1、血常规检查与镜检 温州医学院附属第二医院 李向阳 Page 2 今日议题 ? 血常规检查的内容 ? 血球分析仪的发展历程 ? 镜检的意义 ? 血球分析仪存在的问题及解决方案 Page 3 血常规检查的内容 ? 血红蛋白测定 ? 各种细胞计数及比例 ? 各种细胞的形态学变化 ? 血液中其它物质和生物体 Page 4 各种细胞的形态学 Page 5 各种细胞的形态学 Page 6 Page 7 各种细胞的形态学 Page 8 Page 9 Page 10 Page 11 Page 12 Page 13 Page 14 Page 15 血球计数仪的发展史 ?590 年荷兰人米德尔堡和詹森设计制造了最
2、原始的显微镜 ?1610年伽利略使用望远镜观察小的物体并将其放大，后来被列文霍克改进成为原始的显微镜。 ?1658 年意大利人马尔皮基应用最原始的显微镜首先观察到了红细胞，他是第一个见到红细胞的人 ?开始进行红细胞计数则是 200 年后的事情了 ?而设计并生产出第一台血细胞计数仪则又过了近100 年。 Page 16 ?1852 年就有人开始设计对红细胞的计数办法 ?1855 年发明了用于计数血细胞的计数板 ? 目前仍然使用的改良 Neubauer 计数板就是应用最为广泛和持续时间最为长久的经典一种，仍然是最为可靠和最为经典的计数技术 ?它不仅适用于血细胞计数，还可用于其他细胞、动物血细胞、微
3、小粒子及需要在显微镜下计数的各种样品。 Page 17 ? 直到Paul Ehrlich通过用苯胺染料(aniline dyes)对血细胞进行染色，可以区分细胞核、细胞浆以及一些完好的细胞结构 ? 把各种不同的白色的细胞（white cells）划分为五种类型，也就是今天仍然沿用的分类标准。 Page 18 ?1912年出生在美国阿肯色州一个小城的人Wallance H. Coulter 发现了微小粒子通过特殊的小孔时可产生电阻变化这一现象，并根据这种电阻变化特点将其应用于微小粒子的粒度测量和计数上。科技界为表彰他的发明，将其称为库尔特原理（Coulterprinciple ）。 ?Coult
4、er 先生将其引入到血液细胞计数上，在 1953年获得美国发明专利 Page 19 细胞分类 仪器将体积为35450fL的血细胞，分为256个通道（channel）。每个通道：1.64fl。根据细胞大小，分别置于不同的通道中，显示血细胞体积分布直方图(Histogram)。 经溶血素处理脱水后，血细胞体积大小发生了变化！ 第一群（3590fl）小细胞区：淋巴细胞（体积最小）。 第二群（90160fl）单个核细胞区，（中间细胞）：单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始、幼稚细胞、异常细胞等。第三群（160fl以上）大细胞区：嗜中性粒细胞（体积最大）。 Page 20 ? 经过半个多世纪的发展
5、，这种仪器已经有了非常明显的进步。以前因为只能进行细胞计数，因此我们一般将这类仪器叫做血细胞计数仪（Blood Cell Counter）,由于技术的进步目前这类仪器可以提供除了血细胞计数以外的更多参数的联合测定和分析，因此我们一般将这类仪器统称为血液细胞分析仪(Hematology Analyzer) 。 ? 光散射法血液分析仪检测原理 组合应用 电学 光学 细胞化学等 Page 21 血细胞分类方法 ? 采用VCS技术进行五分类的仪器 ? 采用采用阻抗、激光散射和荧光染色技术 ? 激光散射和细胞化学染色技术 ? 多角度偏振光散射法应用于白细胞五分类（MAPSS技术） ? 采用图像分析的单纯
6、细胞分类仪 Page 22 VCS技术 ? V代表体积测量法，可有效区分体积大小差异显著的淋巴细胞和单核细胞。 ? C代表高频电导性。细胞核的化学组份可使电流的传导性产生变化，其变化量可以反映出细胞内含物的信息。可区分体积相近而内部性质不同的细胞群体，如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞 ? S代表激光散射测量技术，激光束可穿透细胞，探测细胞内核分叶状况和胞浆中的颗粒情况，以区分出颗粒特性不同的细胞群体。例如细胞内颗粒粗的要比颗粒细的散射光更强，因此可以用于区分粒细胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜碱性三种细胞。 Page 23 阻抗、激光散射和荧光染色技术 ? 白细胞分析 ? DIFF通道： STROMATOLY
7、SER-4DL试剂中的表面活性剂可以溶解掉标本中的红细胞和血小板，并在白细胞膜上打出小孔；然后第二种试剂 TROMATOLYSER-4DS中的聚次甲基染料通过这个小孔进入白细胞中，与细胞核的核酸和细胞器结合，在经过波长633nm的激光照射，产生的荧光强度与细胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER -4DL试剂还具有与嗜酸性颗粒特异性结合的能力，可根据侧向散射光信号强度，将嗜酸性粒细胞从中性粒细胞中分离出来。 ? 前向散射光（FSC）信号可反应细胞体积大小；侧向散射光（SSC）信号可反应细胞的颗粒和细胞核等内含物的信息 ? 在DIFF散射图当中可以得到中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、
8、淋巴细胞等四个分群 Page 24 ? WBC/BASO通道是专用作检测嗜碱性粒细胞的通道 ? STROMATOLYSER FB是一种酸性试剂，可将红细胞和血小板形成淡影化，将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞处理成裸核形态，然后采用前向散射光（FSC）信号和侧向散射光（SSC）信号使嗜碱性粒细胞从其它细胞中分离出来。 Page 25 核酸荧光染色法 ? 幼稚粒细胞分析上有特殊的IMI通道，在IMI检测通道中主要应用射频（RF）技术和直流电阻抗法（DC）。这个测定通道根据幼稚细胞膜表面比成熟细胞膜表面含有脂质少的现象，在稀释液中加入硫化氨基酸（IM试剂），由于占位不同，结合在幼稚细胞表面的氨基酸较多，
9、对溶血剂有抵抗作用，对幼稚细胞具有保护作用。当加入溶血剂后成熟细胞易被溶解掉，而幼稚细胞不易被溶解破坏， ? 用通道-NRBC通道，在处理标本时加入STROMATOLYSERNR专用试剂，它能使成熟红细胞溶解又可保持有核红细胞的核结构，通过检测荧光强度得到：白细胞核大荧光强度高，有核红细胞核小，荧光强度低，正常红细胞无细胞核和破碎，荧光强度极低。 Page 26 激光散射和细胞化学染色技术 ? 在白细胞分类上采用了白细胞过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道。 ? 嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶，中性粒细胞含有较强的过氧化物酶，嗜碱粒细胞不含此酶。单核细胞除早期原始阶段外，均含有较弱的过氧化物
10、酶。淋巴细胞不含过氧化物酶。 ? 根据激光法散射光强度进行的细胞体积的测量同时也获得了细胞大小的信息 ? 在白细胞过氧化物酶散点图上，X 轴表现过氧化物酶强度，过氧化物酶强阳性细胞位于右端；Y轴表现散射光强度信号。 ? 嗜碱细胞则是通过嗜碱细胞和分叶核通道测定的，因淋巴细胞与嗜碱粒细胞都无过氧化物酶 Page 27 多角度偏振光散射法应用于白细胞五分类（MAPSS技术） ? 标本在水动力聚焦系统的作用下进入检测部，在激光束的照射下，细胞在多个角度都产生散射光。仪器特别设置了四个角度来收集散射光的信号。 ? 0度为前角光散射， 用于粗略判断细胞体积大小； ? 10 度为狭角散射， 用于检测细胞结
11、构及其内部复杂性的指标； ? 90度为垂直光散射，用于对细胞内部颗粒及细胞核分叶情况的分析； ? 90 度偏振光散射，基于颗粒可以将垂直角度的激光消偏振的特性，将嗜酸性细胞从中性粒细胞和其他细胞中分离出来。 Page 28 血球分析仪的盲点 ? 红细胞形态 ?RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW ?球形？大or小，哪个多？中心淡染区情况？细胞内有无异常？碎片？ ? 有核细胞 ?除了正常大小，细胞内限定的内含物之外概不知道！ ?各类细胞间有干扰 Page 29 环境温度的干扰 ? 计数时稀释液的温度应为(22土4) ?有些溶血剂在低温时可出现结晶 ?白细胞计数增高 ?易激活血
12、小板，引起血小板凝集，造成血小板计数假性降低 ?刘忠伦等报告 ?1O时血小板计数结果仪器法显著低于手工法，且血小板直方图异常；25 时仪器法计数结果与手工法一致，显示正常的血小板直方图 Page 30 抗凝剂的影响 ? ICSH推荐采用EDTA-K2抗凝的静脉血进行血液细胞分析 ? 血量过多抗凝不充分，会出现凝块；血量过少，会导致抗凝剂过浓，延长血细胞内外K+的平衡时间 Page 31 标本放置时间的影响 ? 静脉全血标本，大部分参数在8 h内没有显著改变 ?平均血小板体积、血小板分布宽度、大血小板比率和血小板压积在2 h内已明显增高 ?标本放置时间过长会导致细胞分层，分层的细胞会产生不同的代
13、谢物，形成微环境 Page 32 生理和病理因素的干扰 ?对新生儿血液进行分析时，使用正常量溶血剂计数白细胞，各项结果与实际有差异 ?常规溶血剂用量不能将红细胞完全破坏 ?当平均红细胞体积小于70 fL时，血小板计数假性升高，这时需用显微镜人工计数才能得到准确的结果 ?黄疸 ?导致血小板计数降低，与胆红素浓度呈负相关，相关系数为-0.9925；当胆红素浓度大于或等于47.2mol/L时，血红蛋白测定受干扰 ?乳糜标本，血红蛋白浓度假性增高，相关系数为0.9991； Page 33 生理和病理因素的干扰 ? 脂血标本 ? 脂血是最常见的干扰因素，干扰所有型号的血液分析仪的HGB、平均红细胞血红蛋
14、白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、WBC、PLT等参数的检测。 ? 脂肪乳液成为临床常用肠外营养和高脂血症患者的增加 Page 34 生理和病理因素的干扰 ? 冷凝集标本 ? 某些疾病的患者(如支原体肺炎等)血液里存在冷凝集素，使血液RBC在离开机体后几分钟内发生聚集。干扰所有型号的血液分析仪的RBC、MCV和MCHC等参数。 ? 在报告单的备注栏注明该标本有冷凝集现象，并提示医生注意 Page 35 生理和病理因素的干扰 ?RBC缗钱状标本 ?某些疾病(如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症等 )的血液标本RBC呈缗钱状排列。干扰所有型号的血液分析仪的RBC、MCV和MCHC等参数
15、。 ?在报告单备注栏注明该标本的 RBC呈缗钱状排列，提示医生注意(该现象对诊断浆细胞系统疾病很有帮助)。 Page 36 生理和病理因素的干扰 ?难溶血或溶血不良(细胞碎片)标本 ?某些疾病，如严重肝病、球形 RBC增多症等。 ?全博等对3O例肝病患者的全血标本用血液分析仪进行了分析，对WBC异常增高的样本进行手工复检，同时用洗涤法与水浴法排除了高球蛋白、纤维蛋白原与冷凝集素的干扰以及用溶血剂破坏 RBC后重新进行试验。结果显示其测定值同手工测定结果一致 ?说明WBC的异常增高与RBC的存在有关 ?由于疾病因素的影响而使红细胞膜抗溶性增强，最终影响WBC的准确计数 Page 37 生理和病理
16、因素的干扰 ? 马晓明等报道3例病例，临床体征均有严重的感染，嗜碱性粒细胞计数均增高 用瑞氏染色法进行人工复片发现中性粒细胞呈中毒性改变，粒细胞中出现了大量的中毒颗粒、形似嗜碱性颗粒，同时细胞核分叶减少固缩，染色质呈块状，核浆比例改变，影响了血细胞分析仪的判读，最终造成了嗜碱性粒细胞假性升高的结果。 Page 38 生理和病理因素的干扰 ? 溶血标本 ? 某些伤害(如毒蛇咬伤后)诱发的弥散性血管内溶血(DIC)，或采血不顺利等因素可引起标本溶血。干扰所有型号的血液分析仪RBC、MCV和MCHC等参数。 Page 39 生理和病理因素的干扰 ? 小RBC ?由于方法学的问题，某些贫血(如缺铁性贫
17、血、地中海贫血等)患者的小RBC对KX-21、K4500和XS-1000i等仪器测定PLT数量时有明显干扰，使PLT假性增高。 Page 40 生理和病理因素的干扰 ? 巨大PLT ? 如PLT增多症、慢性粒细胞白血病等血液系统疾病患者血液中可能出现与WBC大小样的巨大PLT，其干扰所有型号的血液分析仪的WBC参数。 Page 41 生理和病理因素的干扰 ? PLT聚集 ? 采血不顺利或部分患者高凝状态。干扰所有型号血液分析仪的PLT参数。 ? PLT卫星现象 ? PLT聚集在中性粒细胞周围的现象，称为卫星现象，出现这种现象公认的原因，是在当血液与EDTA抗凝剂接触的15min内可能出现。但有
18、少数患者的标本，采集2h后仍存在此现象，干扰所有型号的血液分析仪的PLT参数。 Page 42 生理和病理因素的干扰 ? 有核红细胞(NRBC) ?在某些病理情况下外周血出现NRBC，干扰所有型号血液分析仪的WBC参数。 ? 高WBC ?某些疾病(如白血病)引起WBC异常增高。干扰所有型号血液分析仪的RBC参数。 Page 43 生理和病理因素的干扰 ? 豪-周(Howell-Jollys，HJ)小体 ?见于巨幼RBC贫血和溶血性贫血、脾切除等，为RBC内存在的染色质小体，干扰XE-2100血液分析仪的RET参数。 ? 疟原虫 ?寄生在RBC内的疟原虫使RET计数假性增高 。干扰XE-2100
19、血液分析仪的RET参数。 Page 44 生理和病理因素的干扰 ? 敖凌云等报道，血细胞仪分析标本结果显示，白细胞直方图在5O fL以下出现异常峰，红细胞提示怀疑有核红细胞存在，血小板提示怀疑血小板聚集。 ? 在排除其他干扰因素后，经涂片染色，油镜下检查发现间日疟原虫。 Page 45 生理和病理因素的干扰 ? 念珠菌孢子 ? 念珠菌菌血症患者血液里的真菌孢子可对所有型号的仪器的WBC、PLT干扰 ? 院内真菌感染的发病率不断递增 Page 46 小结 ? 自动化血液分析仪是以正常细胞为模板，建立起来的分析系统，对异常形态的细胞识别能力有限 ? 血液中的各种细胞间有相互干扰 ? 仪器的重复性可
20、能很好，但有可能是“假”的 ? 各种生理和病理情况均会对仪器的分析产生干扰作用 Page 47 镜检的意义 ? 是血常规检查中不可或缺的内容 ? 是目前任何仪器均无法替代的操作 ? 某些形态学的改变和发现是临床诊断的有力证据 ? 是对仪器分析结果的校正，是最后的确认手段 48 血分析仪结果真的可以直接报告吗？ 这些能分辨吗？ 医疗机构临床实验室管理办法认为以下情况均需镜检： 血液分析仪检测结果出现异常计数、警示标志、异常散点图等情况 这些颗粒能分辨 Page 49 镜检的意义 ? 以患者为中心 ? 降低医疗风险 ? 全局观念 ?尽快使患者得到有效治疗，解除病痛 ?缩短平均住院日，加快病床周转，
21、接纳更多的患者 ?增加收入 Page 50 镜检的范围 51 国际41条的内容： 15条规则关于血细胞计数 7条规则关于5种白细胞的分类参数 7条规则关于仪器可疑图象或者代码 （包括红细胞和血小板） 10条规则关于白细胞可疑图象或者代码 2条规则关于网织红细胞 需要各实验室自己制定和调整 面对不同的病人群体可能有不同的标准 国际41条？国内23条？27条？ 有什么差别？哪个适合我们科室？ 筛选规则的选择与运用 ? 国际血液学联合小组复检筛查 41条规则 ? 国内血液协作组Sysmex初检规则 27条初检规则（复检23） ? 贝克曼库尔特血分析仪的规则 23条分片规则 v浙江省临检中心的分片规则 v 06年4月征求意见19条规则 对速度的要求 3.血、尿、便常规检验、心电图、影像常规检查项目自检查开始到出具结果时间30分钟 仪器速度、人力技术与报告速度的矛盾仪器速度、人力技术与报告速度的矛盾 临床实验室管理办法 血液分析检测中的两大关注点 QC 速度 质量 Page 54 解决方案：全自动推片机导入 ? 具有无比的优越性 ? 推片质量 ? 染色效果 ? 速度 Page 55
