1、第十五章第十五章 DNADNA重组技术重组技术的基本原理的基本原理第一节第一节 DNADNA重组的技术要件重组的技术要件DNA重组技术：重组技术：基因工程亦称遗传工程，即利用基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术方法，把重组技术方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基目的基因）和载体因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（细胞的繁殖而增殖（cloning克隆），或最后得到表达克隆），或最后得到表达，最
2、终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。基因工程的关键技术是基因工程的关键技术是DNA重组，但二者并不等同。重组，但二者并不等同。DNA重组重组的的 技术路线技术路线Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromatemeSlection for cells coteining a recombi
3、nant DNA moleculeCloning+1、目的基因的制备、目的基因的制备2、载体的构建、载体的构建3、目的基因与载体、目的基因与载体的重组的重组4、重组、重组 体导入宿主体导入宿主细胞进行扩增细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定、克隆基因的鉴定一、重要的工具酶及其作用特点一、重要的工具酶及其作用特点一般把一般把DNA 分子切割、分子切割、DNA片段末端修饰和片段末端修饰和DNA片段连片段连接等所用的酶称为工具酶。接等所用的酶称为工具酶。（一）限制性内切酶（一）限制性内切酶限制性内切酶（限制性内切酶（Restriction endonuclease）：）：是一类以环是一类以环状或线形双链状
4、或线形双链DNA为底物，能识别为底物，能识别DNA中的特定核苷中的特定核苷酸序列，并在合适反应条件下，使每条的一个磷酸二酸序列，并在合适反应条件下，使每条的一个磷酸二酯键断开，产生酯键断开，产生-OH和和5 -P基团基团DNA片段的内脱氧片段的内脱氧核酸酶核酸酶(endodeoxyribonuclease)。（四）逆转录酶（五）RNA聚合酶二、目的基因的载体类型及其功能二、目的基因的载体类型及其功能载体（载体（vector）: 能够携带外源基因进入受体细胞能够携带外源基因进入受体细胞的的DNA分子。分子。基因克隆载体必备条件基因克隆载体必备条件：（：（1）受体细胞本来就有）受体细胞本来就有的或
5、受体细胞可以接受的；（的或受体细胞可以接受的；（2）具有能使）具有能使外源外源DNA片段插入的多克隆位点（片段插入的多克隆位点（ MCS，multiple cloning site）；）；（3）能进行自我复制，具有复）能进行自我复制，具有复制原点（制原点（ORI，origin ）；（）；（4）具有选择标记，具有选择标记，承载外源承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛片段的载体进入细胞后，以便筛选克隆子。选克隆子。（一）质粒及其功能（二）噬菌体及其功能（二）噬菌体及其功能（三）考斯质粒（四）动物病毒的载体作用（五）植物寄生菌作为目的（五）植物寄生菌作为目的DNA的载体的载体Ti质粒（质粒（T
6、i plasmid）：）：是一种细菌质粒，存在于土是一种细菌质粒，存在于土壤农杆菌壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens） （革兰氏阴菌）革兰氏阴菌）细胞中细胞中，可可诱导植物产生瘤细胞诱导植物产生瘤细胞( Tumor- inducing, Ti )，冠瘿瘤（冠瘿瘤（grown galltumors)。 诱导植物产诱导植物产生瘤细胞生瘤细胞第二节第二节 DNA重组重组的基本技术步骤的基本技术步骤1、目的基因的制备、目的基因的制备2、目的基因与载体的重组、目的基因与载体的重组3、重组、重组 体导入宿主细胞进行扩增体导入宿主细胞进行扩增4、克隆基因的鉴定、克隆基因的鉴定For
7、eign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromatemeSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeCloning+一、目的基因的制备方法一、目的基因的制备方法基因工程的主要目的基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种。组，获
8、得具有高度应用价值的新物种。为此，必须从现有生物群体中，根据需要分离为此，必须从现有生物群体中，根据需要分离用于克隆的此类基因，这样的基因通常称为用于克隆的此类基因，这样的基因通常称为目的基目的基因因。（一）建立（一）建立DNA文库文库某种生物基因组全部遗传信息的一系列某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这种通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这种包含某生物基因组全部包含某生物基因组全部DNA片段受体菌群体（一套片段受体菌群体（一套克隆）称为这种生物的克隆）称为这种生物的基因组文库基因组文库。 基基因因组组文文库库建建立立顺顺序序基因
9、文库基因文库和和cDNA文库文库的建立的建立组织组织可克隆之可克隆之DNA载体载体DNAcDNAmRNA部分或完全部分或完全酶解酶解DNADNA长度分级长度分级甲基化，双链甲基化，双链接头接头DNADNA与载体连接与载体连接引入大肠杆菌引入大肠杆菌鉴定文库的滴度和特性鉴定文库的滴度和特性扩增后供扩增后供长期储存长期储存筛选出所需筛选出所需要的克隆要的克隆（三）人工合成（三）人工合成DNADNA片段片段（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应（PCR）扩增扩增DNA 1 PCR的原理：的原理：1985年年Mullis发明发明PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增快
10、速扩增DNA的方法。该法模仿体内的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即聚合酶随即以以4种种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补为底物，在引物的引导下合成与模板互补的的DNA新链。重复此过程，新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。以指数方式扩增。扩增的公式为扩增的公式为: Y=(1+X)n 式中式中 y一产量一产量; X-扩增效扩增效率率;n一循环次数。一循环次数。PCR技术技术原理原理示意图示意图靶序列靶序列变性和引变性和引物复姓物复姓
11、循环循环1循环循环2循环循环3变性和引变性和引物复姓物复姓链延伸链延伸Tag酶酶链延伸链延伸二、目的二、目的DNADNA和载体的体外连接和载体的体外连接目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的基因的基因的DNA片段组入合适的克隆载体。片段组入合适的克隆载体。三、将重组的三、将重组的DNADNA复合物导入受体细胞复合物导入受体细胞基因克隆的受体细胞基因克隆的受体细胞：是能摄取外源：是能摄取外源DNA(基因基因)并使并使其稳定维持的细胞。其稳定维持的细胞。目前用作基因克隆受体的原目前用作基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广核生物主要
12、是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广泛应用。泛应用。感受态细胞感受态细胞: 指处于能摄取外界指处于能摄取外界DNA分子的生理状态分子的生理状态的细胞。的细胞。（一）重组（一）重组DNA分子转化分子转化大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体。大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体。转化转化（transformation） ： 携带目的基因的外源携带目的基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程。以质粒为载体。中稳定维持和表达的过程。以质粒为载体。 转转化化（二）（二）噬菌体重组体的噬菌体重组体的转染转染转转染染：通过噬菌体通过噬菌体(病毒病
13、毒)颗粒感染，把颗粒感染，把DNA导入被感导入被感染的受体细胞的过程。染的受体细胞的过程。含目的基因的含目的基因的DNA与噬菌体（病毒）载体的重组与噬菌体（病毒）载体的重组DNA分子导入受体细胞，必须进行体外包装。分子导入受体细胞，必须进行体外包装。四、重组克隆的筛选方法四、重组克隆的筛选方法（一）利用载体的特殊标记进行筛选（一）利用载体的特殊标记进行筛选（二）对菌落原位杂交法鉴定克隆（二）对菌落原位杂交法鉴定克隆 先制备含目的基因的先制备含目的基因的DNA片段的探针片段的探针，随后采，随后采用斑点杂交或用斑点杂交或DNA印迹印迹(southern blotting)等方法进等方法进行鉴定。行
14、鉴定。（1）斑点杂交法）斑点杂交法 提取待鉴定的克隆子的总提取待鉴定的克隆子的总DNA，直接固定在分直接固定在分子杂交的膜上，用含目的基因子杂交的膜上，用含目的基因DNA片段的探针与其片段的探针与其杂交，若出现明显杂交，若出现明显的杂交信号，可认为是真的克隆的杂交信号，可认为是真的克隆子。子。（2）southern杂交法杂交法 斑点杂交、菌落杂交和噬菌斑杂交只能说明克隆子中斑点杂交、菌落杂交和噬菌斑杂交只能说明克隆子中含目的基因，但不能显示目的基因定位在受体细胞内的染含目的基因，但不能显示目的基因定位在受体细胞内的染色体基因组上还是其他基因组上。而色体基因组上还是其他基因组上。而souther
15、n杂交（杂交（DNA印迹）则可对它进行定位。印迹）则可对它进行定位。 （三）免疫学方法鉴定克隆（三）免疫学方法鉴定克隆蛋白质印迹（蛋白质印迹（western blotting）法：提取克隆子法：提取克隆子总蛋白质，经总蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开后，转移到供杂交用的膜上，随后与大小分开后，转移到供杂交用的膜上，随后与放射性同位素或非放射性放射性同位素或非放射性标记物标记的特异性标记物标记的特异性抗体抗体结合，通过结合，通过抗原抗体反应抗原抗体反应，在杂交膜上显，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，表明受体细胞中存在目示出明显的杂交信号，表明受体细胞中存
16、在目的基因表达产物。的基因表达产物。第三节第三节DNADNA重组技术的应用前景重组技术的应用前景基因工程应用大肠杆基因工程应用大肠杆菌生产人类菌生产人类生长激素生长激素二、植物基因工程二、植物基因工程转化基因植物转化基因植物是指将外是指将外源基因转移到植物细胞内、源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。遗传和表达的过程。许多植物基因已经被分许多植物基因已经被分离、克隆。植物基因转化技离、克隆。植物基因转化技术也得到不断发展和完善。术也得到不断发展和完善。应用最多的为农杆菌转化和应用最多的为农杆菌转化和基因枪转化基因枪转化。抗虫稻抗虫稻对照对照对
17、照对照转基因抗棉转基因抗棉铃虫品种铃虫品种受精卵细胞注射受精卵细胞注射转基因牛：受精卵注射法转基因牛：受精卵注射法转移有人类生长转移有人类生长激素转基因鼠激素转基因鼠人类生长激人类生长激素转基因猪素转基因猪四、遗传疾病诊断与基因治疗四、遗传疾病诊断与基因治疗利用利用基因基因诊断法进行遗传疾病诊断，是直接从诊断法进行遗传疾病诊断，是直接从 DNA即基因水平进行诊断即基因水平进行诊断 ， 准确度高，速度快。准确度高，速度快。如进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。如进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。特异基因导入并整合特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者的基因到有遗传缺陷患者的基因组中组中使使疾病
18、得到纠正或治疾病得到纠正或治愈，通常叫做愈，通常叫做基因治疗基因治疗(gene therapy)。方法：减毒的病毒方法：减毒的病毒DNA作载体作载体(retro virus DNA) 构建重组构建重组DNA分分子子用病毒包装物包装后用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者形成的减毒病毒感染患者的细胞的细胞 将正常基因整合将正常基因整合到染色体上。到染色体上。2000年法国年法国Fischer用基因工用基因工程方法治愈患有程方法治愈患有SCID（严重联合严重联合免疫缺陷）遗传免疫缺陷）遗传病的两个婴儿病的两个婴儿(8个月和个月和11个月个月) 。这一工作被认为这一工作被认为是是20世纪人类基世纪人类基因治疗上的重大因治疗上的重大突破。突破。
