1、刘向华南京医科大学 生化与分子生物学系 Nanjing medical university Department of biochemistry and molecular biology1、学习碱裂解法提取质粒的原理、学习碱裂解法提取质粒的原理2、学习、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法琼脂糖凝胶电泳的原理和方法3、掌握质粒提取及鉴定的基本操作、掌握质粒提取及鉴定的基本操作质粒质粒(Plasmid)是细菌染色体外的遗传是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股物质，为环形闭合的双股DNA。 质粒具有可自主复制、质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细传给子代、也可丢失及在细菌之间转移
2、等特性，与细菌菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。的遗传变异有关。 在基因工程中质粒常被在基因工程中质粒常被用做基因的载体。用做基因的载体。 DNA琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳： 电荷效应与分子筛效应电荷效应与分子筛效应 核酸从负极向正极泳动，小分子泳动速度较快核酸从负极向正极泳动，小分子泳动速度较快 质粒质粒DNA较染色体较染色体DNA小，且具有超螺旋共小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点。价闭合环状的特点。 pH调至中性，变性的质粒调至中性，变性的质粒DNA恢复到原来的构恢复到原来的构型，型， 而染色体而染色体DNA不能复性，与蛋白质一起沉淀。不能复性，与蛋白质一起沉淀。 碱变性条件下
3、碱变性条件下, 染色体染色体DNA双螺旋解开而变性，双螺旋解开而变性，而质粒而质粒DNA部分解开部分解开, 双链不会完全分离。双链不会完全分离。取取1.5ml菌液，菌液，9000rpm离心离心30秒，尽可能的倒干上清。秒，尽可能的倒干上清。用用250l溶液溶液P1重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体彻底彻底悬浮。悬浮。P1：葡萄糖：制造低渗环境，增加细菌细胞膜的通透性；：葡萄糖：制造低渗环境，增加细菌细胞膜的通透性； 增加溶液的粘稠度，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉底。增加溶液的粘稠度，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉底。 EDTA：螯合核酸酶：螯合核酸酶加加250l溶液
4、溶液P2，温和地温和地上下翻转上下翻转10次使菌体充分裂解至清亮。次使菌体充分裂解至清亮。P2：NaOH/SDS溶液，是最佳的溶解细胞的试剂。溶液，是最佳的溶解细胞的试剂。 NaOH使使DNA变性，变性，SDS使蛋白质变性。染色体与蛋白质缠绕。使蛋白质变性。染色体与蛋白质缠绕。加加400l溶液溶液P3，立即，立即温和地温和地上下翻转上下翻转10次，放置次，放置5min。13000rpm离心离心10min，小心取上清。，小心取上清。P3：醋酸：醋酸/醋酸钾溶液，使溶液醋酸钾溶液，使溶液pH值恢复接近中性。此时质粒值恢复接近中性。此时质粒DNA复性，复性，而染色体而染色体DNA难以复性。难以复性。
5、SDS遇到遇到K+变成十二烷基硫酸钾，不溶于水，变成十二烷基硫酸钾，不溶于水，连同结合的蛋白质和缠绕其上的染色体连同结合的蛋白质和缠绕其上的染色体DNA共同沉淀。共同沉淀。加加500l去蛋白液去蛋白液PE，13000rpm离心离心60sec，弃滤液。，弃滤液。加加500l漂洗液漂洗液WB，13000rpm离心离心60sec，弃滤液。，弃滤液。（重复一遍）（重复一遍）取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加40l洗脱缓冲液洗脱缓冲液EB，放置，放置1min，13000rpm离心离心1min洗脱洗脱DNA，-20保存。保存。空柱空柱13000
6、rpm离心离心2min。敞口放置。敞口放置3min，除去残留乙醇。，除去残留乙醇。将将上清液上清液加入吸附柱中，加入吸附柱中，13000rpm离心离心1min，弃滤液。，弃滤液。注意：吸附柱使用前需先处理。将吸附柱置于收集管上，注意：吸附柱使用前需先处理。将吸附柱置于收集管上，加加500l溶液溶液P4，13000rpm离心离心1min，弃滤液。，弃滤液。P4：缓冲液，湿润、平衡吸附膜：缓冲液，湿润、平衡吸附膜加加250l溶液溶液P2，温和地温和地上下翻转上下翻转610次使菌体充次使菌体充分裂解，至溶液变清亮。分裂解，至溶液变清亮。取取1.5ml菌液，菌液，9000rpm离心离心30秒，秒，尽可
7、能的倒干上清。尽可能的倒干上清。用用250l溶液溶液P1重悬菌重悬菌体沉淀，枪头反复抽体沉淀，枪头反复抽吸至菌体吸至菌体彻底彻底悬浮。悬浮。加加400l溶液溶液P3，立即，立即温温和地和地上下翻转上下翻转610次，次，放置放置5min。13000rpm离离心心10min，小心取上清。，小心取上清。吸附柱置于收集管吸附柱置于收集管上，加上，加500l溶液溶液P4，13000rpm离心离心1min，弃滤液。，弃滤液。加加500l去蛋白液去蛋白液PE，13000rpm离心离心3060sec，弃滤液。，弃滤液。加加500l漂洗液漂洗液WB，13000rpm离心离心3060sec，弃滤液。（重复一次）弃
8、滤液。（重复一次）取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加部位加40l洗脱缓冲液洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在（洗脱缓冲液事先在6570水浴中加热效果更好），放置水浴中加热效果更好），放置1min，13000rpm离心离心1min洗脱洗脱DNA，-20保存。保存。空柱空柱13000rpm离心离心2min。放置。放置35min，除去残留乙醇。除去残留乙醇。将将上清液上清液加入吸附加入吸附柱中，柱中，13000rpm离离心心1min，弃滤液。，弃滤液。样品：样品：10 l质粒样品质粒样品 + 2 l上样缓冲液，混匀上样缓冲液，混匀电泳：电泳：90
9、120mA，电泳，电泳2040分钟分钟配胶：琼脂糖凝胶粉，溶于配胶：琼脂糖凝胶粉，溶于TBE缓冲液中，缓冲液中， 配成配成1%1.2%的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶上样：将样品用微量移液器加入凝胶孔中上样：将样品用微量移液器加入凝胶孔中2000bp 1000bp750bp500bp250bp100bpMarkerPEP负极负极正极正极1、注意无菌操作，避免细菌污染质粒；、注意无菌操作，避免细菌污染质粒；2、琼脂糖凝胶的配制、使用过程中用到溴化乙锭、琼脂糖凝胶的配制、使用过程中用到溴化乙锭(EB) 是是强诱变剂强诱变剂，具有高致癌性，注意自我防护；，具有高致癌性，注意自我防护；3、所有接触到琼脂糖凝胶的器械均须专用；、所有接触到琼脂糖凝胶的器械均须专用；4、制备质粒过程中，操作必须缓和，不可剧烈荡，、制备质粒过程中，操作必须缓和，不可剧烈荡， 避免机械剪切力对避免机械剪切力对DNA的断裂作用。的断裂作用。
