1、Summary from Global Micro Training Material - 无菌操作与GLP5/26/20221学习目的Explain the importance of asepsis in the micro lab / 无菌的重要性Explain the methods used to sterilize equipment / 设备灭菌的方法Identify ways to prepare aseptic workplace / 无菌工作区域的准备Identify practice for aseptic technique during testing process
2、 / 实验过程中的无菌技术Explain how to set up a lab so it promotes aseptic practice and safety / 实验室布局Identify ways to ensure safety while working in a lab / 安全工作5/26/20222主要内容1.介绍2.无菌技术3.无菌的过程4.实验的无菌技术5.实验室布局6.GLP要点7.安全工作5/26/20223无菌的重要性第一章在微生物实验室, 必须达到一定程度的无菌状态, 免于微生物污染. 假如在一个肮脏的实验室或者早先打翻过样品的地方作微生物实验, 引入新的微生
3、物污染样品的几率是很大的.微生物的实验可以分为两大部分: 准备培养基和样品检验. 事实上, 保持整个实验室清洁是非常重要的, 这样就不用在灭菌前担心太多了, 然而, 灭菌后必须保证样品或者培养基免受污染. 其实, 可以把灭菌想像成”一扇门”, 在培养基中或者一些设备比如吸管的微生物都在灭菌过程中被杀死了, 没有微生物困扰实验了. 必须保证灭菌后的环境(门后的部分)的洁净, 杜绝灭菌后的培养基和设备受到污染. 5/26/20224无菌技术 高压湿热灭菌 (Autoclave)要点要点描述描述原理在压力下产生的湿热的蒸汽杀死微生物的营养体和孢子. 密封灭菌锅必须密闭以阻隔外部空气, 避免空气的存在
4、会影响压力并降低灭菌锅里面的温度灭菌压力在灭菌国内, 合适的灭菌温度是通过压力达到的, 压力对于灭菌没有效用但是使蒸汽温度上升. 对于标准操作来说, 15lbs/inch2时的1210C并赶走所有空气可以达到灭菌的效果灭菌时间当到达一定的温度和压力时, 需要保持一定的时间来达到效果, 为了杀灭微生物, 1210C必须保持至少15分钟培养基的灭菌大部分情况下, 实验室配置培养基后应灭菌, 灭菌时应根据供应商指导, 使用合适的温度时间; 有些培养基不适合灭菌的.器皿的灭菌当灭菌那些器皿时, 需要考虑使用数量, 比如, 一天用10根吸管, 在灭菌时, 一般就可以以10根为一包, 这样可以减低器皿在使
5、用过程中遭受微生物的污染的可能性.灭菌条在灭菌过程中, 可以用灭菌条来监控效果, 灭菌条在灭菌前是有颜色的, 灭菌后会变成黑色. 重新灭菌假如一次灭菌无效, 可以重新进行灭菌过程, 但是, 培养基是不可以进行第二次灭菌的, 应抛弃.储存灭菌完成后, 培养基和器皿应妥善储存. 一般来说, 培养基应存放于避光的洁净空间, 同时应参照供应商的指示. 第二章5/26/20225无菌技术 过滤 (Filtration)要点要点描述描述简述物理分离方法, 使用高效过滤将微生物从液体培养基分离使用于对热敏感的培养基和化学品, 比如, 当需要酒石酸来调节OSA的酸度时由于不需要加热和冷却过程, 过滤比高温湿热
6、灭菌省时间, 过滤头0.2微米的过滤头可以分离所有的细菌营养体, 把它安装在针筒末端.第二章5/26/20226无菌技术能够保持灭过菌的培养基, 器皿免受微生物污染保证实验的有效性第二章5/26/20227无菌过程注意点要点要点描述描述综述一旦培养基或者器皿经过灭菌过程, 这种灭菌状态应保持直到实验结束. 区域最好能把培养基准备区域(门外)和实验区域(门内)分开. 关于实验室布局在第五章讨论工作台面工作前必须消毒, 可以用70%的酒精, 也可以用含氯的消毒剂. 在第六章具体讨论消毒时间不管使用何种消毒剂, 需要提供充分的消毒时间来杀灭微生物, 一般5-10分钟. 可以用纸巾擦干表面洁净台必须有
7、2个光源: 普通照明用和杀菌紫外光. 紫外灯用于保持工作台面免于微生物污染. 在使用前仍然需要使用消毒剂清洁.摆放应该有好习惯把工作桌面的物品摆放好, 把移动放到最低限度, 避免带来污染镊子如果使用薄膜过滤法, 需要准备一个小烧杯并有少量酒精, 镊子不用时就放在杯子里培养基培养基使用前, 应该有相关日期, 比如配置日期, 或者实验室收到日期(直接使用的培养基). 假如没有所需日期, 这个培养基不能使用.实验服穿着干净的实验服, 袖子应卷起至肘部以避免碰到培养基或样品带来污染, 当然, 做实验前要洗手.第三章5/26/20228实验的无菌技术注意点 前采样采样个人卫生个人卫生酒精灯酒精灯样品应无
8、菌采得使用无菌采样袋或者采样瓶采样员应戴防护手套, 在采样前烧采样口样品容器应紧闭并安全储存.万一培养基或者样品溅到实验服上, 应在做完一个实验后换上干净的咳嗽或者鼻塞可能会带来微生物并影响实验, 应戴好防护手套面罩. 在第六章具体讨论使用本森灯或者酒精灯, 在实验前点燃火焰在实验区域产生一个防护层, 可以防止那些悬浮在空气中的微生物掉落在工作台面上或者培养基上.第四章5/26/20229实验的无菌技术注意点 中开瓶开瓶瓶口瓶口培养皿培养皿开瓶前, 应用清洁剂的纸巾清洁瓶盖和附近区域, 除去盖子上可能留存的微生物盖子打开后, 玻璃瓶口应进行灭菌, 可以在酒精灯上方旋转瓶口和螺纹, 一般2-3秒
9、. 当打开培养皿时, 不能完全移除盖子, 而应该保持在培养皿的上侧, 从而能够倒入培养基或者样品, 这样可以减少空气灰尘或者微生物的污染;倒完培养基或者样品后, 瓶口重新过火, 盖盖子, 用消毒剂清洁. 第四章5/26/202210实验的无菌技术注意点 中滤膜滤膜 镊子镊子打开薄膜包装, 绝对不能碰到薄膜! 用镊子把薄膜移除包装并放到过滤头上, 过滤的漏斗不能完全移开, 只需移开一点点放入滤膜即可过滤完后, 用镊子把滤膜转到培养皿中, 放置于中间用镊子转移滤膜过火时, 拿住镊子的尾部, 放到火焰上, 保持一下能够到火就好, 时间太长会在尖部结碳 拿镊子的时候, 尾部向上直至烧完.第四章5/26
10、/202211实验的无菌技术注意点 后实验结束实验结束打扫打扫废弃物废弃物实验结束后, 培养皿放入培养箱; 剩余的培养基可以放回储存区域, 盖子必须盖紧 抛弃废弃物, 比如样品袋; 可回用的物品放在远离工作区域的地方以回收, 清洗, 灭菌.用含有消毒剂的纸巾清洁工作台面. 在实验过程中暴露于微生物的物品应作为有害废弃物这些废弃物可能含有微生物并致病; 假如含有致病菌可能会产生公共卫生的事件.最好废弃物能够进行湿热灭菌第四章5/26/202212实验室布局一个设计合理的实验室能提供一个合格的环境以支持实验能够安全有效地进行. 首先, 需要为实验室选择一个合适的物理位置:远离其他操作区域, 比如,
11、 生产或者储运没有从其他区域进入实验室的直接入口实验室必须是微生物实验专用实验室应分为准备区域和测试区域. 湿热灭菌锅, 作为这两个区域的典型的分隔(门). 这种分隔保证了能有效使用无菌技术并帮助防止培养基和样品的交叉污染.假如两个区域无法分开, 实验室应根据实验准备和测试两个行为来区分不同的区域.第五章5/26/202213实验室布局 要点通风和气流通风和气流安保安保工作区域工作区域微生物实验室应该有单独的通风系统, 与其他操作区域的空气供给分开;房间应该是负压的, 这表示实验室里面的空气永远是向内流动的;空调系统的排气必须直接排出实验室, 空调系统应定时清洗, 并关注空气过滤器的清洁实验室
12、应该是限制进入的, 可以是卡片控制或者其他方式, 只有那些被允许进入实验室的人员才能进入实验室人员应该有充足的工作区域, 从GLP标准来说, 每人应有20平方米的区域. 充足的工作区域可以避免工作中人员的碰撞, 也避免了交叉污染. 可编辑第五章5/26/202214实验室布局 要点易清洁易清洁门和窗门和窗照明照明实验室的墙面, 屋顶和门都应该是平滑的, 光洁易于清洗消毒的;墙的接缝包括强和墙之间, 强和地面之间应该是弧形的任何地方都应该不能聚集灰尘, 例如窗台或者窗帘柜子应该是可移动的或者是不着地的以方便清扫. 窗户应密封, 门应紧闭以避免外面空气进入实验室如果窗户坏了或者有裂缝额, 应及时报
13、修, 并尽快修好实验室应有充足的照明, 包括不间断电源或者备用发电机. 第五章5/26/202215实验室布局设计合理的实验室可以降低交叉污染的风险并营造一个让无菌设计合理的实验室可以降低交叉污染的风险并营造一个让无菌操作和其他操作和其他GLPGLP规范能很好实施的环境规范能很好实施的环境第五章5/26/202216GLP要点 工作区域要点要点描述描述总体安排实验前应做好仪器, 试剂和培养基的所有准备工作, 这样可以合理利用时间并得到稳定的实验结果桌面安放多余的培养皿, 烧瓶或者滤纸可能会干扰实验并带来潜在的溅出, 打碎或者交叉污染. 实验前消毒在配制培养基或者开始试验前, 应该清洁并消毒工作
14、桌面. 最佳的消毒剂是70%的酒精溶液, 含氯水的溶液, 或者公司批准的其他消毒剂. 最好使用一次性的消毒纸巾, 不能使用毛巾或者海绵. 清洁后, 应等待几分钟以使有充分的时间杀灭微生物, 可以用纸巾擦干.试验后消毒实验结束后, 彻底清洁工作区域, 仍然使用70%酒精溶液或者公司批准的其他消毒剂, 保持一段时间, 然后擦干有害废弃物的处置必须有效管理微生物的有毒废弃物, 任何和微生物培养或者培养基相关的物品都应被看作有害物质; 因为他们可能含有致病菌, 需要小心处理废弃物的灭菌湿热灭菌是最简单也是最有效的处理污染物质和有害物质的方法. 用过的培养皿应放在灭菌袋中. 灭菌后, 可以当作一般废弃物
15、处理重复使用器皿的灭菌当需要对小件物品(比如移液管)灭菌时, 可以根据实际用量分组包装. 湿热灭菌后, 袋包装冷却并保存.避免浪费合理安排是非常重要的; 实验室工作需要精准, 但是有时候我们也需要快速工作, 因为花非常多时间会延长设备, 培养基, 或者样品暴露在环境中的时间. 把需要用的物品放在手边可以用的地方可以节约时间并提高工作的有效性. 第六章5/26/202217GLP要点 工作区域桌面安放实例样品采集工具未使用培养皿已使用培养皿样品和器皿工作区域已使用器皿第六章5/26/202218GLP要点 洁净工作台简介简介使用使用监控监控洁净工作台提供了控制来自环境的污染并提供工作区域的洁净空
16、气. 洁净空气吹向工作区域, 同时, 可以避免外部空气进入工作区域使用时, 紫外光线(或者紫外灯)应关闭, 但是使用后应打开. 如果紫外灯没有打开工作台没有开启, 工作台不能开始使用; 必须清洁工作台, 开启电源并打开紫外灯, 保持30分钟. 洁净工作台需要进行日常的确认, 一般有第三方公司进行. 第六章5/26/202219GLP要点 个人卫生要点要点描述描述概述应确保样品和培养基没有被任何可能被衣服或者身体带来的灰尘或者微生物污染. 工作服在实验室, 必须穿合适的, 干净的工作服. 如果工作服被培养基或者样品污染, 应及时换下. 实验室也可以有一个专门存放使用过的和被污染的工作服, 也应该
17、准备充足的干净的工作服, 同时, 也应该记住工作服不能穿出实验室头发假如你有长发, 应盘起或夹住以避免发尾接触培养基或者样品. 有些实验室需要发帽来避免可能污染, 不要在实验室梳头. 洗手应该在接触样品或者培养基前后彻底洗手, 同时确保清洗指甲和缝隙. 使用温水和洗手液, 并使用纸巾擦干. 指甲应保持清洁和光滑, 最好不留长指甲, 不要在实验室剪指甲关注手和手臂的安全如果手上有伤口, 必须用防水贴或者绷带包裹; 如果手或者手臂有伤口感染, 在愈合前不能在微生物实验室工作首饰和服装在无菌操作培养基或者样品的时候应脱去戒指, 耳环, 项链等物品. 各种蓬松的衣物, 比如长丝巾或领带, 可能或碰到样
18、品或者培养基, 也应该在进入实验室前脱去. 不要穿露脚趾的鞋.潜在的污染物不应该携带潜在的污染物, 比如饮料和食物, 手机, 或者其他媒体播放机进入实验室. 实验室禁止吸烟.个人卫生的益处良好的个人卫生微生物实验室的重要因素, 可以避免各种对于实验的负面影响.第六章5/26/202220安全工作一个有效的实验室应该是一个安全的实验室. 假如疏忽安全的话, 许多每天使用的培养基或者设备会产生危害. 减少这些危害带来的风险不仅仅保护了工作场所, 更重要的是, 保护了自身免于危险利用常识并遵照GLP相关的安全规则, 我们就能把由于微生物相关的行为带来的潜在危害降低到最小. 第七章本章包含如下内容安全
19、用品移动操作明火湿热灭菌锅洁净台样品操作5/26/202221安全工作 (1)安全用品安全用品移动移动安全用品包含口罩, 手套和眼部防护. 口罩防止培养基和样品受到污染, 可能来自于咳嗽或者鼻涕; 根据当地的要求和习惯, 每个实验室会有不同的要求戴手套是为了防止培养基或者其他刺激性物质接触皮肤; 在从湿热灭菌锅内取出容器或则器皿时, 需要戴防热手套在配置培养基和实验中佩戴防护眼镜是一个很好的习惯, 能够购买带有屈光度的防护眼镜为佳. 当移动培养基或者样品时, 应小心注意以避免溅出或者泼出; 突然的移动会产生安全危害或者导致实验无效不要使用夸张的动作或者行为同时, 不要把任何东西, 比如吸管,
20、放到嘴里第七章5/26/202222安全工作 (2)明火明火湿热灭菌锅湿热灭菌锅实验中需要用到酒精灯或其他明火, 但是假如使用不当会带来比较高的安全危险确保酒精灯不用时完全关闭, 当有阀门时经常检查垫圈是否有裂痕或者泄露.操作酒精灯时, 应确保火焰不会接触衣物或者皮肤. 可燃物品, 比如记录本, 应远离火焰以避免意外点燃. 同时, 要注意可燃液体的容器. 每次使用后应盖好盖子并远离酒精灯火焰使用火焰进行灭菌工作时, 可使用镊子. 把镊子放在含有95%酒精的烧杯中, 使用时, 把镊子在火焰上灼烧1-2秒, 移开镊子并等待火焰熄灭. 拿着镊子是尖端应向下, 使热的酒精不会流到手上. 湿热灭菌锅使用
21、高压下产生的蒸汽, 温度可达1210C, 杀死了微生物, 同样可以带来人类组织的灼伤, 所以必须特别小心地操作; 如此高的温度以及蒸汽能带来极大的潜在伤害, 即使是残留的蒸汽也能带来很大的危险. 打开灭菌锅时需要特别小心, 站在边上避免面对热量和蒸汽, 缓慢的打开门, 同时, 戴好防热手套. 把需要灭菌的培养基和器皿平均放置在托盘上, 大的物品放在边上, 确保物品不会相互碰撞. 这样可以是热量均匀扩散并平衡整个托盘第七章5/26/202223安全工作 (3)洁净台洁净台样品操作样品操作在洁净台工作时必须关闭紫外灯. 紫外光线是危险的,不要把手或者手指放在紫外灯下, 以免灼伤皮肤; 不要直接看紫
22、外光线以免损伤眼睛培养基和样品: 用火焰灼烧瓶口时, 停留4-5秒, 旋转使整个表面都能被灼烧, 不要停留太久, 不要溅出样品或者培养基假如样品是瓶装的, 不要直接灼烧以免爆开. 可以取2个烧杯, 倒入70%酒精, 把瓶子倒置放入一个烧杯中, 使盖子和瓶颈的2.5厘米处能浸没在酒精中, 拿出瓶子用干净的布擦干; 同理, 放入第二个烧杯, 拿出瓶子直立待酒精自然蒸发. 开瓶时应特别小心不能污染样品, 可以用消毒纸巾开旋盖的瓶子; 用浸没在95%酒精并灼烧的开瓶器打开压盖瓶. 打开瓶子后, 使用相同的方法灼烧瓶口, 并确保用于消毒的酒精完全挥发.拉罐可以使用相同的程序或者用含70%酒精的棉球擦拭顶部, 假如罐子必须用开罐器, 这个开罐器操作同开瓶器. 无菌包装的产品用含70%酒精的棉球擦拭.第七章5/26/202224
