宿主细胞：宿主细胞： 原核细胞（大肠杆菌）原核细胞（大肠杆菌） 真核细胞真核细胞( (哺乳类动物细胞、酵母和
41、昆虫细胞哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞) ) 重组重组DNADNA分子导入宿主细胞方式：分子导入宿主细胞方式： 转化、转染和感染转化、转染和感染（二）重组（二）重组DNADNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞一、一、DNADNA重组重组一、一、DNADNA重组重组（二）重组（二）重组DNADNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞1.1.重组重组DNADNA分子导入原核细胞分子导入原核细胞2.2.重组重组DNADNA分子直接导入真核细胞分子直接导入真核细胞3.3.使用噬菌体或病毒将重组使用噬菌体或病毒将重组DNADNA分子导入细胞分子导入细胞 1.1.重组重组DNADNA分子导入原核细胞分子导入原
42、核细胞 将重组的将重组的DNADNA分子导入细菌，使其在细菌体内扩分子导入细菌，使其在细菌体内扩 增及表达的过程称为增及表达的过程称为转化转化(transformation)(transformation) 转化的方法可分为转化的方法可分为CaClCaCl2 2法和电穿孔法法和电穿孔法 一、一、DNADNA重组重组 细菌在生长过程中，只有某一状态的细菌才能细菌在生长过程中，只有某一状态的细菌才能 成为转化的接受体，这种细菌称为感受态细菌成为转化的接受体，这种细菌称为感受态细菌 感受态细菌表面正电荷增多，细胞壁和膜的通感受态细菌表面正电荷增多，细胞壁和膜的通 透性增加，有利于透性增加，有利于DN
43、ADNA分子的吸附与吸收分子的吸附与吸收 一、一、DNADNA重组重组 当细菌处于当细菌处于00、二价阳离子低渗溶液中时，细、二价阳离子低渗溶液中时，细 菌细胞膨胀成球形，处于感受态菌细胞膨胀成球形，处于感受态 转化混合物中的转化混合物中的DNADNA形成抗形成抗DNADNA酶的羟基酶的羟基- -钙磷酸钙磷酸 复合物粘附于细胞表面，复合物粘附于细胞表面， 在在4242短时间热冲击短时间热冲击 后后DNADNA进入细胞进入细胞 转化效率为每微克转化效率为每微克DNADNA可获得可获得10105 510106 6转化子转化子CaClCaCl2 2法法一、一、DNADNA重组重组 电穿孔法（电穿孔法
44、（electroporationelectroporation） 即电击法，利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成即电击法，利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成 暂时性的微孔，重组暂时性的微孔，重组DNA DNA 从微孔中进入，脉冲过从微孔中进入，脉冲过 后微孔复原后微孔复原 转化效率高，每微克转化效率高，每微克DNADNA可得到可得到10109 9 10101010转化子转化子一、一、DNADNA重组重组 将外源将外源DNADNA直接导入真核细胞的过程称为直接导入真核细胞的过程称为转染转染（transinfectiontransinfection） 常用的方法：电穿孔法常用的方法：电穿孔法 磷酸钙共沉
45、淀法磷酸钙共沉淀法 脂质体法脂质体法 DEAE-DEAE-葡聚糖介导葡聚糖介导 显微注射法等显微注射法等 2.2.重组重组DNADNA分子直接导入真核细胞分子直接导入真核细胞一、一、DNADNA重组重组 磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法 将被转染的将被转染的DNADNA和正在溶液中形成的磷酸钙和正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，磷酸钙和外源性微粒共沉淀后，磷酸钙和外源性DNADNA形成沉淀颗形成沉淀颗粒附着在细胞表面，在钙、磷的诱导下通过内吞粒附着在细胞表面，在钙、磷的诱导下通过内吞作用被细胞摄取。作用被细胞摄取。 一、一、DNADNA重组重组 脂质体法脂质体法 是一种人造膜泡，它带有正电荷，与
46、是一种人造膜泡，它带有正电荷，与DNADNA或或RNARNA上带负电的磷酸基团结合，形成由阳离子脂质包裹上带负电的磷酸基团结合，形成由阳离子脂质包裹DNADNA的颗粒。的颗粒。 脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过二者的融合将外源基因导入细的负电荷结合，通过二者的融合将外源基因导入细胞。胞。 一、一、DNADNA重组重组 显微注射法显微注射法 将外源基因的重组体通过显微注射装置直将外源基因的重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中并进行表达，但接注入细胞核中并进行表达，但显微注射法显微注射法需需要一定的仪器和操作技巧。要一定的仪器
47、和操作技巧。 一、一、DNADNA重组重组 3.3.使用噬菌体或病毒将重组使用噬菌体或病毒将重组DNADNA分子导入细胞分子导入细胞 重组重组DNADNA分子在体外包装成具有感染能力的分子在体外包装成具有感染能力的噬菌噬菌 体体或病毒颗粒，然后感染适当的细胞，这种使用或病毒颗粒，然后感染适当的细胞，这种使用 噬菌体或病毒将重组噬菌体或病毒将重组 DNADNA分子导入细胞的方法为分子导入细胞的方法为 感染感染(infection)(infection) 效率较高，每微克可得到效率较高，每微克可得到10107 7转化子转化子 一、一、DNADNA重组重组二、重组子的筛选与鉴定二、重组子的筛选与鉴定
48、（二）根据重组（二）根据重组DNADNA的分子生物学特征进行鉴定的分子生物学特征进行鉴定（一）根据遗传学性状进行筛选（一）根据遗传学性状进行筛选二、重组子的筛选与鉴定二、重组子的筛选与鉴定（一）根据遗传学性状进行筛选（一）根据遗传学性状进行筛选 1. 抗性标志筛选抗性标志筛选 2. 抗性标志插入失活筛选抗性标志插入失活筛选3.互补筛选互补筛选 4. 标志补救筛选标志补救筛选 （一）根据遗传学性状进行筛选（一）根据遗传学性状进行筛选 1.1.抗性标志筛选抗性标志筛选 当带有完整抗药性基因的载体转入无抗药性细当带有完整抗药性基因的载体转入无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含胞后，
49、凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长成菌落，而未被转有相应抗生素的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。化的宿主细胞不能生长。 二、重组子的筛选与鉴定二、重组子的筛选与鉴定 2.2.抗性标志插入失活筛选抗性标志插入失活筛选 选用含有两个以上的抗药基因载体，外源选用含有两个以上的抗药基因载体，外源DNADNA片段插入其中一个基因，导致这个基因失活，用片段插入其中一个基因，导致这个基因失活，用两个含不同抗生素的平板互相对照，筛选含重组两个含不同抗生素的平板互相对照，筛选含重组DNADNA的菌落。的菌落。 二、重组子的筛选与鉴定二、重组子的筛选与鉴定 二、
50、重组子的筛选与鉴定二、重组子的筛选与鉴定 3.3.互补筛选互补筛选 含有编码含有编码LacZLacZ基因的调控序列和基因的调控序列和N N端端146146个氨基酸个氨基酸 的编码序列的编码序列 当宿主细胞含有当宿主细胞含有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端编码序列时，端编码序列时， 此酶的此酶的N N端序列与宿主细胞的端序列与宿主细胞的C C端序列互补，产端序列互补，产 生具有活性的生具有活性的-半乳糖苷酶，从而使宿主细菌半乳糖苷酶，从而使宿主细菌 在含有在含有IPTG/X-galIPTG/X-gal的培养基上呈蓝色的培养基上呈蓝色 二、重组子的筛选与鉴定二、重组子的筛选与鉴定 当多克隆位点有外源
