1、原代细胞培养的原代细胞培养的实验目的和要求实验目的和要求冷消化冷消化温消化温消化一次性消化一次性消化分次消化分次消化 贴块法贴块法消化法消化法原代培养方法分类原代培养方法分类分次消化分次消化 消化法的分类消化法的分类外植块培养步骤图解外植块培养步骤图解悬液细胞的传代培养悬液细胞的传代培养1.3 1.3 人体活检人体活检( (或手术或手术) )材料材料人体活检人体活检( (或手术或手术) )材料材料需要注意的事项需要注意的事项注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液台盼蓝排除检测法台盼蓝排除检测法活体染色与细胞计数活体染色与
2、细胞计数l 3 3) )绘制曲线绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞密度以培养时间为横坐标、细胞密度 为纵坐标，将全部结为纵坐标，将全部结果在坐标纸果在坐标纸 上绘图，即得所培养细胞的生长上绘图，即得所培养细胞的生长 曲线。曲线。四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法100 L单细胞悬液接种于96孔板(5104)。37 、5CO2培养箱中培养一段时间加入2 mg/ml的MTT液（50 L/孔）；继续培养3 h。 吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150 L/孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10 min，使结晶物溶解。 酶标仪检测各孔OD值（检
3、测波长570 nm）。记录结果。高浓度血清可影响光吸收值，在加入异丙醇溶液或DMSO前尽量吸净培养液。吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷。正常细胞系正常细胞系癌细胞系癌细胞系转化细胞系转化细胞系细胞克隆细胞克隆正常细胞系建立的程序：正常细胞系建立的程序：原代培养原代培养第一次传代第一次传代常规传代常规传代冻存和复苏冻存和复苏癌癌细胞系建立的程序：细胞系建立的程序：步骤类似正常细胞系建立步骤类似正常细胞系
4、建立注意：注意：取转移灶组织癌细胞、癌最外层组织取转移灶组织癌细胞、癌最外层组织去除癌组织中的间质细胞去除癌组织中的间质细胞-胶原酶法胶原酶法细胞系的维持细胞系的维持细胞系档案要记录好：细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代时间等；组织来源、培养基要求、传代时间等；传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。鉴定细胞系的内容鉴定细胞系的内容培养物的常用固定方法染色方法干涉显微镜扫描隧道显微镜原子力显微镜视频显微镜共聚焦显微镜
