1、第三十三章第三十三章 DNA复制复制提纲提纲一DNA复制的一般特征二参与DNA复制的主要酶和蛋白质三DNA复制的详细机制1.以大肠杆菌为代表的细菌基因组DNA的 “-复制”系统2.“滚环复制”系统3.D-环复制系统4.真核细胞的细胞核DNA复制5.古菌的DNA复制四DNA复制的高度忠实性五DNA复制的调节机制DNA复制的一般特征复制的一般特征以原来的DNA两条链作为模板，四种dNTP为前体，还需要Mg2作为模板的DNA需要解链半保留复制需要引物主要是RNA，少数是蛋白质 复制的方向始终是53 具有固定的起点 多为双向复制，少数为单向复制 半不连续性 具有高度的忠实性和进行性 DNA复制可能的三
2、种方式复制可能的三种方式由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验被誉为生物学最美丽的实验Meselson 和和Stahl的证明的证明DNA半保留复制的实验流程半保留复制的实验流程 Meselson 和和Stahl的实验结果的实验结果Meselson与与Stalh在在42年以后在最初年以后在最初他们相遇的一颗树下重逢时的合影他们相遇的一颗树下重逢时的合影Taylor以蚕豆根尖细胞为材料、使用放射性同以蚕豆根尖细胞为材料、使用放射性同位素证明真核细胞位素证明真核细胞DNA也是半保留复制的实验。也是半保留复制的实验。某些生物某些生物DNA复制的引物序列复制的引物序列 证明证明DNA复制
3、的方向始终是复制的方向始终是53的末端终止实验的末端终止实验 DNA复制起始区的特征复制起始区的特征由多个短的重复序列组成；能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别；通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目低于GC碱基对。细菌和酵母细菌和酵母DNA复制起始区的特征复制起始区的特征复制叉的结构复制叉的结构电镜下真核生物电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构的多个复制叉结构John Cairns的实验的实验复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的3H-dT的培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂量的3H-dT的培养基中继续培养一段时间；最后，收集细胞，小心地裂解
4、以抽取其中的染色体DNA进行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段DNA属于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。Cairns证明大肠杆菌证明大肠杆菌DNA双向复制的实验双向复制的实验Reiji Okazaki的实验的实验脉冲标记目的在于即时标记在特定时段内合成的DNA。脉冲追踪目的则是要弄清那些被标记上的DNA片段后来的去向。 Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验的脉冲标记和脉冲追踪的实验Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析的脉冲标记和脉冲追踪
5、的实验结果分析Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。 参与参与DNA复制的主要酶复制的主要酶和蛋白质的结构与功能和蛋白质的结构与功能DNA聚合酶DNA解链酶单链结合蛋白DNA引发酶DNA拓扑异构酶DNA连接酶端聚酶（真核生物特有） DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的全名是依赖于DNA的DNA聚合酶，就是以DNA为模板，催化DNA合成的聚合酶。DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶，该酶的许多性质直接决定了DNA复制的一些基本特征。D
6、NA聚合酶聚合酶反应通式： Mg2+ DNA + 引物-OH + dNTP DNA/引物-dNMP + PPi 5 3 随后的随后的 PPi迅速水解驱动反应的进行迅速水解驱动反应的进行细菌DNA 聚合酶 DNA pol I,II,III,IV和V真核生物DNA 聚合酶 DNA pol ,和以及更多Arthur Kornberg (1957)大肠杆菌细胞蛋白质提取物大肠杆菌细胞蛋白质提取物+DNA模板模板有无有无DNA合成合成?- dNTPs- Mg2+ (辅助因子辅助因子)- ATP (能源能源)- 游离的游离的3OH端端 (引物引物)体外测定体外测定DNA复制复制纯化得到纯化得到DNA聚合酶
7、聚合酶I 目前是目前是Standford大大 学医学院的终身教授学医学院的终身教授一条肽链至少具有三种不同的酶活性！不可思议!l53外切核酸酶l 35外切核酸酶l 53DNA聚合酶DNA聚合酶聚合酶IDNA聚合酶折叠成几个不同的结构域聚合酶折叠成几个不同的结构域 Hans Klenow 使用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理DNA聚合酶I，结果得到大小两个片段：大片段被称为Klenow片段或Klenow酶，含有大小两个结构域，其中小结构域具有35外切酶活性，大结构域具有53聚合酶活性；小片段只有53外切酶活性。 Tom Steitz等得到了Klenow酶的晶体结构 Klenow酶的晶体结构模型酶的晶
8、体结构模型 DNA聚合酶I所具有的53聚合酶和53外切酶活性的联合使用可导致一个具有切口的DNA分子发生切口平移。如果在切口平移反应中加入放射性标记的dNTP，则放射性标记的核苷酸会参入到重新合成的DNA链上，从而使DNA的一条链带上同位素标记。 切口平移切口平移1969年，John Cairns等人分离到一种大肠杆菌突变株其DNA聚合酶I活性只有野生型的1% (polA基因突变)突变体对UV辐射极为敏感其他一切正常细胞照常分裂结论结论: DNA聚合酶I不是大肠杆菌DNA复制的主要聚合酶DNA 聚合酶聚合酶I是不错，然而是不错，然而. J 速度太慢J 酶量太多J 进行性不够高聚合酶的进行性是指
9、一种聚合酶从与DNA模板结合到与模板解离的这段时间内催化参入到DNA链上的核苷酸数目。显然，DNA聚合酶的进行性越高，催化复制的效率就越高。聚合酶I的进行性平均值为20nt50nt，远远低于DNA复制的实际值。结论：一定有其他结论：一定有其他DNA聚合酶。生化学家很聚合酶。生化学家很快从快从polA突变体纯化到新的突变体纯化到新的DNA聚合酶聚合酶其他线索其他线索. . 在多种需要短DNA合成的过程中起作用 在DNA修复中起主要作用 在DNA复制中，去除RNA引物，并填补随后留下的空缺。DNA聚合酶聚合酶I的功能究竟是什么？的功能究竟是什么？对对DNA聚合酶聚合酶I更多的认识更多的认识为什么具
10、有35外切核酸酶? 充当校对的功能去除复制中错配的核苷酸，然聚合酶有机会重新合成正确配对的核苷酸聚合酶的活性中心和3-外切酶活性中心切换？添加碱基还是切除碱基？DNA聚合酶的聚合和校对聚合酶的聚合和校对 已在大肠杆菌中发现已在大肠杆菌中发现5种不同的种不同的DNA聚合酶聚合酶 1.DNAP I: 占聚合酶总活性的90%2.DNAP II: 在DNA修复中起作用(1999年得到证明)3.DNAP III: 主要的DNA复制酶 4.DNAP IV: 在DNA修复中起作用（在1999年发现）5.DNAP V:在DNA修复中起作用（在1999年发现） DNA聚合酶家族聚合酶家族“真正真正”的大肠杆菌的
11、大肠杆菌DNA复制酶复制酶快：1 000nt/秒/酶 进行性高： 500 000nt酶量合适精确温度敏感型突变体只能生存在允许温度（30）下，当温度上升到限制温度（45）时，大肠杆菌难以生存。究其原因，是因为编码聚合酶III 亚基的polC基因发生了突变，致使该酶对温度变化极为敏感。当环境温度超过30以后，就很容易变性而丧失活性，这时DNA复制不能正常进行；而在允许温度下，该酶的活性是正常的，DNA复制也很正常。 DNA聚合酶聚合酶III 其结构十分复杂其结构十分复杂!大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶III的亚基组成和功能分工的亚基组成和功能分工大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶III的结构
12、模型的结构模型DNA聚合酶聚合酶III全酶的滑动钳夹住双螺旋全酶的滑动钳夹住双螺旋DNA DNA聚合酶聚合酶I、II和和III的比较的比较性质IIIIII结构基因polApolBpolC分子量（k）10390130分子数/细胞40010010Vmax(参入的nt/秒)16202525010003-外切酶活性5-外切酶活性进行性（nt）320010 000500 000突变体表现型UV敏感、硫酸二甲酯敏感无DNA复制温度敏感型生物功能DNA修复、RNA引物切除DNA修复染色体DNA复制真核细胞的真核细胞的DNA聚合酶聚合酶已在真核细胞中发现至少15种以上的DNA聚合酶，除了5种发现较早的DNA聚
13、合酶、和以外，其它几种DNA聚合酶如聚合酶、和都有相关的报道，这些新发现的DNA聚合酶一般缺乏3-外切酶的活性（除外），因此没有校对的功能，它们主要参与DNA的跨越合成，以克服损伤对DNA复制的不利影响。 真核细胞真核细胞DNA聚合酶聚合酶、和和的性质和功能的性质和功能性质DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶亚细胞定位细胞核细胞核线粒体基质细胞核细胞核引发酶活性有无无无无亚基数目41424催化亚基的大小（k）16018540125125210230或125140对dNTPs的Km值(M)251040.524内在的进行性中等低高低高在PCNA存在时的进行性中等低高高高3-
14、外切酶活性5-外切酶活性对3,5-ddNTP的敏感性低高高低中等对阿拉伯糖CTP的敏感性高低低高高对四环双萜的敏感性高低低高高生物功能细胞核DNA复制细胞核DNA修复线粒体DNA复制细胞核DNA复制核DNA复制和修复其他真核细胞其他真核细胞DNA聚合酶聚合酶 真核真核DNA聚合酶聚合酶和和在跨损伤合成中的作用在跨损伤合成中的作用 真核细胞真核细胞DNA聚合酶聚合酶由由PCNA三个亚基构成的滑动钳结构三个亚基构成的滑动钳结构 DNA解链酶解链酶 DNA解链酶是一类催化DNA双螺旋解链的酶。它几乎参与和DNA有关的一切代谢过程，包括DNA复制、转录、修复和重组。 任何一种DNA解链酶都能够结合DN
15、A，这种结合与DNA序列无关，这是解链酶作用的前提。大多数解链酶优先结合DNA的单链区域。 解链酶除了能够结合DNA以外，还能够结合NTP，并同时具有内在的依赖于DNA的NTP酶活性。 所有的DNA解链酶都具有移位酶活性。其移位酶活性使得它沿着被结合的DNA链单向移动，以不断地解开DNA双链区域。 大肠杆菌大肠杆菌DnaB蛋白的解链酶活性蛋白的解链酶活性 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（SSB）是一种专门与DNA单链区域结合的蛋白质，为DNA复制、修复和重组的必需成分。SSB本身并没有任何酶的活性，但通过与DNA单链区段的结合在DNA复制、修复和重组中发挥以下几个方面的作用：（1）暂时维持D
16、NA的单链状态，防止互补的单链在作为复制模板之前重新退火成双螺旋；（2）防止DNA的单链区域自发形成链内二级结构，以消除它们对DNA聚合酶进行性的影响；（3）包被DNA的单链区段，防止核酸酶对DNA单链区域的水解；（4）刺激某些酶的活性。 大肠杆菌大肠杆菌SSB与单链与单链DNA结合的协同效应结合的协同效应 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶是一类通过催化DNA链的断裂、旋转和重新连接而直接改变DNA拓扑学性质的酶。此类酶不仅可以解决在DNA复制、转录、重组和染色质重塑过程中遇到的拓扑学障碍，而且能够细调细胞内DNA的超螺旋程度，以促进DNA与蛋白质的相互作用，同时防止DNA形成有害的过度
17、超螺旋。 按照DNA链的断裂方式，拓扑异构酶被分为I型和II型。I型在作用过程中，只能切开DNA的一条链，而II型均为寡聚体蛋白，在作用过程中同时交错切开DNA的两条链，并能在消耗ATP的同时将一个DNA双螺旋从一个位置经过另一个双螺旋的裂口“主动运输”到另外一个位置。 II型拓扑异构酶主要参与DNA复制，既可以在DNA分子中引入有利于复制的负超螺旋，又可以及时清除复制叉前进中形成的正超螺旋，还能分开复制结束后缠绕在一起的两个子代DNA分子，其催化的反应依赖于ATP。 DNA复制过程中形成的正超螺旋复制过程中形成的正超螺旋 DNA拓扑异构酶催化的转酯反应拓扑异构酶催化的转酯反应 II型型DNA
18、拓扑异构酶的作用机理拓扑异构酶的作用机理 DNA引发酶引发酶是一种专门用来起动或引发DNA合成的酶。由于DNA聚合酶本身不能起动多聚物的合成，只能延伸已经被起动的多聚物，因此，引发酶是DNA复制所必需的。因为DNA复制的半不连续性，故引发酶在前导链上只需引发一次，而在后随链上则需用引发多次。切除引物的酶切除引物的酶RNA引物只是用来起动DNA的复制，它最终并不存在于被复制的DNA分子之中，迟早要被除去，实际上，细胞内有专门的酶负责切除RNA引物。原核细胞内切除RNA的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H。真核细胞负责切除RNA引物的酶是RNase H/FEN1或FEN1/Dna2。 DNA连接酶连
19、接酶 是一类催化一个双螺旋DNA内相邻核苷酸3-羟基和5-磷酸甚至两个双螺旋DNA两端的3-羟基和5-磷酸发生连接反应形成3,5-磷酸二酯键的酶。 DNA连接酶在DNA复制过程中的作用是“缝合”后随链上相邻的冈崎片段，使不连续合成的后随链成为一条连续的链。 DNA连接酶在催化连接反应时需消耗能量。根据能量供体的性质，连接酶可以分为两类：第一类使用 NAD+，第二类使用ATP。细菌的DNA连接酶属于第一类，真核细胞、古菌、病毒和噬菌体的连接酶属于第二类。 DNA连接酶的作用机理连接酶的作用机理 尿嘧啶尿嘧啶-DNA糖苷酶糖苷酶尿嘧啶-DNA糖苷酶是一种专门用来切除出现在DNA链上非正常尿嘧啶碱基
20、的水解酶。尿嘧啶出现在DNA链上有两种原因：一是在DNA复制过程中，细胞中存在的dUTP代替dTTP直接进入新合成的DNA链；二是DNA分子中的C发生自发脱氨基作用。 端聚酶的结构与功能端聚酶的结构与功能端聚酶也称为端粒酶，由蛋白质和RNA两种成分组成，其中蛋白质具有逆转录酶的活性，其三维结构与其它逆转录酶有明显的相似性，而RNA含有1.5拷贝的端粒DNA重复序列，这一部分序列作为逆转录酶的模板。不同来源的端聚酶在RNA长度上变化很大，但它们都形成特定的二级结构，作为模板的那一部分序列处于单链状态，以方便它与端粒区的重复序列结合，并有效地充当逆转录的模板。几种真核生物的端粒重复序列几种真核生物
21、的端粒重复序列物种名称重复序列四膜虫、草履虫和纤毛虫T2G4酵母(TG)13TG23拟南芥T3AG3人T2AG3端聚酶的结构模型端聚酶的结构模型 端聚酶的作用机理端聚酶的作用机理 端粒酶活性与细胞分裂能力的关系端粒酶活性与细胞分裂能力的关系 以大肠杆菌为代表的以大肠杆菌为代表的“-复制复制”系系统统 DNA复制的起始起始于OriC的识别，结束于引发体的形成 DNA复制的延伸 （1）复制体的形成（2）前导链合成（3）后随链合成（4）前导链合成和后随链合成之间的协调 DNA复制的终止和子代DNA的分离 参与大肠杆菌参与大肠杆菌DNA复制的主要蛋白质或酶的名称和功能复制的主要蛋白质或酶的名称和功能蛋
22、白质名称功能DNA旋转酶II型拓扑异构酶，负责清除复制叉前进中的拓扑学障碍SSB单链结合蛋白DnaA蛋白复制起始因子，识别复制起始区OriCDnaB蛋白DNA解链酶DnaC蛋白招募DnaB蛋白到复制叉DnaG蛋白DNA引发酶，引物合成DnaT蛋白辅助DnaC蛋白的作用HU蛋白类似于真核细胞的组蛋白，结合DNA并使DNA弯曲PriA蛋白引发体的装配PriB蛋白引发体的装配PriC蛋白引发体的装配DNA聚合酶IIIDNA链的延伸DNA聚合酶I切除引物，填补空隙DNA连接酶缝合相邻的冈崎片段DNA拓扑异构酶IV分离子代DNATus复制终止大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起始区的结构复制起始区的结构 大肠杆
23、菌大肠杆菌DNA复制过程中引发体的形成复制过程中引发体的形成 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制过程中复制体的形成复制过程中复制体的形成 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制的延伸复制的延伸 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制终止区的结构复制终止区的结构 子代子代DNA的分离的分离 “滚环复制滚环复制” 某些噬菌体（如M13和X174）DNA和一些小的质粒（如枯草杆菌内的pIM13质粒）在宿主细胞内通过滚环复制方式扩增DNA。 真核细胞的某些基因，如某些两栖动物卵母细胞内的rRNA基因和哺乳动物细胞内的二氢叶酸还原酶基因，在特定的情况下通过滚环复制在较短的时间内迅速增加目标基因的拷贝数。 滚环复制滚环复制 D-环复制环
24、复制线粒体和叶绿体DNA通常以D-环的方式进行复制。少数病毒（如腺病毒）也进行D-环复制 。催化线粒体DNA复制的酶是DNA聚合酶，两条链的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成冈崎片段，因此都是连续合成。 两条子链的合成在时间上不同步。 D环复制环复制 真核细胞的真核细胞的DNA复制复制 真核细胞的DNA复制在很多方面与细菌极为相似，但也有几点不同于细菌的地方：（1）需要解决核小体和染色质结构对DNA复制构成的障碍；（2）复制叉移动的速度远低于细菌；（3）具有多个复制子，这可以弥补复制叉移动速度低对整个DNA复制速度的制约；（4）冈崎片段的长度小于细菌；（5）复制被限制在细胞周期的S期，并受
25、到严格的调控；（6）在第一轮复制结束之前不能进行第二轮复制，细菌在第一轮复制还没结束的时候就可以进行第二轮复制；（7）需要端聚酶解决染色体DNA末端复制问题（8）复制终止没有特定的像大肠杆菌Ter序列的终止区。 真核细胞真核细胞DNA复制叉的结构模型复制叉的结构模型 SV40的的 DNA复制模型复制模型 线形线形DNA末端复制问题的解决末端复制问题的解决C 使用端聚酶；C 将线形DNA暂时转变为环形DNA；C 经重组形成串联体；C 滚环复制；C 使用蛋白质作为引物。T7噬菌体噬菌体DNA末端末端DNA的复制的复制 古菌的古菌的DNA复制复制在DNA复制上，古菌与细菌相似的是，它也不需要也没有端
26、聚酶，因为其染色体DNA是环状，无端粒结构，而在其他方面更像真核生物，主要表现在：DNA模板与组蛋白形成核小体，而核小体结构对复制会产生一定影响；许多古菌具有多个复制起始区；参与复制的许多蛋白质和酶在结构与功能上非常接近真核生物。例如，参与DNA复制的主要聚合酶与真核生物一样，为B类，而细菌使用的是C类 。参与复制的蛋白质和酶细菌真核生物古菌起始蛋白DnaAORCOrc1/Cdc6解链酶DnaBMCM复合物MCM解链酶转载物DnaCCdc6+Cdr1Orc1/Cdc6DNA聚合酶C类B类B类滑动钳DNA聚合酶III的亚基PCNAPCNA滑动钳转载物亚基复合物RF-CRF-CDNA连接酶依赖于N
27、AD+依赖于ATP依赖于ATP切除引物的酶DNA聚合酶I/RNaseH RNaseH/ FEN1RNaseH/ FEN1端聚酶无有无细菌、古菌和真核生物参与细菌、古菌和真核生物参与DNA复制的主要蛋白质和酶的比较复制的主要蛋白质和酶的比较 DNA复制的高度忠实性复制的高度忠实性C 四种dNTPs浓度的平衡C DNA聚合酶的高度选择性C DNA聚合酶的自我校对C 错配修复C 使用RNA作为引物绝绝 句句复错不要紧，只要校对真，错了我一个，还有后来酶。DNA复制的调节机制复制的调节机制 DNA复制的调控主要集中在起始阶段，现分别介绍原核细胞和真核细胞的DNA复制的起始过程是如何受到调控的。 细菌DNA复制起始的调控 在大肠杆菌，由Dam甲基化酶和DnaA蛋白控制。 真核细胞DNA复制起始的调控（1）由执照因子控制的正调控（2）由增殖蛋白控制的负调控甲基化对细菌甲基化对细菌DNA复制的调节复制的调节 酵母细胞酵母细胞DNA复制的正调控复制的正调控
