1、ELISA ELISA 知识简介知识简介1.ELISA的原理的原理2.ELISA的类型的类型3.试剂准备试剂准备：免疫吸附剂免疫吸附剂 结合物结合物 酶底物的准备酶底物的准备 4.对照设定对照设定5.标本的采取和保存标本的采取和保存6.结果判断结果判断 ELISA ELISA是一种免疫测定（是一种免疫测定（immunoassayimmunoassay，IAIA） 。基。基础础: :抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由
2、此进行定性的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。或定量分析。1.ELISA的原理的原理酶免疫测定类型酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在这种固相酶免疫测定方法在19711971年最初建立时称为酶联年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbentEnzyme Linked ImmunoSorbent AssayAssay），简称），简称ELISAELISA。酶免疫技术酶免疫技术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测
3、定液相酶免疫测定1.11.1抗原抗体反应抗原抗体反应 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗体的亲和力（抗体的亲和力（affinityaffinity），可以用平衡常数），可以用平衡常数K K表表示：示：K=AgK=AgAbAbAgAbAgAb ,Ag ,AgAbAb的解离程度与的解离程度与K K值有值有关。关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不
4、易解离。间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。1.1.21.1.2特异性特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。1.1.31.1.3最适比例最适比例 1.1.41.1.4敏感性敏感性化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测
5、定法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ngng/ml/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可达，其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。1.41.4免疫测定在临床检验中的应用免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗
6、体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。用范围极广。2 2ELISAELISA的类型的类型 ELISA ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：方法中有三个必要的试剂：（1 1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即 免疫吸附剂免疫吸附剂 （immunosorbentimmunosorbent）；（2 2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为 结合物结合物 （conjugateconjugate）；（3 3）酶反应的底物。）酶
7、反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。 直接ELISA酶标抗原直接间接ELISA双抗夹心ELISA双抗体夹心法测抗原原理双抗体夹心法测抗原原理用抗体包被固相载体加入抗原Sample(二价以上)，温育加入酶标抗体，温育加入底物，显色终止反应，底物显色深浅与待检抗原量成正比终止反应，底物显色深浅与待检抗原量成正比。利用已知浓度的抗原制成标准品，稀释为梯度浓利用已知浓度的抗原制成标准品，稀释为梯度浓度，对其最终度，对其最终OD值与浓度作标准曲线，那么样值与浓度作标准曲线，那么样品的浓度可以根据最终的品的浓度可以根据最终的OD值在标准曲线上查值在标准曲线上查出。
8、出。双抗原夹心法测抗体原理双抗原夹心法测抗体原理双抗原夹心法测抗体原理与双抗体夹心法测抗原原理类似，双抗原夹心法测抗体原理与双抗体夹心法测抗原原理类似，不同的是包被固相载体用的是抗原，与待检样品结合的是不同的是包被固相载体用的是抗原，与待检样品结合的是酶标抗原。酶标抗原。Ag酶标抗原待检抗体待检抗体固相载体竞争法竞争法ELISA原理原理竞争法竞争法ELISA可以检测抗原或可以检测抗原或小分子半抗原小分子半抗原、抗体。以测抗体为例，使、抗体。以测抗体为例，使待测抗体和酶标抗体竞争与固相抗原结合，结果如待测抗体含量越多，待测抗体和酶标抗体竞争与固相抗原结合，结果如待测抗体含量越多，与固相抗原结合的
9、酶标抗体就越少，显色越浅，与固相抗原结合的酶标抗体就越少，显色越浅，二者呈负相关。二者呈负相关。待测抗体待测抗体酶标抗体酶标抗体竞争法竞争法ELISA原理原理竞争法竞争法ELISA可以有两种作标准曲线方式可以有两种作标准曲线方式: 1、结合率、结合率lg(浓度浓度)；2、OD浓度浓度2.2.12.2.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于，就可用于包被固相载体包被固相载体和制备和
10、制备酶结合物酶结合物而建立此法而建立此法。2.2.2 2.2.2 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg的检测常采用的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。构的不同，寻找合适的标记方法。2.2.3 2.2.3 间接法测抗体间接法测抗体 传染病的诊断。
11、间接法的优点是只要变换包被抗原就可传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用利用同一酶标抗抗体同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。建立检测相应抗体的方法。2.2.4 2.2.4 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。 2.2.5 2.2.5 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用，因此不能用双抗体夹心法进
12、行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等小分子激素、药物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。2.2.6 2.2.6 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体IgMIgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgMIgM抗体包被抗体包被固相，以捕获血清标本中的固相，以捕获血清标本中的IgMIgM（其
13、中包括针对抗原的（其中包括针对抗原的特异性特异性IgMIgM抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgMIgM）。）。此法常用于病毒此法常用于病毒性感染的早期诊断。性感染的早期诊断。2.2.7 ABS-ELISA2.2.7 ABS-ELISA法法 ：固相支持物固相支持物；：样品；：样品；：特异性：特异性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）；）；：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB显色液；显色液；：显色；：显色；3. ELISA3. ELISA的试剂的试剂(A(A
14、、B B、C C三部分三部分) )ELISAELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。酶的底物。（1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）酶反应终止液）酶反应终止液ELISAELISA的试剂准备的试剂准备A A
15、 固相载体固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。高，但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底孔底透明度高透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间间性能相近性能相近。3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 将抗原或抗体
16、固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。 蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团疏水基团，故更易吸，故更易吸附到固相载体表面。附到固相载体表面。不易
17、吸附不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNADNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。物质的定量测定。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂
18、（例如乙醇）中溶解后加入乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽是抗原决定簇的氨
19、基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。3.1.4 3.1.4 包被用抗体包被用抗体IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在FcFc段上，抗体段上，抗体结合点暴露于外。结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液. .须除去杂抗体后须除
20、去杂抗体后才能用于才能用于ELISAELISA，以保证试验的特异性。，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。混合包被，可取得更好的效果。3.1.5 3.1.5 包被的条件包被的条件pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液pH7-8pH7-8的的TrisTris-HCL-HCL缓冲液。缓冲液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放
21、置过夜，冰箱中放置过夜，3737中中保温保温2 2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。3.1.6 3.1.6 封闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排
22、斥充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质后的步骤中干扰物质的再吸附。的再吸附。常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶; ;脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉，可以高浓度使用（比较价廉，可以高浓度使用（5%5%）。）。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封闭？固相均需封闭？3.4 3.4 洗涤液洗涤液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀释液为含中，常用的稀释液为含0.05%0.05%吐温吐温2020磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液。ELISA的试剂准备的试剂准备B 3.
23、2 3.2 结合物结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是即酶标记的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关键的试中关键的试剂剂 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗体（或抗原）的免疫活性抗体（或抗原）的免疫活性 3 3含有或少含有游离的抗体（或抗原）含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4 4结合物尚要有良好的稳定性。结合物尚要有良好的稳定性。3.2.1 3.2.1 结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的制备结合物时所用纯度较高的IgGIgG，以免在与酶联结，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全
24、部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISAELISA中用酶标抗中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。3.2.23.2.2酶酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低
25、廉，有色产物易于测定等。存，价格低廉，有色产物易于测定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷半乳糖苷酶和脲酶等。酶和脲酶等。HRPHRP是一种糖蛋白，含糖量约为是一种糖蛋白，含糖量约为18%18%，分子量为，分子量为4400044000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。）结合而成，是一种卟啉蛋白质。3.2.3 3.2.3 结合物的制备结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛
26、交联法和过碘酸盐氧化法。碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-60%-70%70%）和重复性好。）和重复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。（2 2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRPHRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋
27、白质上的分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成氨基形成chiffchiff氏碱而结合。简便有效氏碱而结合。简便有效. . 结合物中混有的游离酶一般不影响结合物中混有的游离酶一般不影响ELISAELISA中最后的酶活中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个
28、低的本底，并获得测定的最佳灵一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。3.2.43.2.4结合物的保存结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRPHRP结合结合物加硫柳泵，物加硫柳泵，A
29、PAP结合物可加叠氮钠）。结合物可加叠氮钠）。3.2.5 3.2.5 结合物的稀释液结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%0.1%牛血清白蛋牛血清白蛋白，白， 0.05%0.05%吐温吐温20 20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在成工作液，使用时不需再行稀释，在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个月。个月。试剂准备试剂准备 C 酶的底物酶的底物3.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3
30、.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结结合物最常用的底物。合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2为供氧体，为供氧体， H2O2为受氢体。为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS
31、。ETMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMBTMB性质较稳定，可配成性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与溶液试剂，只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用液。酶反应终止溶液混和即成应用液。酶反应终止后，后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如虽不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值极低，也为一些试敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。剂盒所采用。HRPHRP对氢受体的专一性很高，仅作用于对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2H
32、2O2、小分醇的过、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 APAP的底物为磷酸酯酶，一般采用对的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm405nm波波长处有吸收峰。用长处有吸收峰。用NaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳终止酶反应后，黄色可稳定一时间。定一时间。APAP也有发荧光底物（磷酸也有发荧光底物（磷酸4-4-甲基伞酮甲基伞酮），可用于），可用于ELISAELISA作荧光测定，敏感度较高于用作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的
33、比色法。显色底物的比色法。3.5 3.5 酶反应终止液酶反应终止液常用的常用的HRPHRP反应终止液为硫酸，其浓反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板度按加量及比色液的最终体积而异，在板式式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。4 4 对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative control)(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。也作为判断结果的对照。阳性对
34、照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。标本物质的量。参考标准品参考标准品 定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的围的4-54-5个浓度，一般均配入含蛋白保护
35、剂及防腐剂的个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中缓冲液中. .阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAgHBsAg检检测的阴性对照品中不可含测的阴性对照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。5 5 标本的采取和保存标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。体或抗原成份。以血清标本为例：血浆中除尚含有以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原纤维蛋白原和和抗凝剂抗凝剂外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。外
36、，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以化物酶活性的物质，以HRPHRP为标记的为标记的ELISAELISA测定中，可能测定中，可能会增加非特异性显色。会增加非特异性显色。加样加样: : 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，加酶次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气
37、泡。产生气泡。基本操作注意事项基本操作注意事项保温保温抗原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么上发生。为什么ELISAELISA反应总是需要一定时间的温育？反应总是需要一定时间的温育？温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度（冰箱温度）等。）等。3737是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。原抗
38、体结合的合适温度。保温方式：保温方式：ELISAELISA仪器附有特制的电热块，水浴。仪器附有特制的电热块，水浴。若用保温箱：若用保温箱：ELISAELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将，最后将ELISAELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指围内，标准室温温度是指20-2520-25，但具体操作时可根，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育
39、。应注意温育的温度和时间应据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。不宜多于两块板同时测定。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。实验的成败。ELSIAELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋
40、白质的吸附是普遍性的，而在洗聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有，手工操作有流水冲洗式和流水冲洗式和浸泡式两种：浸泡式两种：（1 1）流水冲洗式）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也，洗涤液为蒸
41、馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗非离子型洗涤剂涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏疏水性水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。，使蛋白质回复到水溶液状态，从而
42、脱离固相载体。显色显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMBTMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。
43、适当时间阅读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至顶峰，随即逐渐减弱，至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退至无色。比色比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用
44、空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。后进行计算。结果以光密度（结果以光密度（oplicaloplical density density，ODOD），现按规定用吸光），现按规定用吸光度（度（absorbenceabsorbence，A A），两者含义相同。通常的表示方法是），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于，将吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波长为的吸收波长为492nm492nm，表示方法为，表示方法为AA492492nmnm或或ODOD492492nmn
45、m。酶标比色仪酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISAELISA光度计。针对固光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到仪的读数一般可精确到0.0010.001，准确性为，准确性为1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%。操作时室温宜在操作时室温宜在15-30
46、15-30，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器15-3015-30分钟，分钟，测读结果更稳定。测读测读结果更稳定。测读A A值时，要选用产物的敏感吸收峰，值时，要选用产物的敏感吸收峰，如如OPDOPD用用492nm492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。波长。有的酶标仪可用双波长式测读。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。6 6 结果判断结果判断 6.1 6.1 定性测定定性测定定性测定的结果判断作出定性测定的结果判断作出“有有”或或“无无”的回答，分别用的回答，分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一
47、表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法在间接法和夹心法ELSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法争法ELISAELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。
48、结果判断方法不同，分述于下。A.A.阳性判定值：阳性判定值： （cut-off valuecut-off value）一般为阴性对照一般为阴性对照A A值加上一个特定的常数值加上一个特定的常数(0.05)(0.05)，以此作为判断结果，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。阳性或阴性的标准。B.B.标本标本/ /阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（标本（S S）和阴性对照（）和阴性对照（N N）的）的A A值后，计算值后，计算S/NS/N值。值。间接法和夹心法间
49、接法和夹心法（2 2）竞争法）竞争法因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出一般均用比色计测定，读出S S、P P和和N N的吸光值。的吸光值。a. a. 阳性判定值法阳性判定值法 阴性判定值阴性判定值=0.4=0.4NCX+0.6NCX+0.6PCXPCX 阳性阳性 AA阳性判定值阳性判定值 阴性阴性 A A阳性判定值阳性判定值 b. b. 抑制率法抑制率法 抑制率（抑制率（% %）= = （阴性对照（阴性对照A A值值- -标本标本A A值）值）100%/100%/阴性阴性对照对照 阳性阳性 抑制率抑制率50%50
50、%为为 阴性阴性 50%50%4.7.2 4.7.2 定量测定定量测定ELSIAELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法测定大分子量物质的夹心法ELISAELISA，标准曲线的范围一，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S
