1、9 RNA的翻译蛋白质的生物合成9.1 核糖体及核糖体核糖核酸结构核糖体及核糖体核糖核酸结构9.1.1. tRNA mini RNA, 4s tRNA phe, 77Nt cloverleaf form (1964 Holly R.) 5 arms & 4 loops Nt more modified by methylation-aa accept arm ; loading aa at 3 end-DHU loop; contact with AARS-anti-codon loop; 34th is wobble base-TC loop; contact with 5s rRNA-ex
2、tra loop; classification marker ?34 I type ; 3-5 Nt 3/4 tRNAII type ; 13-21 Nt Paracodon-由若干由若干Nt组成，存在于组成，存在于tRNA不定位置上不定位置上-与与AARS侧链基团的分子发生特异的侧链基团的分子发生特异的“契合契合”-成为成为tRNA准确负载氨基酸的机制之一准确负载氨基酸的机制之一 tRNA的的”L”三维结构与功能三维结构与功能“L”构型的结构力构型的结构力-二级结构中双链区的碱基堆积力和氢键二级结构中双链区的碱基堆积力和氢键-二级结构中非双链区在二级结构中非双链区在“L”结构中，形成氢键结
3、合结构中，形成氢键结合“L”结构域的功能结构域的功能-anti-codon arm 位于位于”L”另一端，与结合在核糖体另一端，与结合在核糖体 小亚基上的小亚基上的codon of mRNA配对配对- TC loop & DHU loop 位于位于“L”两臂的交界处，两臂的交界处， 利于利于“L”结构的稳定结构的稳定-“L”结构中碱基堆积力大，使其拓扑结构趋于稳定结构中碱基堆积力大，使其拓扑结构趋于稳定 wobble base 位于位于“L”结构末端，堆积力小，自由结构末端，堆积力小，自由度度 大，使碱基配对摇摆大，使碱基配对摇摆-aa accept arm 位于位于“L”的一端，契合于核糖体
4、的的一端，契合于核糖体的肽肽基基 转移酶转移酶结合位点结合位点 P A, 以利肽键的形成以利肽键的形成-aa accept arm 位于位于“L”的一端，契合于核糖体的的一端，契合于核糖体的肽肽基基 转移酶转移酶结合位点结合位点 P A, 以利肽键的形成以利肽键的形成-anti-codon arm 位于位于”L”另一端，与结合在核糖体另一端，与结合在核糖体 小亚基上的小亚基上的codon of mRNA配对配对 A P-“L”结构中碱基堆积力大结构中碱基堆积力大 使其拓扑结构趋于稳定使其拓扑结构趋于稳定 wobble base 位于位于“L”结构末端结构末端 堆积力小堆积力小 自由度大自由度大
5、 使碱基配对摇摆使碱基配对摇摆- TC loop & DHU loop 位于位于“L”两臂的交界处，两臂的交界处， 利于利于“L”结构的稳定结构的稳定9.1.2. rRNA Prokaryote 23s, 16s, 5s / Eukaryote 28s-5.8s, 18s, 5s Rich methylation (m2U, m3A, m3U, m26A(二甲基二甲基)3 end5 endS21- S1 S4Ordered process16s rRNAS4 More hairpin structue9.1.3. mRNA In Prokaryote5-end; 300Nt leading s
6、eq. (A/G-AUG)S.D seq-AUGpoly-citron9Nt betterrich A,U, Shine-Dalgarno seq. (S.D seq) GGAGG G mut. translation go down In Eukaryotemono-cistron5 m7Gppp- -CCACC-A-3-A1U2G3G4leading seq.核糖体小亚基扫描核糖体小亚基扫描AUG的信号序列的信号序列 至关准确翻译至关准确翻译9.1.4. 核糖体核糖体9.2 氨基酸的激活与氨酰氨基酸的激活与氨酰dRNA的合成的合成H C N HH C H HSCH3C OP OH3 ACC
7、A-O2ACCAP O3-OH2Met + tRNAmetf OH 2 OH 3转酯转酯 aa formylationH C N HH C HSCH3C OHHC Oin Prok. f MettRNA metf & Met-tRNA metmAminoacyltRNAaain Euk. MettRNA metI & Met-tRNA mete AARSAminoacyl tRNA synthetaseR非特异结合位点非特异结合位点 TC + 5srRNA特异结合位点特异结合位点 paracodan9.3 原核生物的蛋白质的生物合成原核生物的蛋白质的生物合成9.3.1. direction o
8、f peptide elongation N C R1 O H R2 R3H O H ONCCNCC + + NCCH OH H OHH H H R3 R1 O H R2H O H ONCC + + NCCNCCH OH H OH H H H机制？a.Initiation Enzyme of translation in Prok.a.Initiation Enzyme of translation in Prok.IF-1 9.5kd 加强IF-2，IF-3的酶活IF-2 95kd-117kd 促使fMet-tRNA fmet 选择性的结合 在30S亚基上IF-3 20kd 促使30S亚基结
9、合于mRNA起始 部位 具有解离30S与50S亚基的活性Initiation of translation in Prok.IF-2fmetfmet30s-mRNA complexBinary complexGTPCompleteInitiation complexfmetfmetIF3IF3b. Initiation Enzyme 0f translation in Euk.b. Initiation Enzyme 0f translation in Euk.eIF2 3种亚基种亚基 形成形成3元起始复合体（元起始复合体（eIF2, GTP, tRNA) eIF2-A 65kd 促使促使Me
10、t-tRNAmet与与40S亚基结合亚基结合ieIF1 15kd 促使促使mRNA 与与40S亚基结合亚基结合eIF3 500kd 促使促使mRNA 与与40S亚基结合亚基结合eIF4b 80kd 促使促使mRNA 与与40S亚基结合亚基结合 eIF4a 50kd 促使与促使与mRNA ,GTP结合结合eIF4C 19kd 促使两亚基结合促使两亚基结合 eIF5 150kd 释放释放eIF2, eIF3 eIF4e (eIF4f 的亚基的亚基) 与与5端帽子结合端帽子结合Initiation of translation in Euk.Initiation of translation in
11、Euk.eIF-2GTPMetMetSubunit Initiation ComplexSubunit binding to end of mRNAMetMetATPADP + PicomplexComplete initiation Complex of translation Complete initiation Complex of translation Translation domainExit domain menbraneExit site5s sitePeptidyl transferaseP siteA siteEF-G siteEF-Tu sitemRNA site20
12、 NtfMet-tRNAmetf (Met-tRNAmeti) way in P sitefMetMetfMet-tRNAmetfMet-tRNAmetid. Processing d. Processing initiationinitiation?S.D. Sequence?Scanning sequenceP ACInitiationInitiationCCPAfMetMetAElongation Elongation P AMetAUG APMet AUG UUU CUG UAG PheTs + ADP ATPTuTsGDPTuGTP PheP A AUG UUU CUG UAGMet
13、 PheMet PheTsTuGTPTuGDPEF-G be needed for translocation Temperate S Terminatio of peptide Terminatio of peptide-When stop codon into ribosome A site-When stop codon into ribosome A siteRelease factor 1/2 (or transpeptidase or rRNA ribozyme ?) peptide + tRNA + mRNA + large & small subunitComplex disa
14、ssembleHydrolysisTerminationTerminationM F LPAAUG UUU CUG UAGM F LPA UUU CUG UAGTFM F LPA UUU CUG UAGM F LTF- stop codon usage- stop codon usage- UAA stop codon - UAA stop codon 终止效率高终止效率高UAG易被漏读易被漏读 E.coli 165 genesBacillus 52 genesYeast 105 genes 对对sense codon bias 强强的基因的基因 多选用多选用UAA 对对sense codon
15、 bias 弱弱的基因的基因 多选用多选用UGA该基因多选用该基因多选用2 或或3 个个 stop codon-4 Nt-4 Nt终止密码？！终止密码？！ 终止密码终止密码后后多数具有多数具有U 提出终止密码可能为提出终止密码可能为 (UAAU, UAGU, UGAU) 4 Nt stop codon471 UAA, 200 UGA前前的密码的密码NANUAA (AAA/G)LysUAA with high frequencyUNNUAG (UCN/UUC)Ser/PheUAG with high freq.Brown （1990 ）分析了分析了826个基因个基因保证保证peptide准确翻译
16、的机制准确翻译的机制DNA replication = 10-11RNA transcription = 10-4Peptide translation P(准确率准确率) = （1）n (氨基酸的数目氨基酸的数目) N P (=10-2) P(=10-3) P(=10-4)100 36% 91.5% 99%200 4.9% 84% 97%1000 0.004% 36% 90% MACHENISM ? 氨基酸与氨基酸与tRNA间的间的负载专一性负载专一性a) 氨基酰氨基酰tRNA合成酶合成酶（AARS）对氨基酸的特异识别与结合对氨基酸的特异识别与结合 AARS; aa binding site
17、, tRNA binding site, ATP site aa binding site 对结构相似的氨基酸的对结构相似的氨基酸的双筛作用双筛作用 例；例；Cys HSCH2CHCOOH NH2 Ala HCH2CHCOOH NH2 Ala-RS结构相似结构相似错误识别错误识别错误负载错误负载 错误翻译错误翻译 Ile H COOH CH3CH2CCH CH3 NH2 Val H COOH CH3CCH CH3 NH2 Ile-RSIn vitro Ile & Val 浓度相等的情况下浓度相等的情况下 200X1XVal-tRNAIle 错误负载错误负载机率机率 1/200 !In vivo
18、 Val : Ile = 5:1 但实际测定的错译机率仅为但实际测定的错译机率仅为1/3000 ?! Val-tRNAIle 错误负载机率错误负载机率 1/40 !How ?aa + ATPMis-activation aa-AMP + tRNAaaAARSaa-tRNAaaaa binding site 具有结合位点（具有结合位点（B）和水解位点（）和水解位点（H） (双筛位点双筛位点)Mis-loadingAARSIle / Val 进入进入B 位点位点Ile 分子构型大于分子构型大于Val Ile进入进入B 位点但不能进入位点但不能进入H 位点位点 Val进入进入B 位点并进入位点并进入
19、H 位点而被降解位点而被降解 H 位点柔性部位小位点柔性部位小KineticComformationalChemical发生诱导契合发生诱导契合proofreadingIVBHValAMPaa-tRNA binding siteBHBHaa-tRNA loadingBHVIVII无相似结构的氨基酸间无相似结构的氨基酸间 其特异其特异AARS分子无双筛位点分子无双筛位点例；例； aa site of Tyr-RS 只能与只能与Tyr发生诱导契合，发生诱导契合， 无双筛位点无双筛位点b) 在在AARS 的介导下的介导下 tRNA 的副密码子的副密码子(paracodon)(paracodon) 对
20、对aa 的负载的负载 su- & Su+ gene tDNA mutationanti-codon mutation 不影响对不影响对tRNA的负载的负载ParacodonParacodon (副密码子副密码子)的概念；的概念； tRNA中决定负载特定氨基酸的空间密码中决定负载特定氨基酸的空间密码 tRNA中的特定序列与中的特定序列与AARS 的的tRNA binding site的特异基团间的分子契合的特异基团间的分子契合 AARStRNA binding site aa binding siteParacodon of tRNA loading Amino Acid（R）anti-codo
21、n 对对codon 的准确识读的准确识读 wobble hypothesis anti-codon modifying some base flanked anti-codon modifying对第一个对第一个Met (AUG) 的准确起译的准确起译a) Prok. mRNA -S.D. seq-AUG-Euk. mRNA cap-CCACC-A-3 -AUGG+4- GGAGGPairing with 16srRNA 3-end72Nt & 富含富含 AT 最佳最佳富含富含G, 将阻止起译过程将阻止起译过程Scanning signal ?important不同的不同的mRNA cap 要
22、求要求 eIF4F 的相对浓度差异的相对浓度差异核糖体小亚基核糖体小亚基 scanning CCACC from 5 to 3保证从第一个保证从第一个AUG 起译起译调控翻译速率调控翻译速率b) eIF4F 识别识别capTwo times proofreading for aa-tRNAaa at A site成肽键前对成肽键前对aa-tRNAaa的正误进行最后的校对的正误进行最后的校对=10-4 的错译原因的错译原因随机发生的错译现象随机发生的错译现象a) 功能相同的蛋白质，氨基酸序列并非功能相同的蛋白质，氨基酸序列并非100%一致一致 不同物种间，功能相同的蛋白质存在一定的相似度不同物种
23、间，功能相同的蛋白质存在一定的相似度 isozyme enzyme非活性中心区的氨基酸错译非活性中心区的氨基酸错译消耗能量，付出代价。无关宏旨，消耗能量，付出代价。无关宏旨，多此一举多此一举校正校正b) 准译率上升，错译率下降，有时产生负效应准译率上升，错译率下降，有时产生负效应Bacterial S12核糖体蛋白核糖体蛋白StrR mut. P 放慢翻译速率放慢翻译速率降低生存机率降低生存机率c) sense codon mis-reading氨基酸饥饿时氨基酸饥饿时(10 X) 氨基酸非饥饿时氨基酸非饥饿时e.g. CGY (Arg) -(R starved) - UGY (Cys) CA
24、Y (His) -(H starved) - CAR (Gln) AUA(Ile)/AUU(Ile) -(I starved) -AUG(Met) = 3%并非饥不择食并非饥不择食9.4 GTP在蛋白质合成中的作用在蛋白质合成中的作用1) EF-Tu结合结合GTP和氨酰和氨酰tRNA并进入核糖体并进入核糖体A位位 点，然后水解释放；点，然后水解释放；2) 促使转位（形成肽键）；促使转位（形成肽键）；3) EF-G结合结合GTP并进入核糖体并进入核糖体,水解水解GTP释放能量释放能量使核糖体向使核糖体向mRNA3移动，空载移动，空载tRNA退出核糖退出核糖体体 。9.5 真核生物的蛋白质的生物合
25、成真核生物的蛋白质的生物合成真核生物翻译起始复合物形成真核生物翻译起始复合物形成核蛋白体大小亚基分离；核蛋白体大小亚基分离；起始氨基酰起始氨基酰-tRNA-tRNA结合；结合；mRNAmRNA在核蛋白体小亚基就位；在核蛋白体小亚基就位；核蛋白体大亚基结合。核蛋白体大亚基结合。 起始因子起始因子生物功能生物功能eIF-2促进起始促进起始tRNA与小亚基结合与小亚基结合eIF-2B, eIF-3 促进大小亚基分离促进大小亚基分离eIF-4AeIF-4F复合物成分，有解螺旋酶活性，促进复合物成分，有解螺旋酶活性，促进mRNA结合小亚基结合小亚基eIF-4B促进促进mRNA扫描定位起始扫描定位起始AU
26、GeIF-4EeIF-4F复合物成分，结合复合物成分，结合mRNA 5帽子帽子eIF-4GeIF-4F复合物成分，结合复合物成分，结合eIF-4E和和PABeIF-5促进各种起始因子从小亚基解离，进而结合促进各种起始因子从小亚基解离，进而结合大亚基大亚基eIF-6促进核蛋白体分离成大小亚基促进核蛋白体分离成大小亚基 真核生物翻译起始的特点真核生物翻译起始的特点l核蛋白体是核蛋白体是80S；l起始因子种类多；起始因子种类多；l起始起始tRNA的的Met不需甲酰化；不需甲酰化；lmRNA的的5帽子和帽子和3poly A尾结构与尾结构与mRNA在核蛋白体就位有关；在核蛋白体就位有关；l起始起始tRN
27、A先与核蛋白体小亚基结合，然先与核蛋白体小亚基结合，然后再结合后再结合mRNA真核生物肽链合成的延长过程与原核真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。子。另外，真核细胞核蛋白体没有另外，真核细胞核蛋白体没有E E位，转位，转位时卸载的位时卸载的tRNAtRNA直接从直接从P P位脱落。位脱落。真核生物延长过程真核生物延长过程9.6 蛋白质折叠与蛋白质生物蛋白质折叠与蛋白质生物 合成中多肽链的修饰合成中多肽链的修饰热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用：热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用：结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠
28、。结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。和多肽片段依次结合、解离的循环。 蛋白二硫键异构酶（蛋白二硫键异构酶（PDI） 二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。 肽肽-脯氨酰顺反异构酶脯氨酰顺反异构酶 肽酰肽酰- -脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。肽酰体之间的转换
29、。肽酰- -脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。 9.7 蛋白质的易位与分泌蛋白质的易位与分泌信号序列信号序列(signal sequence) 所有靶向输送的蛋白质结构中存在分所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列这一序列称为信号序列 。 分泌蛋白的靶向输送分泌蛋白的靶向输送真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进入内质网，再分别被包装成分泌小泡而分泌出先要进入内质网，再分别被包装成分泌小泡而分泌出细胞。细胞。 本章结束，谢谢！本章结束，谢谢！
