1、目录目录 DNA重组和重组重组和重组DNA技术技术DNA Recombination and Recombinant DNA technology第二十一章第二十一章目录目录nDNA重组重组（DNA recombination）是指不）是指不同同DNA分子断裂和连接而产生分子断裂和连接而产生DNA片段片段的交换并重新组合形成新的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。分子的过程。n重组重组DNA技术技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以）是指在体外将两个或两个以上上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新形成新DNA分
2、子的过程。分子的过程。 目录目录第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature目录目录DNA重组重组同源重组同源重组 (homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)转座重组转座重组(transposition recombination)接合作用接合作用 (conjugation)转化作用转化作用 (transformation)转导作用转导作用 (transduction)目录目录 发生在同源序列间的
3、重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组(homologous recombination)，又称又称基本重组基本重组（general recombination）。是最基本的。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。段的交换。 以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的同源重组为例，了解同源重组机制的的Holliday模型模型一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式目录目录nHolliday模型的模型的4个关键步骤：个关键
4、步骤： 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐；片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体；中间体； 通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA； Holliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：目录目录 片段重组体片段重组体 （见模型图左边产物）：（见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链
5、，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本本DNA。 拼接重组体拼接重组体（见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本DNA。 目录目录n参与细菌参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最同源重组的酶有数十种，其中最关键的是关键的是RecA蛋白蛋白、RecBCD复合物复合物和和RuvC蛋蛋白白。nRecBCD复合物复合物具有三种酶活性，即依赖于具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被
6、的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切增强的核酸内切酶活性以及需要酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。的解螺旋酶活性。 nRecA蛋白蛋白可结合单链可结合单链DNA（ssDNA），形成），形成RecA-ssDNA复合物。复合物。 nRuvC有内切酶活性，能专一性识别有内切酶活性，能专一性识别Holliday连连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3
7、5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holliday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 Holliday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目录目录EM of a Holliday Junction w/a few melted
8、 base pairs around junction目录目录二、位点特异重组是发生在特异位点二、位点特异重组是发生在特异位点间的间的DNA整合整合 位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异序列的特异位点间发生的整合。位点间发生的整合。目录目录噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复
9、序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合目录目录（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。目录目录 hix为反向重复序列，它们之间的为反向重复序列，它们之间的H片段片段可在可在Hin控制下进行特异位点重组控制下进行特异位点重组(倒位倒位)。H片段上有两个启动子片段上有两个启动子P，其一驱动，其一驱动hin基基因表达，另一正向时驱动因表达，另一正向时驱动H2和和rH1基因基因表达，反向表达，反向(倒位倒位)时时H2和和rH1不表达。不表达。rH1为为H1的阻遏蛋
10、白基因。的阻遏蛋白基因。目录目录 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门氏菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变目录目录（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链，由两条轻链(L链链)和两条重和两条重链链(H链链)组成，分别由三个独立的基因族编码，组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链其中两个编码轻链( 和和 )，一个编码重链。，一个编码重链。 轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片
11、段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 目录目录免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程目录目录Ig基因可变区重排发生的分子机制基因可变区重排发生的分子机制 - 重组信号序列（重组信号序列（RSS）在各基因片段在各基因片段两侧存在。两侧存在。 - B细胞发育早期重组活化基因细胞发育早期重组活化基因（RAG1/2）产物的出现。产物的出现。目录目录 重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基基因的因的V-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的两侧片段的两侧均存在保守的重
12、组信号序列均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基。此重排的重组酶基因因rag (recombination activating gene)共有共有两个，分别产生蛋白质两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段目录目录1.H基因库（重链基因连锁群）基因库（重链基因连锁群） -第第14号染色体号染色体2. 基因库（基因库（ 链基因连锁群）链基因连锁群） -第第2号染色体号染色体3. 基因库基因库 （
13、 链连锁群）链连锁群） -第第22号染色体号染色体免疫球蛋白基因库免疫球蛋白基因库目录目录1.H链链 V基因（约基因（约95个）个） D基因（基因（27个）个） J基因基因 （6个）个） C基因（基因（9个）个）2. 链链 V 基因（基因（100个）个） J 基因基因 （5个）个） C 基因（基因（1个）个）3. 基因基因 V 基因基因 （30个）个） J -C 基因（基因（4个）个）免疫球蛋白基因结构免疫球蛋白基因结构每条肽链的编码基因可分每条肽链的编码基因可分为为V区和区和C区两大部分。其区两大部分。其中中V区的基因是由不同的区的基因是由不同的基因片段拼接而成的。重基因片段拼接而成的。重链
14、链V区由区由V、D、J片段拼片段拼接；轻链由接；轻链由V、J拼接拼接。目录目录免疫球蛋白多样性发生的机制免疫球蛋白多样性发生的机制- 组合造成的多样性组合造成的多样性-连接造成的多样性，碱基的缺失或加入连接造成的多样性，碱基的缺失或加入-D基因形成的多样性基因形成的多样性-体细胞突变形成的多样性体细胞突变形成的多样性目录目录三、转座重组三、转座重组可使基因移位可使基因移位 由插入序列和转座子介导的基因移位或重由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为排称为转座转座(transposition)。 大多数基因在基因组内的位置是固定的，大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移
15、动到另一位但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的置。这些可移动的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和转座子。列和转座子。 目录目录 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座（一）插入序列转座 二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列序列 特有的正向重复序列特有的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因目录目录插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式：保守性转座保守性转座(conservative
16、transposition) 复制性转座复制性转座(duplicative transposition)目录目录Some genetic elements move to new chromosomal locations by transposition目录目录插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座目录目录 转座子转座子(transposons) 可从一个染色体可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）转座子转座（二）转座子转座 转座子组成：转座子组成： 反向重复序列反向重复序列转座酶编码
17、基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因目录目录 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L目录目录由转座子介导的转座由转座子介导的转座目录目录The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1983for her di
18、scovery of mobile genetic elementsBarbara McClintockUSACold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY, USAb. 1902d. 1992目录目录四、原核细胞可通过接合、转化和转导四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组进行基因转移或重组（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为转移称为接接合作
19、用合作用(conjugation)。目录目录 可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor) 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。 质粒质粒目录目录（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外通过自动获取或人为地供给外源源DNA，使细胞或培养的受体细胞，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为获得新的遗传表型，称为转化作用转化作用 (transformation)。目录目录例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。目录目录（三）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放当病毒从被感染
20、的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移转移及基因重组即为及基因重组即为转导作用转导作用(transduction)。目录目录噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)目录目录第二节第二节 重组重组DNA技术技术Recombinant DNA Technology目录目录重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验
21、。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物。药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。目录目录重组重组DNA技术相
22、关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。 DNA克隆克隆目录目录 技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）目录目录其主要过程包括：在体外将目的其主要过程包括：在体外将目的DNA片段片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组形成重组DNA分子，进而在
23、受体细胞中复制、分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。重组重组DNA技术，又称分子克隆（技术，又称分子克隆（molecular cloning）或）或DNA克隆（克隆（DNA cloning）或基因工）或基因工程（程（genetic engineering）技术）技术目录目录 目的：目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）目录目录一、重组一、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚
24、合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；分子或片段连接；缺口平移制作高比缺口平移制作高比活探针；活探针； DN
25、A序列分析；序列分析；填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA；替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进
26、行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目录目录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是一类核酸内切酶，能识别双链是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子分子内部的特异序列内部的特异序列, 并裂解磷酸二酯键。并裂解磷酸二酯键。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 定义：定义：目录目录Type II can recognize palindrome sequences. Restriction endonucle
27、ase 目录目录PalindromenPalindrome is also called inverted repeat sequence, which means the nucleotide sequence in 5to 3direction is the same in both strands.目录目录Palindrome（回文序列）客上天然居，客上天然居，居然天上客。居然天上客。僧游云隐寺，僧游云隐寺，寺隐云游僧寺隐云游僧 。Madam, Im Adam. Was it a car or a cat I saw? 目录目录与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰与甲基化酶共同构成细菌的限制
28、修饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型） 分类：分类： 作用：作用：目录目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。 命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目录目录类酶识别序列特点类酶识别序列特
29、点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口目录目录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口黏端切口黏端切口目录目录有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GAT
30、CC GATCTAG GATCT A 同尾酶同尾酶目录目录来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶同裂酶或同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同裂酶：同裂酶：名称名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点切割后产生切割后产生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hi
31、nd 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后产生切割后产生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后产生平末端切割后产生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GG
32、G.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶目录目录DNA ligasesnThese enzymes are used to join, or, anneal two strands od DNA.nThe ligase catalyse the formation of phosphodiester bonds between the pemtoses and phosphate groups of two adjacent DNA chains.目录目录Alkaline phosphatasenRemove 5 phosphate groups from DNA molecules; BAP
33、 is more stale but less active than CIP.目录目录Reverse transcriptasenAn enzyme first isolated from viruses: it will form DNA from an RNA templte, allowing complementary, or copy, DNA (cDNA) to be formed from mRNA.nThis allows double stranded cDNA sequences to be inserted into suitable plasmid vector, w
34、hich can then be used to transform bacterial cells.目录目录Terminal transferasenCatalyses the addition of nucleotides to the 3 terminus of a DNA molecule. nIt does not require a template. nThe preferred substrate of this enzyme is a 3-overhang, but it can also add nucleotides to blunt or recessed 3 ends
35、. 目录目录DNA polymerasenDNA Polymerase I : prokaryotic DNA polymerase in DNA replication.nPol I possesses three enzymatic activities:nA 5-3 (forward) DNA polymerase activity.nA 3 - 5 (reverse) exonuclease activity that mediates profreading.nA 5 - 3 (forward) exonuclease activity mediating nick translat
36、ion during DNA repair. 目录目录Klenow fragmentnThe Klenow fragment is a large protein fragment produced when DNA polymerase I from E. coli is enzymatically cleaved by the protease subtilisin. nIt retains the 5-3 polymerase activity and the 3 5 exonuclease activity for removal of precoding nucleotides an
37、d proofreading, but loses its 5 3 exonuclease activity.目录目录Taq DNA polymerasenHeat stale DNA polymerase form Thermus aquaticus , a bacterium that lives in hot springs nIt is able to withstand the protein-denaturing conditions (high temperature) required during PCRnOne of Taqs drawbacks is its relati
38、vely low replication fidelity. It lacks a 3 to 5 exonuclease proofreading activity, and has an error rate measured at about 1 in 9,000 nucleotides 目录目录T4 polynucleotide kinase nCatalyzed the transfer of Terminal () phosphate from a nucleotide 5 triphosphate to a 5 hydroxyl group of a polynucleotide.
39、目录目录 二、重组二、重组DNADNA技术中常用的载体技术中常用的载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。 载体按功能分为载体按功能分为 克隆载体克隆载体(cloning vector) 表达载体表达载体(expression vector) 目录目录克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为
40、使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目录目录（一）克隆载体（一）克隆载体 至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制自主复制，并能使克隆的外源并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增；片段得到同步扩增； 至少有至少有一个选择标志一个选择标志（selection marker）：选择标志是）：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基因、因、-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等
41、。）、营养缺陷耐受基因等。 有适宜的有适宜的RE的单一切点的单一切点：载体中一般都构建有一段特异：载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，的单一切点，可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）。）。1. 1. 克隆载体应具备的基本特点克隆载体应具备的基本特点 目录目录（1 1）质粒）质粒 (plasmid)特点特点: : 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些
42、遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 2. 常用的克隆载体常用的克隆载体 pUC18质粒载体图谱质粒载体图谱 目录目录 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）（2 2）噬菌体）噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列目录目录柯斯质粒柯斯质粒（cosmid）载体（又称黏粒载体）载体（又称黏粒载体） 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome
43、, YAC) 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（3）其他克隆载体）其他克隆载体目录目录（二）表达载体（二）表达载体表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。的载体。根据宿主细胞分为：根据宿主细胞分为：原核表达载体原核表达载体真核表达载体真核表达载体目录目录1. 1. 原核表达载体原核表达载体 原核表达载体的基本组成原核表达载体的基本组成 R R：调节序列；：调节序列；P P：启动子；：启动子；SDSD：SDSD序列；序列；TTTT：转录终止序列：转录终止序列目录目录2. 2. 真核表达载体真核表达载体 真核表达载体的基本组成真核表达载体的基本组成 OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点； TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。
